GB/T14701-2019
饲料中维生素B2的测定
DeterminationofvitaminB2infeeds
- 中国标准分类号（CCS）B46
- 国际标准分类号（ICS）65.120
- 实施日期2020-01-01
- 文件格式PDF
- 文本页数9页
- 文件大小662.75KB
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饲料中维生素B2的测定
国家标准 GB/T14701一2019 代替GB/T147012002 饲料中维生素B的测定 DeterminationofvitaminBinfeeds 2019-06-04发布 2020-01-01实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/14701一2019 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草
本标准代替GB/T14701一2002《饲料中维生素B的测定》. 本标准与GB/T14701一2002相比,主要技术内容修改如下: 修改了方法1、方法2适用范围以及检出限,定量限(见第1章,2002年版的第1章) -规定了不同饲料类型的仲裁法(见第1章,2002年版的第1章) -修改了样品的粉碎粒度(见第3章,2002年版的第3章); 补充了维生素B
紫外检测色谱条件下和荧光检测色谱条件下的标准色谐图(见附录A图A.l 和图A.2
本标准由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC76)提出并归口
本标准起草单位;农业科学院农业质量标准与检测技术研究所[国家饲料质量监督检验中心 北京)]
本标准主要起草人李兰、索德成、魏书林 本标准所代替标准的历次版本发布情况为 GB/T14701一1993.,GB/T147012002
GB/14701一2019 饲料中维生素B的测定 范围 本标准规定了饲料中维生素B即核黄素CHN)测定的荧光分光光度法和高效液相色谱法
本标准方法1适用于动物性和植物性饲料原料、配合饲料、浓缩饲料中维生素B的测定,定量限为 0.25mg/" 'kg 本标准方法2适用于维生素预混合饲料、复合预混合饲料、浓缩饲料中维生素B的测定,以荧光检 测器检测时,定量限为5mg/kg;以紫外检测器检测时,定量限为10mg/kg
浓缩饲料中维生素B的测定,方法1为伸裁法;维生素预混合饲料,添加剂预混合饲料中维生素 B的测定,方法2中的高效液相色谱荧光检测器方法为仲裁法
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GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14699.1饲料采样 GB/T20195动物饲料试样的制备 " 方法1荧光分光光度法 3.1原理 维生素B(核黄素)在440nm紫外光激发下产生绿色荧光,在一定浓度范围内其荧光强度与核黄 素含量成正比
用连二亚硫酸钠还原核黄素成无荧光物质.由还原前后荧光强度之差与荧光强度的比 值计算样品中维生素B的含量
3.2试剂或溶液 除非另有说明,所用试剂均为分析纯试剂,水为燕憎水,符合GB/T6682中三级用水或相当纯度 的水 3.2.1氢氧化钠溶液;0.05mol/L
3.2.2氢氧化钠溶液:1.0mol/L
3.2.3盐酸溶液;0.1mol/L
3.2.4盐酸溶液l.0molL 3.2.5 连 二亚硫酸钠(NaS.O). 3.2.6高锰酸钾溶液;40g/L 3.2.7冰乙酸 3.2.8冰乙酸溶液,0.02mol/儿L;将1.8ml冰乙酸用水稀释至1000ml 3.2.9过氧化氢溶液,l00mL/L,分析当天制备
3.2.10维生素B标准溶液
GB/T14701一2019 3.2.10.1维生素B贮备液I;称取在五氧化二磷干燥器里干燥24h的维生素B标准品(纯度大于 95%)25mg(精确至0,.0001g)于250mL棕色锥形瓶中,加人约200mL.冰乙酸溶液(3.2.8),在沸水浴 中煮沸直至溶解,冷却后转移至250m棕色容量瓶中,用冰乙酸溶液(3.2.8)稀释至刻度
滴加甲苯覆 盖,2C8C冰箱保存,保存期6个月
该溶液含0.1mg/mL维生素B
3.2.10.2维生素B贮备液I;取维生素B，贮备液I3.2.10.1)10ml.用冰乙酸溶液(3.2.8)稀释至 /mL 00mL,置于棕色容量瓶中滴加甲苯覆盖,2C8C冰箱保存,保存期3个月
该溶液中含10g/ 维生素B
3.2.10.3维生素B标准工作液;取维生素B贮备液l(3,2.10.2)10ml,用水稀释至100ml,分析前 制备
该溶液中含1"g/ml维生素B 3.2.11荧光素标准溶液 3.2.11.1荧光素贮备液;称取荧光素0,050g,用水稀释至1000ml,置于棕色瓶中2C8C冰箱保 存
该溶液中含504g/mL荧光素
3.2.11.2荧光素标准工作液;取1ml荧光素贮备液(3.2.ll.l),用水定容至1000ml,置于棕色瓶中 2C8冰箱保存
该溶液中含0.05 5g/mL荧光素 3.2.12澳甲酚绿pH指示剂 取祺甲酚绿0.1g,加氢氧化钠溶液(3.2.1)2.8nml溶解,再加水稀释至200mL
变色范围 pH3.65.2
3.3仪器设备 3.3.1分析天平;感量0.0001g
3.3.2电热恒温水浴 3.3.3具塞玻璃刻度试管;15ml
3.3.4荧光分光光度计
3.4试样制备 按GB/T14699.1的规定,选取具有代表性的样品至少500g,用四分法缩减至100g;按 GB/T20195的规定制备样品,磨碎,通过0.425mm孔筛,混匀,装人密闭容器中,避光低温保存备用
3.5试验步骤 以下操作应避免强光照射
3.5.1试样溶液的制备 称取饲料原料、配合饲料、浓缩饲料1g一2g(精确至0.001g)置于100mL棕色具塞锥形瓶中
加 人65mL盐酸溶液(3.2.3),于沸水浴中煮沸30min
在加热开始时,每隔5min10min摇动锥形瓶 一次,以防试样结块
冷却至室温后,用氢氧化钠溶液(3.2.2)调节pH值至6.06.5,立即加盐酸溶液 3.2.4)使pH值调至4.5(澳甲酚绿指示剂变为草绿色)
转移至100ml棕色容量瓶中,用水稀释至刻 度
通过中速无灰滤纸过滤,弃去最初5ml10ml.溶液,收集滤液于100mL棕色锥形瓶中
取整 份清液,滴加稀盐酸检查蛋白质,如有沉淀生成,继续加氢氧化钠溶液,剧烈振摇使之沉淀完全
再次过 滤作为待测试液 3.5.2杂质氧化 于a,b,c三支15mL刻度试管(3.3.3)中各吸人试样溶液(3.5.1)10ml,同时做平行,向试管a中加 人水1ml,向试管b中加人维生素B标准工作液(3.2.10.3)1mL
然后各加人冰乙酸(3.2.7)1ml
GB/14701一2019 旋摇混匀后逐个加高酸钾溶液(3.2.6)0.5ml,旋摇混匀,静置2min,再逐个加人过氧化氢溶液 3.2.9)0.5m旋摇,使高缸酸即颜色在10s内消退
加盖摇动,使气泡逸出
3.5.3测定 用荧光素标准工作液(3.2.11.2)调整荧光仪,使其稳定于一定数值,作为仪器工作的固定条件
调 整激发波长440nm,发射波长525nm,测定试管a,试管b的荧光强度,试样溶液在仪器中受激发照射 不超过10s;在试管c中加人20mg连二亚硫酸钠(3.2.5),摇动溶解,并使试管中的气体逸出,迅速测定 其荧光强度作为荧光空白
若溶液出现浑浊,不能读数
3.6试验数据处理 试样中维生素B的含量u,以质量分数表示,单位为毫克每千克(mg/ke),按式(I)计算 mlg 1二 × w -×n x岗 m 式中: T 试管a(试液加水)的荧光强度; T -试管b(试液加标样)的荧光强度; T 试管c(试液加连二亚硫酸钠)的荧光强度; -加人维生素B
标样的量,单位为微克("g) no -试液的初始体积,单位为毫升(mL) V 谢试时分取试液的体积,单位为毫升(ml.) 试样质量,单位为克(g) n 稀释倍数 -一值应在an- 1 1.5,否则需调整样液的浓度,调整称样量或者稀释倍数
测定结果用平行测定的算术平均值表示,保留三位有效数字
3.7精密度 对于维生素B含量低于5mg/kg的饲料,在重复性条件下,获得的两次独立测定结果与其算术平 均值的差值不大于这两个测定值算术平均值的15%; 对于维生素B含量大于5mg/k区而小于50mg/kg的饲料,在重复性条件下,获得的两次独立测 定结果与其算术平均值的差值不大于这两个测定值算术平均值的10% 对于维生素B含量大于50mg/kg的饲料,在重复性条件下,获得的两次独立测定结果与其算术 平均值的差值不大于这两个测定值算术平均值的5%
方法2:高效液相色谱法 4.1原理 试样中核黄素经酸性溶液超声提取后,，经离心,过滤后的试样溶液注人高效液相色谱仪反相色谱系 统中进行分离,用紫外检测器(二极管矩阵检测器)或荧光检测器检测,外标法计算维生素B的含量
4.2试剂或溶液 除特殊说明外,所用试剂均为分析纯,水为蒸僧水,色谱用水为去离子水,符合GB/T6682中一级 用水规定
GB/T14701一2019 4.2.1二水合乙二胺四乙酸二钠(EDTA);优级纯
4.2.2庚熔磺酸钠(PICB);优级纯
4.2.3磷酸二氢钠优级纯
4,2.4冰乙酸;优级纯
425=么股.色请线
4.2.6甲醇;色谱纯
42.7提取液;在100mL容量瓶中,称50mg(精确至0.001g)EDTA(4.2.1),加人约700mL去离子 水,超声使EDTA完全溶解
加人25ml冰乙酸(4.2.4)、5mlL三乙胺(4.2.5),用去离子水定容至刻度 摇匀 4.2.8磷酸二氢钠溶液:称取3.9g磷酸二氢钠,溶于1000ml去离子水,过膜备用
4.2.9流动相I;在1000mL容量瓶中,称人50mg(精确至0.001g)EDTA(4.2.1)、1.1g(精确至 mL去离子水,超声使固体全部溶解
0.001 庚烧磺酸钠4.2.2),加人约700 加人25ml冰乙酸 g 4.2.4),5ml三乙胶(4.2.5),用去离子水定容至刻度摇匀
用冰乙酸,三乙胶调节该游液pHH 至 mL甲醇(4.2.6)混合，超声脱气,备用 3.70士0.10，过0.45m滤膜
取该溶液800mL与200 4.2.10维生素B
标准溶液 42.10.1维生素B标准贮备液;称取在五氧化二磷干燥器里干燥24h的维生素B.(纯度大于95%) 10mg(精确至0.0001g)于250ml锥形瓶中,加1mL冰乙酸(4.2.4)在沸水浴煮沸30min,待固体颗 粒完全溶解,取出冷却至室温后转移人250mL棕色容量瓶中,用去离子水定容至刻度
此溶液中维生 素B浓度为504g/mL,置于冰箱2C一8保存,可使用6个月
42.10.2维生素B
标准工作液;测定维生素预混合饲料样品,可直接使用维生素B
标准贮备液 (4.2.10.1中的标准液作为上机标准溶液;测定复合预混合饲料、浓缩饲料样品,应准确吸取5mL维 生素B标准贮备液(4.2.10.1)于50ml棕色容量瓶中,用提取液定容至刻度
该标准工作液中维生素 B浓度为54g/ml.,分析前稀释备用
4.3仪器设备 4.3.1高效液相色谱仪:带紫外检测器(二极管矩阵检测器)或荧光检测器
4.3.2pH计;带温控,精度0.01
4.3.3恒温水浴锅:0C 100C 4.3.4针头过滤器;备0.454m水系滤膜
4.4试样的制备 按GB/T14699.1的规定采样,选取有代表性的饲料样品至少500g,四分法缩减至100g;按 GB/T20195的规定制备样品,磨碎,全部通过0.425mm孔筛,混匀,装人密闭容器中,避光低温保存 备用
4.5试验步骤 以下操作应避免强光照射
4.5.1试样溶液的制备 称取维生素预混合饲料试样0.25g0.50g(精确至0.0001g)或复合预混合饲料、浓缩饲料2g3g 精确至0.001g),于100ml棕色锥形瓶中,加人约70mL
的提取液(4.2.7)于100C水浴中煮沸 30min40 min，最初的几分钟里,摇动锥形瓶以防止固体结块
待冷却后,转移至100ml棕色容量 瓶中,用提取液定容至刻度,混匀,过滤
对于维生素预混合饲料,需要使用提取液进一步稀释510倍
GB/14701一2019 上液相色谱仪测定前所有试液均需经0.454m滤膜(4.3.4)过滤
4.5.2测定 4.5.2.1高效液相色谱参考条件！ 色谱柱Cw,长250mm,内径4.6mm,粒度5Mm,或性能相当的C柱
流动相;见4.2.9
流速:l.0ml/min
C 28 柱温:25 进样体积;10Al一20l
检测器;紫外或二极管矩阵检测器
波长:267nm
4.5.2.2高效液相色谱参考条件I 色谱柱:C8,长250mm,内径4.6mm,粒度5m,或性能相当的CI柱
流动相:A;磷酸二氢钠溶液(4.2.8);B:甲醇,梯度淋洗,见表1. 流速:l.0mL/min; 柱温:25C一28C 进样体积:10AL~20L
检测器;荧光检测器激发波长440nm;发射波长525nm
表1流动相梯度淋洗表 时间/min B;甲醇/% ;磷酸二氢纳/% A 0.00 99.0 1.0 3.00 88.0 12.0 6.50 70.0 30.0 12.00 70.0 30,0 99.0 1.0 12.10 18.00 99.0 1.0 4.5.2.3定量测定 色谱柱注人维生素B标准贮备液(4.2.10.1)或者维生素B标准工作液(4.2.10.2)和试样溶液(4.5.1)， 得到色谱峰面积的响应值,用外标法定量测定,维生素B色谱图参见附录A
4.6试验数据处理 试样中维生素B的含量u，以质量分数表示,单位为毫克每千克(mg/kg),按式(2)计算 AxVxcx 7e一 A××V 式中: -试样溶液峰面积值; A 试样稀释体积,单位为毫升(mL);
GB/T14701一2019 标准溶液浓度,单位为微克每毫升(4g/mL)7 V 标准溶液进样体积,单位为微升(AL); A 标准溶液峰面积平均值; V 试样溶液进样体积,单位为微升(AL); 试样质量,单位为克(g); n 测定结果用平行测定的算术平均值表示,保留三位有效数字
4.7精密度 对于维生素B含量大于5mg/kg而小于1000mg/kg的饲料,在重复性条件下,获得的两次独立 测定结果与其算术平均值的差值不大于这两个测定值算术平均值的10%; 对于维生素B含量大于1000mg/kg的饲料,在重复性条件下,获得的两次独立测定结果与其算 术平均值的差值不大于这两个测定值算术平均值的5%
GB/14701一2019 录 附 A 资料性附录 维生素B标准色谱图 液相色谱紫外检测色谱条件下维生素B标准色谱图见图A.1,液相色谱荧光检测色谱条件下维生 素B标准色谱图见图A.2
0.030 0.025 维生素B 0.020 0.015 Au 0.010 0.005 0.000 -0.005 min 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 图A.1液相色谱紫外检测色谱条件下维生素B标准色谱图(维生素B浓度为2Hg/mL 141HLDlAEx-40.Em-525 12 维生素B 10 12.515 17.52022.5min" 7.5 10 图A.2液相色谱荧光检测色谐条件下维生素B标准色谐图维生素B，浓度为12g/mL)
饲料中维生素B2的测定GB/T14701-2019
一、背景
维生素B2是一种重要的营养物质，对动物生长、发育和健康有着重要作用。饲料中添加维生素B2可以提高动物的生产性能，避免营养缺乏导致的疾病。因此，饲料中维生素B2的含量检测非常重要。
二、测定方法
饲料中维生素B2的含量可以使用高效液相色谱法进行测定。具体步骤如下：
- 1. 取适量样品，粉碎均匀，过筛，称取0.5g左右的样品。
- 2. 加入一定量的蛋白酶，使样品完全水解。
- 3. 加入一定量的内标溶液，进行离子对色谱纯化。
- 4. 用高效液相色谱进行分离，测量样品中维生素B2的峰面积，并与标准物质进行比较，计算出维生素B2的含量。
三、参考标准
饲料中维生素B2的测定方法参照GB/T14701-2019。
四、总结
饲料中维生素B2的含量检测是保证动物健康和生产性能的重要手段。使用高效液相色谱法可以准确测定饲料中维生素B2的含量。
