GB/T38483-2020
微生物源抗生素类次生代谢产物抗细菌活性测定抑菌圈法
Determinationofantibacterialactivityformicrobialsecondarymetabolites—Inhibitionzonemethod
- 中国标准分类号（CCS）A21
- 国际标准分类号（ICS）07.080
- 实施日期2020-11-19
- 文件格式PDF
- 文本页数5页
- 文件大小348.82KB
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微生物源抗生素类次生代谢产物抗细菌活性测定抑菌圈法
国家标准 GB/T38483一2020 微生物源抗生素类次生代谢产物 抗细菌活性测定抑菌圈法 Determinationfantibaecterialactivity formierobialsecondary metabolites一Inhibitionzonemethod 2020-11-19发布 2020-11-19实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标涯花管理委员会国家标准
GB/38483一2020 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草
本标准由标准化研究院提出并归口 本标准起草单位:计量大学、标准化研究院
本标准主要起草人:申屠旭萍、叶子弘、马爱进、俞晓平、许益鹏、崔海峰、张雅芬
GB/38483一2020 微生物源抗生素类次生代谢产物 抗细菌活性测定抑菌圈法 范围 本标准规定了用抑菌圈法测定微生物源抗生素类次生代谢产物抗细菌活性的方法
本标准适用于微生物源抗生素类次生代谢产物抗细菌活性测定
规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的
凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件
凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全要求 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件
3. 抑制中浓度medianinhibitoryconeentratiom C 对细菌的抑制率达到50%时的浓度
3.2 抗细菌活性antibeterialaetivity 抑制细菌生长繁殖的能力
3.3 抑菌圈inhihitim2me 固体培养基表面与试样接触的边界处无菌繁殖的环带区域
原理 利用待测次生代谢产物在琼脂平板中扩散使其周围的细菌生长受到抑制形成的抑菌圈大小,计算 Cm来判定活性
实验室生物安全要求 应符合GB19489的规定
试剂或材料 除非另有规定,所用试剂均为分析纯
GB/T38483一2020 6.1水
GB/T6682一级水
6.2LB液体培养基
称取胰蛋白陈10.0g、酵母提取物5.0g,氯化钠10.0g,然后将上述各成分加于 mL燕馏水中,煮沸溶解,调节pH至7.0士0.2,分装至锥形瓶中,121C灭菌20min. l000 6.3LB固体培养基
称取胰蛋白陈10.0g、酵母提取物5.0g,氯化钠10.0g,琼脂20.0g,然后将上述 各成分加于1000mL蒸缩水中,煮沸溶解,调节pH至7.0士0.2,分装至250mL锥形瓶中,121C灭菌 20min.
6.4指示菌标准菌株 革兰氏阳性菌;金黄色葡萄球菌(Siahylwwcus aureus)ATCC6538
革兰氏阴性菌;大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)ATCC11229
也可以采用其他标准菌株作为供试菌,具体可参照实际情况进行选择
仪器设备 7.1恒温培养箱;温度偏差在士1C以内
7.2无菌培养m;带陶瓦盖直径90mm. 7.3无菌牛津杯;不锈钢,标准规格;内径6mm,外径8mm,高10mm 7.4抑菌圈测量仪;精度0.1mm
7.5分光光度计;检测波长600nm
7.6无菌锥形瓶:容量100mL、250mL 7.7无菌吸管;1lmL(具0.01m刻度),10mL(具0.1m刻度)或微量移液器
8 操作步骤 8.1菌株活化 将菌株接种到装有2mL的LB液体培养基的试管中,37C士1C下培养12h18h
用接种环挑 取菌悬液以划线法接种到LB因体平板上.,37C士1C恒温培养箱中培养18h一2h,然后从平板中挑 取单菌落接种在LB固体培养基试管斜面内,37C士1C恒温培养箱中培养18h~24h,后将试管斜面 贮存于1C4C冰箱内作为保存菌,保存期不超过一个月,每月传代一次,传代次数不超过10代
8.2菌悬液制备 8.2.1用接种环取保存菌,以划线法接种到LB固体平板上,37士1C下培养24h
注:IB固体平板在1C4C条件下保存,1周内使用
8.2.2取LB液体培养基20mL加人容量为100mL的无菌锥形瓶内,用接种环取8.2.1平m上的单菌 落接种在LB液体培养基内,37C士1C培养12h一18h. 8.2.3用LB液体培养基调节培养后的菌浓度至1×10'CFU/ml5×10'CFU/ml.并以此作为试验 菌悬液
采用分光光度计测定试验菌悬液OD为0.50.65或(其他)适当的方法测定菌悬液浓度 注:试验菌悬液在1C4条件下保存,在4h内使用
8.3供试样品制备 极性样品直接用水充分溶解(非极性样品加一定浓度的表面活性剂充分溶解),配制成一定浓度的 母液，经无菌0.45Mm滤膜过滤,然后用无菌水(或相应的表面活性剂)按2倍或5倍浓度逐级稀释,制 备成至少5个不同浓度的待测溶液;逐级稀释时应确保既有抑制率大于50%分布的浓度点,也有抑制 率小于50%分布的浓度点,现配现用
GB/38483一2020 8.4检测平板制备 将8.2.3中的菌悬液用冷却至55左右的LB固体培养基按1:10的比例稀释,充分混匀后取 5mlL于无菌培养内,轻轻摇动平板使菌液均匀铺平,待其凝固后制成检测平板,备用
8.5抑菌活性测定 分别将无菌牛津杯轻轻地放在8.4制备的检测平板中,而后用无菌吸管分别将8.3中制备的200山 不同浓度的供试样品溶液加人牛津杯中,空白对照组加人200AlL对应的溶剂,每个处理重复5次
将 平板正置于37C士1C恒温培养箱中培养12h~18h,取出,用抑菌圈测量仪测量待测样品和空白对 照组形成的抑菌圈直径
结果计算 抑制率按式(1)计算: D-D. ×100% D. 式中: -抑制率; D -供试次生代谢产物平板中形成的抑菌圈直径,单位为毫米(mm); D -空白对照平板中形成的抑菌圈直径,单位为毫米(mm 以五个平行样的平均值为最终结果,计算结果保留到小数点后两位
根据药剂浓度对数值与对应抑制率的概率值作回归分析,得到回归曲线Y=aX十b,其中Y为抑制 值,计算供试药 率的概率值X为药剂浓度对数值,a为回归曲线斜率,6b为常数,并给出回归曲线的R' 剂分别对大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌的IC值 10重复性 在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的15%
微生物源抗生素类次生代谢产物抗细菌活性测定抑菌圈法GB/T38483-2020
微生物源抗生素类次生代谢产物是医药领域中常用的药物之一，其抗菌作用已经被广泛认可。如何对其进行抗细菌活性测定成为了一个重要的问题。
GB/T38483-2020标准规定了一种针对微生物源抗生素类次生代谢产物抗细菌活性测定的方法，即抑菌圈法。该方法主要是利用微生物菌落在培养基上的生长特点，将待检测的次生代谢产物加入到培养基中，然后通过观察抑菌圈大小来评估其抗菌能力。
具体操作时，首先需要将待检测的次生代谢产物加入到含有微生物菌落的平板培养基中。然后，将其在适当温度下孵育一段时间，待细菌菌落生长形成后，观察平板上出现的抑菌圈大小。根据抑菌圈的大小和形状，可以初步判断该次生代谢产物的抗菌能力。
虽然抑菌圈法是一种简单易行的抗菌活性测定方法，但其结果受到多种因素的影响。如何减少误差，提高测试结果的可靠性是需要关注的问题。同时，在实际操作中还需要注意样品制备、培养条件等因素对测试结果的影响。
总之，GB/T38483-2020标准所制定的抑菌圈法是一种常用的微生物源抗生素类次生代谢产物抗细菌活性测定方法，其具有操作简便、结果可靠等优点。在实际应用中需要注意操作规范，以确保测试结果的准确性。
