犬细小病毒病诊断技术

犬细小病毒病诊断技术

国家标准 GB/T27533一2011 犬细小病毒病诊断技术 Diagnostictechniquesforcanineparovirsdisease 2011-11-21发布 2012-03-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T27533一2011 前 言 本标准的附录A和附录B为资料性附录 本标准由农业部提出 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/Tc181)归口 本标准起草单位;青岛农业大学动物科技学院、上海出人境检验检疫局 本标准主要起草人;单虎、温建新、熊炜、黄娟,秦晓冰、于鹏程
GB/T27533?2011 ??С? Χ ?涨??С?,??,PCR? ???С?в?顢,???в??? ,PCR??С??? ?? 2.1FK81?(è? 2.20.9%?;?μ?AA.1 2.31%??;?μ?AA.2 2.4??С?塣 2.596?v?? 2.6Taq?10Taq???;:Taq???5U/aL,-20C档 2.7I.5mlEppendorf 2.80.2mlL.rPCR?? 2.9dNTP:dCTP,dGTP,dATPdTTP101 mmol/L,?20?档 2.10;??20mol/L, (CPVF):5'GAATCTGCTACTCAGCCACCAAC3' (CPVR):5'GTGCACTATAACCAACCTCAGC3' 2.1110%???μ?A 2.12?K?;?μ?AA.4 2.135TBE??;?μ?AA.6 ?豸 3.1PCR? 3.2????;?4C???12000g? 3.3???? ?? ? ? 4.1.1?1?2,κ??,???40C,???? 4.1. ???,??????,?к,?,??к ?,??д?????,?ζ 4.1.3??,?,?,,Χ,?,?,?? 4.2仯 4. .2.1????,?,?,?г??? 4.2.2?,?,???,?о?,ж? 4.2.3θ,??,д?;С,?,??,γ??,
GB/T27533一2011 于剥落,肠腔内充满紫红色粥样内容物并混有血凝块 4.3判定 若临床症状符合4.1.1或4.1.2且出现4.2.1或4.2.3的病理变化,则可判定疑似犬细小病毒病， 其他临床症状和病理变化可作为参考指标;疑似病例可采用血凝与血凝抑制试验或PCR检测进行 确诊 血凝与血凝抑制试验 5.1血凝试验(HA)的操作方法 样品采集活犬的泪液、鼻液、唾液,粪便,病死犬的肝、脾、肺等组织器官 将待检组织或粪便样 品加等体积生理盐水研磨匀浆.300离心15mn,收集上清液待检;口腔拭子,粪拭子用少量生理盐 水浸润后,取上清液待检 5.1.2在96孔“v”形微量反应板上进行,自左至右各孔加100AL生理盐水 于左侧第l 孔加50L待检样晶于1.5mL.Bpenador管,混合均匀后,吸50AL至第2孔,混 合均匀后,吸50L至第3孔依次倍比稀释,至第1孔,吸弃50AL稀释后病毒稀释度为第1孔 ;2,第2孔1:4,第3孔1:8最后12孔为对照 由左至右依次向各孔加1%猪红细胞悬液50al置微型混合器上振荡,使血球与病毒充分混 合,在37C温箱中作用15min30min后,待对照红细胞已沉淀可观察结果 5.1.5判定结果;以100%凝集(血球呈颗粒性伞状凝集沉于孔底)的病毒最大稀释孔为该病毒血凝 价,即一个凝集单位,不凝集者红细胞沉于孔底呈点状 血凝抑制试验(H)的操作方法 5.2.1根据HA试验结果,确定病毒的血凝价,配成4个血凝单位病毒溶液 5.2.2 在96孔“”形微量板上进行,用固定病毒稀释血清法,自第1孔至第10孔各加50aL生理盐 水,11和12孔分别为4单位CPV细胞病毒培养液和抗犬细小病毒阳性血清对照 2. 第1孔加犬细小病毒阳性血清50AL,混合均匀,吸50L至第1孔,依此倍比稀释至第10孔 5. 3 吸弃50l,如此稀释后血清浓度为第1孔1:2,第2孔1:4,第3孔1:8 5.2.4由第1孔至11孔各加50l,4单位待测病毒液,第12孔50AL 血清,混合均匀,置37C温箱 再作用15min一30min,待4单位病毒已凝集红细胞可观察结果 5.2.5判定结果;被已知犬细小病毒阳性血清抑制血凝者,该病毒为犬细小病毒 PCR检测 病料的采集及处理 6. 采集的样品包括犬的泪液、鼻液,唾液,粪便及病死犬的肝,脾,肺等组织器官 将待检组织或粪便 样品加等体积生理盐水研磨匀浆,3000g离心15min,收集上清液待检 口腔拭子,粪拭子用少量生理 盐水浸润后,取上清液待检 经细胞病原分离培养的样品,收集细胞沉淀待检 CPV阳性对照样品和 阴性对照样品的同样处理 DNA抽提 6 取上清液465AL,加人25L10%十二烧基硫酸钠和10L的20mg/mL蛋白酶K,50C水浴摇 床上放置2h;加人等量的饱和酚溶液500AL,振荡混匀20s,12000g离心5min,取上清液;加人等量 的酚:三氧甲烧:异戊醇(25:24:1),振荡混匀20s,1200og离心5min,取上清液;再加人等量的三 氧甲婉:异戊醉(24:1),振荡混匀20s,12000离心5 min， ,取上清液;最后加人两倍体积的无水乙 醇，上下颠倒混匀,12000g离心10min,弃上清,室温干燥后,加人504L双蒸水溶解沉淀,即得DNA 模板，-20C贮存备用 CPV阳性对照样品和阴性对照样品与待检样品同步进行样品处理,并进行 DNA抽提 另外,DNA抽提也可采用市售的商品化DNA抽提试剂盒进行
GB/T27533一2011 6.3PCR检测 在0.2mLPCR薄壁管中,按每个样品10倍Taq酶浓缩缓冲液2.5AL,dNTP0.5AlL、Taq酶 0.5AL,DNA模板2l、上游引物和下游引物(CPVF,CPVR)各0.5Al、三蒸水18.5L,配制PCR检 测体系 将PCR管置PCR仪上按如下程序扩增;首先94C变性2min;再94C、30s,55C,30. 72C、40s进行35个循环;最后72C、3min 用TBE电泳缓冲液配制1.5%的琼脂糖平板含 0.5g/mLEB),参见附录A中A.7,将平板放人水平电泳仪,使电泳缓冲液刚好没过胶面,将10" PCR产物和2L加样缓冲液(6X)，参见附录A中A.8，混匀后加人样品孔 在电泳时设立DNA标 准分子量作对照 5V/cm电泳约301 min,当溴酚蓝到达底部时停止,用凝胶成像系统观察结果 结果判定 经PCR检测,CPV阳性对照样品可扩增出大小为609bp的核酸片段,参见附录B,且阴性对照 样品无扩增条带,否则试验结果视为无效 6.4.2在符合6..1的条件下,若待检样品扩增出了大小为609p的核酸片段,则初步判定犬细小病 毒核酸阳性;若待检样品无扩增条带或扩增条带大小不为609bp,则判定犬细小病毒核酸阴性 待检样品扩增出的阳性基因片段应进行核酸序列测定,若其序列与提供的比对序列的同源性大 6.4.3 于等于90%,则可确诊为犬细小病毒核酸阳性,否则判定犬细小病毒核酸阴性 6.4.4若犬细小病毒核酸阳性且病原分离也呈阳性,则可判定犬细小病毒感染阳性
GB/27533一2011 附 录A 资料性附录 试剂及其配制 A.10.9"%生理盐水 称取9g无水氯化钠溶于1000mL去离子水中配成0.9%生理盐水.121.3C灭菌15min A.21%猪红细胞液 1mL新鲜肝素抗凝猪血加人9ml.灭菌生理盐水制备而成 制备好后最好立即使用 暂时不用 可放置4C冰箱保存 A.3CP细胞培养液 CPV接种FK81细胞,培养3d5d,当病变达60%~80%时收获 冻融三次或超声波处理后,低 速离心去除细胞碎片,上清液分装后低温保存 10%十二完基硫酸钠(SDs) A4 在90ml 三蒸水中溶解10g十二烧基硫酸钠(电泳级),加热至60C助溶,用盐酸调pH值至7.8. 加三蒸水定容至100mL A.5蛋白酶K贮备液(20m/mb 每升三蒸水中加人三羚甲基氨基甲烧(Tris)1.21mg,乙二胺四乙酸(EDTA)1.86mg,十二婉基硫 酸钠(SDS)5g,用盐酸调pH值至7.8 取该溶液按每毫升加人20mg蛋白酶K,充分溶解后分装 A.6 5xTE电冰缓冲液 每升三蒸水中加人三痉甲基氨基甲婉(Tris)54.0g乙二胺四乙酸(EDTA)2.9mg,棚酸27.5 g" 用5mol/儿的盐酸调pH值至8.0. EB核酸染色剂 在10ml三蒸水中加人100mg澳化乙锭(EB)配制成10mg/mL的浓缩液 A.8加样缓冲液(6×) 三蒸水中加人澳酚蓝0.25尽和蔗糖40g 每100mlL
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犬细小病毒病诊断技术GB/T27533-2011

什么是犬细小病毒病？

犬细小病毒病，又称为犬瘟热，是由犬细小病毒引起的高传染性疾病。该病毒主要通过直接接触、呼吸道飞沫传播等途径进行传播。当犬感染犬细小病毒后，会出现严重的呼吸系统症状、消化系统症状和神经系统症状，严重时可导致死亡。

犬细小病毒病的诊断方法

目前，犬细小病毒病的诊断方法主要分为临床症状检测和实验室检测两种方法。

临床症状检测

犬细小病毒感染后，患犬会出现一系列的临床症状，如发热、鼻流涕、咳嗽、呼吸急促、腹泻等。通过观察和分析这些临床症状，可以对犬细小病毒病进行初步的诊断。

实验室检测

实验室检测是目前确诊犬细小病毒病最可靠的方法之一。常见的实验室检测方法包括血清学检测、PCR检测和病毒分离检测。

血清学检测

血清学检测主要是通过检测犬体内抗体水平的变化来诊断犬细小病毒病。目前常用的血清学检测方法有病毒中和试验、酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫荧光试验（IFA）等。

PCR检测

PCR（聚合酶链式反应）检测是一种通过扩增病毒基因组中的特定片段来诊断犬细小病毒病的方法。PCR技术具有高灵敏度和高特异性的优点。

病毒分离检测

病毒分离检测是将犬体内的病毒分离出来并进行鉴定，以确定是否感染了犬细小病毒。该方法需要耗费较多的时间和精力，并且对实验室条件要求较高。

总结

犬细小病毒病是一种需要引起重视的疾病，及时诊断和治疗十分重要。临床症状检测和实验室检测是当前常用的诊断方法，其中实验室检测具有高度的准确性和可靠性。在诊断过程中，应该综合运用不同的方法，并结合临床实际情况进行诊断。同时，在预防犬细小病毒病方面，加强对犬只的管理和疫苗接种，避免病毒传播，是非常重要的措施。

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