基因表达的测定蛋白印迹法

基因表达的测定蛋白印迹法

国家标准 GB/T38477一2020 基因表达的测定蛋白印迹法 Determinationofgeneexpression一westernbot 2020-11-19发布 2020-11-19实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标涯花管理委员会国家标准
GB/38477一2020 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由标准化研究院提出并归口 本标准起草单位:河北医科大学、标准化研究院、河北省食品检验研究院、科学院遗传与发 育生物学研究所农业资源研究中心,医科大学,河北师范大学 本标准主要起草人:吕品、马爱进、张岩,赵伟东、曹鹏秀,赵美丞、王宁
GB/38477一2020 基因表达的测定蛋白印迹法 范围 本标准规定了用蛋白印迹(westernblot)法测定基因表达的方法原理、试剂或材料、仪器设备、测 定步骤和结果分析 本标准适用于动植物组织或体外培养细胞目的基因表达测定 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 术语,定义和缩胳语 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1.1 基因表达geneexpressionm 将储存在DNA分子中的遗传信息经过转录和翻译,转变成具有生物活性的蛋白质分子的过程 3.2缩略语 下列缩略语适用于本文件 BSA;牛血清白蛋白(BovineSerumAIbumin) ECL增强型化学发光(EnhaneedChemiluminecence) SDS;十二烧基硫酸钠(SodiumDodeeylSulfate) SDSPAGE:十二烧基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SodiumDodecylSulfate-PolyacrylamideGel Electrophor reSis TBS;Tris缓冲盐溶液(TrisBuferedSaline) TBST;吐温-20/Tris缓冲盐溶液(Tween-20/TrisBufferedSaline) 原理 SDsPAGE分离的蛋白质转移到转印上后,先用抗目的蛋白质的一抗与转印膜上的蛋白质反 应,然后利用带标记的二抗与一抗反应,最后根据二抗标记物的特性,检测微量蛋白质
GB/T38477一2020 5 试剂或材料 5.1总则 除非另有规定,仅使用分析纯试剂 5.2水 GB/T6682,二级 5.31mo/LTIris-盐酸溶液 称取12.1gTris加人80ml水溶解,用盐酸调至所需pH,加水定容至100ml. 5.42mo/L氧化钠溶液 将117g氯化钠加水溶解,定容至1000mL 5.50.5mol/L乙二胺四乙酸溶液 称取18.61g乙二胺四乙酸二钠二水合物,加人80mL水,充分搅拌,用氧氧化钠调pH至8.0,然 后定容至100mL 5.6动物细胞/组织总蛋白裂解液 取5mL1mol/LTris盐酸溶液(pH8.0)、7.5mL2mol/L氯化钠溶液、1mL0.5mol/L乙二胺 四乙酸溶液、1ml乙基苯基聚乙二醇,0.lg十二恍基硫酸钠、lg脱氧胆酸钠、加水定容至100mL 使 用前加人蛋白酶抑制剂 5.7植物总蛋白抽提试剂盒 含裂解液和蛋白酶抑制剂 5.81.5mol/LTris盐酸(pH8.8)溶液 将18.15gTris加人80mL水溶解,用1mol/1盐酸调pH至8.8,加水定容至100mL 5.9丙烯酰胺溶液 称取29只丙烯酰胺单体和1gN,N'-甲叉双丙烯酰胺,加水溶解并定容至100ml,过滤,置于棕色 瓶,4C避光保存,2个月内使用 5.100.1g/ml十二炕基硫酸钠溶液 称取10g十二烧基硫酸钠,加水溶解并定容至100ml,室温保存 5.110.1g/ml过硫酸铵溶液 称取1g过硫酸铵,加水溶解并定容至10mL,分装后,于一20笔保存 5.12蛋白浓度测定试剂盒 含蛋白质标准品BSA和染料试剂
GB/38477一2020 5.135×SDs上样缓冲液 取2.5mL1mol/ITris盐酸(pH6.8)缓冲液、2g十二婉基硫酸钠、1.2mL8筑基乙醇、4mL甘 油,0.2g嗅酚蓝加人水中溶解,定容至40mL 5.145×SDS-PAGE电泳缓冲液 称取23.5g甘氨酸和3.775gTris,加水溶解,定容至250ml 使用时按如下比例稀释至使用浓 度:取133mL5×SDSPAGE电泳缓冲液，7mL.0.lg/mL十二烧基硫酸钠溶液,加水定容至700mL 5.15转膜缓冲液 称取3.03gTris,l4.4g甘氨酸,加水溶解,再加200ml甲醇混匀,定容至1L,4C保存 5.16TBS溶液 量取75ml2mol/儿氯化钠溶液和10mL1mol/LTris-盐酸(pH7.5)缓冲液,加水定容至1L 5.17TBST溶液 量取75mL2mol/L氧化钠溶液、10mL1mol/LIris盐酸(pH7.5)缓冲液和1mL 吐温-20,加 水定容至1L 5.18封闭液 称取5g脱脂奶粉,溶于100mlTBST溶液,混匀,现用现配 仪器设备 6.1电泳仪 6.2转膜仪 6.3垂直电泳槽 6.4分析天平,感量0.001g 6.5平板摇床 6.6低温离心机,最大离心力25910g 6.7化学发光仪/红外荧光成像系统 6.8振荡器 6.9真空干燥器 6.102.45mm超厚滤纸 6.111.5mL离心管 6.12磁力搅拌器 测定步骤 7.1总蛋白的提取 7.1.1动物总蛋白的提取 将20mg体外培养的细胞或研碎的组织转移至1.5ml.的离心管中,加150AlL250AL.预冷的细胞裂
GB/T38477一2020 解液(含蛋白酶抑制剂),振荡器震荡15s,冰浴5min,重复震荡-冰浴30min后,4C,12000r/min离心 10min,得上清液 7.1.2植物总蛋白的提取 按照植物总蛋白提取试剂盒说明进行 7.2蛋白浓度的测定 按照蛋白浓度测定试剂盒说明进行 7.3SDS-PAGE 7.3.1蛋白变性 测完蛋白浓度后,计算含1004g总蛋白的浴液体积即为上样量 取出上样样品于离心管中,加人 5×SDS上样缓冲液至终浓度为1×,将样品于沸水中煮3min~5min使蛋白质变性 7.3.2制胶 根据蛋白质相对分子质量大小选择相应的SDS聚丙烯酰胺凝胶浓度,参见附录A 7.3.3上样 取7.3.1的蛋白样品上样,相邻齿道加上标准分子量预染蛋白,空余齿道用1×上样缓冲液补足 体积 7.3.4电泳 选择电压为8V/em,当染料进人分离胶后,把电压提高到15V/em,继续电泳直到溴酚蓝达到分离 胶底部,然后关闭电源 7.4转膜 7.4.1凝胶准备 将进行完SDS-PAGE后的凝胶浸泡于转膜缓冲液中30tmin 7.4.2半干法转移蛋白质 将转印膜和两张与转印膜相同尺寸的滤纸于转膜缓冲液中浸泡5min 由下至上安装转移装置 阳极板一超厚滤纸一转印膜一凝胶一超厚滤纸一阴极板,根据凝胶面积按0.65mA/em'接通电流,根 据目的蛋白相对分子量大小,转移1.5h3h 7.5封闭 将转印膜置于封闭液中,室温摇动1h 7.6免疫反应 将封闭后的转印膜转移到一抗工作液中,室温下摇动1h以上或4C缓慢摇动过夜 弃去一抗工 作液,用TBST摇动洗涤转印膜3次,每次10min,最后用TBS摇动洗涤转印膜5min. 将转印膜置于二抗工作液中,室温下摇动1h3h 弃去二抗工作液,以TBST摇动洗涤转印膜 3次,每次10 ,最后用TBS摇动洗涤转印膜5min. min
GB/38477一2020 7.7成像 7.7.1辣根过氧化物酶标记二抗的成像 取ECL化学发光液A,B等量混匀,加在转印膜上,避光显色1 min5min 1,化学发光仪成像 7.7.2荧光标记二抗的成像 利用荧光成像系统成像 结果分析 成像图片本底干净,能观察到转印膜均匀的轻微背景轮廓,目的条带清晰且不过曝,即可判为目的 蛋白表达
GB/T38477?2020 ? A ??) ? A.1SDs-PAGE? ???,?A.1? A.110mL????? ?? ml ? 1.5mol/LTri- 0.1/ml?? 0.1g/ml ? ? ??? (pH8,8 ? ? 6% 2.5 2.0 0.1 0.1 0.008 5.3 8% 2.5 2.7 0.006 0. 0.l1 4.6 0% 2.5 3.3 0.1 0.1 0,004 4.0 12% 2.5 4.0 0.1 0.1 0,004 3.3 15% 2.5 5,0 0.1 0.1 0,004 2.3 A.2sDs-PAGE? ?A.2sDSPAGE? A.25mL5%?? ?? ml ? 1mol/ITris- 0.1/ml?? 0.lg/mL ?? ??? ? ? (pH6.8 ? 5 0,63 0,83 0,05 0.05 0,005 3.4

基因表达的测定蛋白印迹法GB/T38477-2020

基因表达是指在生物体内，基因产生mRNA，然后通过翻译过程生成蛋白质的过程。蛋白质是构成生物体各种组织和器官的基础，同时也是各种生物化学反应的催化剂。

想要了解某个基因是否被激活，需要检测相应的蛋白质表达水平。为了对基因表达进行测定，科学家们开发了不同的实验方法。其中，蛋白印迹法是最常用的一种方法之一。

蛋白印迹法主要通过特异性抗体来检测目标蛋白质的存在和表达量。首先，需要从样本中分离出蛋白质，并将其分子量进行分离。随后，使用氮化膜或者其他载体将这些蛋白质分子沉积在上面。接下来，使用特异性抗体与目标蛋白质结合（通常是通过Western blot实验）。最后，使用探针检测抗原-抗体复合物。

GB/T38477-2020是中国国家标准化委员会新发布的一项标准，主要规定了蛋白印迹法的操作方法、样品处理、检测灵敏度等方面的内容。它的发布将标准化蛋白印迹法的操作流程，提高了测量结果的可靠性和可重复性。

总之，蛋白印迹法是一种常用的基因表达测定方法，其最新的标准 GB/T38477-2020 将有助于提高测量结果的可靠性，并推动该领域的研究进展。

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