GB/T31791-2015
棉花曲叶病毒检疫鉴定方法
DetectionandidentificationofCottonleafcurlvirus
- 中国标准分类号（CCS）B16
- 国际标准分类号（ICS）65.020.01
- 实施日期2015-11-27
- 文件格式PDF
- 文本页数11页
- 文件大小365.12KB
以图片形式预览棉花曲叶病毒检疫鉴定方法
棉花曲叶病毒检疫鉴定方法
国家标准 GB/T31791一2015 棉花曲叶病毒检疫鉴定方法 DetectioandidentificationofCottonleafcurlirus 2015-07-03发布 2015-11-27实施 中毕人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中 国国家标准化管厘委员会国家标准
GB/T31791一2015 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草
请注意本文件的某些内容可能涉及专利
本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任
本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口
本标准起草单位;检验检疫科学研究院、广东出人境检验检疫局、中华人民共 和国云南出人境检验检疫局、新疆出人境检验检疫局、浙江大学,深圳 出人境检验检疫局、茂名出人境检验检疫局
本标准主要起草人;张立、张永江、冯黎霞,李曼、张祥林、周雪平、郑耘、马洁、李海林,辛言言、 朱水芳,李明福
GB/T31791一2015 棉花曲叶病毒检疫鉴定方法 范围 本标准规定了棉花曲叶病毒的免疫学及分子生物学检疫鉴定等方法
本标准适用于可能携带棉花曲叶病毒的植物组织的检疫鉴定
仪器设备、用具和试剂 2.1仪器设备 电子分析天平(0.001g)、小型离心机、台式冷冻离心机、恒温水浴锅、酶标仪、普通PCR仪,实时荧 光PCR仪、电泳系统、pH计、凝胶成像系统、4C冰箱,超净工作台,-80C超低温冰箱、高压灭菌锅、 制冰机、涡旋振荡器、微波炉等
2.2用具 可调移液器(2.5AL,10Al、20l、100Al、1000AL)、吸头、离心管,Eppendor管0.2mL 0.5ml、l.5mL)和研钵等
2.3试剂 除有特殊说明外,所有实验用试剂均为分析纯或生化试剂
DAsELISA、常规PCR及实时荧光PCR检测试剂分别见附录B,附录C及附录D. 检疫鉴定方法 3.1DAs-EL.ISA检测 DAs-ELISA检测见附录B 3.2常规CR检测 常规PCR检测见附录C
3.3实时荧光CR检测 实时荧光PCR检测见附录D. 结果判断 3.1、3.2及3.3中两种不同原理的检测方法的结果为阳性即可判定样品为CICuV阳性
一般是 DAS-ELISA检测为阳性后,常规PCR或实时荧光PCR检测结果为阳性即可判断样品为CLCuV 阳性
GB/T31791一2015 样品保存与记录结果 5.1样品保存 结果判定为阳性的样品应妥善保存,并做好登记和标记,以备复核用
保存期满后,需经灭活处理
5.2结果记录 完整的实验记录要包括;样品的来源,种类,时间,实验检测时间,地点,方法和结果,并有实验人员 的签字;DAS-ELISA检测需有酶联反应原始数据,PCR检测需有电泳结果图片,实时荧光PCR检测需 有扩增曲线结果图片
GB/T31791一2015 附录A 资料性附录 棉花曲叶病毒背景资料 A.1背景资料 A.1.1棉花曲叶病毒基本信息 中文名:棉花曲叶病毒
e curluirs
学名:Cotto o7n ea 缩写:CICuV
分类地位;双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Be ego710U1rus)
传播途径;烟粉虱(Bemisiatabaci)传播及苗木嫁接传播
A.1.2方法原理 根据棉花曲叶病毒与抗体之间的特异性反应,对样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附(DAs-ELISA 检测;根据该病毒DNA保守区的特异性进行常规PCR或实时荧光PCR检测,通过电泳条带大小或扩 增曲线的变化进行结果判定
A.2寄主范围 该病毒可侵染的寄主有:棉花(Gosypiumhirsutum),烟草(Nicolianlabacum、 、秋葵(Hibis scs 番茄L esculentus、 copersiconesculenlunn 扶桑Hibiscusrosasinensi、、荷麻Abutilon heophrasti),芝麻(Ssesamumimdicum)、矮牵牛(Petuniahybrida),曼陀罗(Daturastramonium)等
A.3分布 该病毒现主要分布在巴基斯坦、印度,苏丹、埃及,尼日利亚、马拉维和南非
A.4病害症状 棉花植株受侵染后,早期表现新叶卷曲、叶脉膨大,后期在叶背面的主脉上形成耳突,植株矮化,结 实率下降或不结实
A.5粒体形态 棉花曲叶病毒具有典型的双联体颗粒形态,大小为18nm×30nm一20nm×30nm
A.6基因组特征 该病毒的基因组含有2个大小相近的环状ssDNA组分,大小为2.5kb3.0kb
GB/T31791?2015 ? B 淶?? ???DAS-ELISA B.1?? B.1.1?? ?б??塣 B.1.2 ???塣 B.1.3?? ????塣 B.1.4 (pNPP) B.1.510PBST?(pH7.4) ?(N.c)80g.(KHHPo,2.(N.HPo)l.5.?(Kc26 -20(Tween-20)5mlL,(HCI)pH7.4,1000ml,4档 B.1.6???(pH7.4 (Na,SO,)1.3g,??(Mw2400040000,PVP)20g,(NaN 0.2g-20(Tween-20)20mL,800mL1PBST,(HCI)pH7.4,1PBST 1000ml,4C档 B.1.7建?(pH9.6) ?(Na.cO.)1.59g?(NaHcO.)2.93,(NaN;)0.2g,(HcI) pH9.6,?1000mL,4C档 B.1.8??? 1PsT?(HC)pH7.4,4C B.1.9??建?(pl7.4 1PBsT?800mL???(EBSsA)2g,??(Mw24000?40000. PVP)20g(NaN,)0.2g,1PBST1000mL,4?档 B.1.10(pNPP)?(pH9.8 ?(CHNO.)97mL(NaN.)0.2g,(HCI)pH9.8,??
GB/T31791一2015 1000mL,4C条件下贮存
B.1.11底物(pNPP)溶液 将4-硝基酚磷酸钠盐(pNPP)100mg溶解于pNPP底物缓冲液100mL中,现配现用
B.1.12反应终止液 氢氧化钠(NaOH)40g,用燕僧水定容至1000mL B.2样品制备 取待检样品0.2g1.0g,按15(g/ml.)加人样品提取缓冲液用研钵研磨样品,4000片离心 5min后吸取上清液待用
B.3操作步骤 B.3.1包被抗体 根据检测需要将适量的孔条放于酶联板架上,包括2个阳性对照孔、2个阴性对照孔、2个空白对照 孔和多个待检测样品孔,每个样品重复2次;每孔加人100L的包被抗体溶液,封口膜包好,37C孵育 2h4h(或4C冰箱过夜). B.3.2加样 将酶联板孔中溶液控干,用PBST洗涤3次,每次3min,然后在滤纸上扣干;将100l.待测样品溶 液加人到待检测孔中,对照孔中也各加人100L相应的对照
封口膜包好,37C孵育2h3h(或4 冰箱过夜
B.3.3加酶标抗体 洗涤,步骤同B.3.2;用酶标抗体稀释缓冲液按照要求稀释酶标抗体,每孔加人100L酶标抗体游 液,封口膜包好,37C孵育2h4h
B.3.4加底物 洗涤,步骤同B.3.2;每孔加人100L底物溶液,室温孵育0.5h2h
必要时每孔加人504L的终 止液终止反应
B.3.5读数 酶标仪405nm波长下检测各孔的吸收值并记录
B.4结果判定 B.4.1质量控制要求 空白对照孔和阴性对照孔OD值<0.15;阳性对照OD值/阴性对照OD值>2;同一样品的 OD值应基本一致
GB/T31791一2015 B.4.2结果判定 若满足不了B.4.1的质量要求,则不能进行结果判定
在满足了B.4.1的质量要求后,则按如下原则作出判定 样品OD值/阴性对照OD值明显大于2,结果判定为阳性; 样品OD值/阴性对照OD值在值附近,判为可疑样品,需重做一次或者用3.2或3.3方 法进行验证; 样品OD值/阴性对照OD值明显小于2,判为阴性
GB/T31791一2015 附 录c 规范性附录 常规CR检测 c.1试剂 c.1.1提取缓冲液A 葡萄糖(Cc,HnO.)60g、铜试剂(NaDECA)23g,聚乙烯基毗咯烧酮(Mw24000一40000,PVP) 20g、硫基乙醇(CH.OS)0.8mL,溶解于1000mL燕水中,常温下贮存
c.1.2提取缓冲液B 10mmol/LTris-Hcl,20mmol/L乙二铵四乙酸二钠(NaEDTA
2H.O)、0.5mmol/L氯化钠 (NaCI)、1.5%十二婉基磺酸钠(SDS),pH8.0 C.1.350×TAE电泳缓冲液pH8.0 三羚甲基氨基甲烧(Tris)242g、冰乙酸(C,H,O.)57.1mL乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA 2H.O)37.2g,蒸僧水定容至1000ml,用时稀释至1×TAE C.2引物 上游引物CL1/F;5'-GTcCGCAGGATTATTCACcCG3’; 下游引物CL.3a/R;5'-GTTGcTAGcG;TGAGTAcAA-3' 用于扩增棉花曲叶病卷DNAA组分保守区791bp大小的片段
C.3核酸提取 分别称取阴性(健康1对照,阳性(染病)对照及待检样品的植物组织0m,加人IoL提取缓冲 液A.研磨后1o0只离心10mn.沉淀加人300AL提取缓冲液B混匀后将离心管冒于65C恒温水 浴中30min60nin,加人200lL三氯甲炕:异戊醇:乙醇(80:4:16),颇倒混匀,室温静置5min~ 0mim后,室温下500
离心百mim.上请液加人2倍体积的乙醉，一20C放置1b,1200片离心 10min,沉淀用100L的0.1mmol/LTris-Hc缓冲液(pH8.0)溶解,贮存于一20C冰箱中备用
注，或者按照等效DNA提取试剂盒进行操作
C.4CR扩增 0.2mlPCR管中加人10×PCRBuffer2.5L,MgCl(25mmol/L)2L,dNTPs(10mmol/L 0.5AlL,CL1/F(10mmol/L)0.2AL.CL3a/R(10mmol/1)0.2L.,Ta酶(5U/aL)0.3AlL,DNA 3.0L,ddH.O补至25L
设置阳性对照、阴性对照及空白对照
反应条件:94C3nmin;94C1min,60C1min,72C1min,36个循环;72C10min.
GB/T31791一2015 C.5琼脂糖凝胶电泳检测 制备1%的琼脂糖凝胶,按比例混匀电泳上样缓冲液和PCR扩增产物,用DNAMarker作为分子 量标记,进行电泳分析
电泳结束后在凝胶成像仪的紫外透射光下观察是否扩增出预期的特异性DNA 条带,并拍摄记录
C.6结果判定 如果阳性对照出现约791p的条带,检测样品、阴性对照和空白对照未出现特异性条带,可判定样 品为CLCuV阴性
如果阳性对照及检测样品出现约791p的条带,阴性对照和空白对照未出现特异性条带,可判定 样品为CLCuV阳性
GB/T31791一2015 附录D 规范性附录 实时荧光CR检测 D.1主要试剂 DNA提取试剂见c.1
TaqManPCRMixture D.2引物和探针 引物序列:CLCuV-F:5'GCAGGAAAATAcGAGAATcATAcGG3’; CLCuV-R:5’-TAATcTTCcAAcGTAGCATAAACAGGGT-3’; 探针序列:CLCuV-P;5'FAM-GTTAATGcTTTATATGGcTTGTAcTCcAcGcTAMRA-3" D.3核酸提取 操作方法见C.3
D.4实时荧光PCR反应 反应体系;0.2ml
离心管中加人TaqManPCRMixture10Al,CLCuV-F(10Amol/L)0.4L CICuV-R(10mol/L)0.4l,CICuV-P(10Amol/L)0.4AL,DNA模板2Al,补水至20AL
设置阳 性对照,阴性对照及空白对照
反应程序:95C10nmin;95C15s,62C60s,共40个循环 注:PCR反应体系中各种试剂的量可根据具体情况进行适当调整,也可采用商业化试剂盒
D.5结果判定 在空白对照及阴性对照无Ct值且无扩增曲线、阳性对照Ct值<30并出现典型扩增曲线的条 件下; 待测样品的Ct值之40时,判定CLCuV阴性; -待测样品的Ct值<35时,判定CICuV阳性; 待测样品的35
棉花曲叶病毒检疫鉴定方法GB/T31791-2015介绍
棉花是我国重要的经济作物之一，但也容易受到各种病害的侵袭。其中，棉花曲叶病毒是引起棉花病害的主要病原体之一，可以导致严重的经济损失。
为了加强棉花曲叶病毒的防控工作，国家标准化管理委员会发布了GB/T31791-2015《棉花曲叶病毒检疫鉴定方法》。该标准规定了棉花曲叶病毒的检测和鉴定方法，为我国的棉花生产提供了有力保障。
GB/T31791-2015标准的主要内容包括：
- 术语和定义：明确了标准中所使用的专业术语和定义。
- 样品的采集和处理：对于采样地点、时间、方式和样品数量等进行了具体规定，并详细介绍了不同样品类型（如棉花组织、提取液、土壤等）的处理方法。
- 病毒检测方法：该标准介绍了多种检测方法，包括酶联免疫吸附试验、逆转录聚合酶链反应、核酸杂交等，以及不同方法的优缺点和操作流程。
- 病毒鉴定方法：根据病毒性状、寄主范围、分布地域等特征，将棉花曲叶病毒分为不同种类，并介绍了如何根据病毒形态、组成等特征进行鉴定。
- 结果判定和报告：对于检测结果的判定和报告，GB/T31791-2015也做出了详细规定。
总体来说，GB/T31791-2015标准为棉花曲叶病毒的检测和鉴定提供了科学规范，并充分考虑了不同实际情况下的操作流程和检测方法选择。该标准的实施可以有效地防控棉花曲叶病毒的传播，为保障我国棉花生产安全做出重要贡献。
棉花曲叶病毒检疫鉴定方法的相关资料
- 棉花叶螨测报技术规范GB/T15802-2011解析
- 棉花黄萎病菌检疫检测与鉴定GB/T28084-2011
- 棉花第2部分：皮辊加工细绒棉GB1103.2-2012
- 棉花第1部分：锯齿加工细绒棉GB1103.1-2012
- 棉花原种生产技术操作规程GB/T3242-2012
- 棉花曲叶病毒检疫鉴定方法GB/T31791-2015介绍
- 番茄严重曲叶病毒检疫鉴定方法GB/T36850-2018
- 镁合金压铸安全生产规范GB26488-2011
- 商用车前下部防护要求GB26511-2011
- 进出境货物木质包装材料检疫管理准则GB/T28060-2011
- 鳞球茎花卉检疫规程GB/T28061-2011
- 薇甘菊检疫鉴定方法GB/T28109-2011
- 无损检测射线照相底片数字化系统的质量鉴定第1部分：定义、像质参数的定量测量、标准参考底片和定性控制GB/T26141.1-2010
- 猪流感病毒分离与鉴定方法GB/T27536-2011
- 薇甘菊检疫鉴定方法GB/T28109-2011
- 匍匐矢车菊检疫鉴定方法GB/T28108-2011
- 枣大球蚧检疫鉴定方法GB/T28107-2011
- 棉花曲叶病毒检疫鉴定方法GB/T31791-2015介绍
