国家标准 GB/T38506一2020 动物细胞培养过程中生化参数的测定方法 Determinationofbioehemicalparametersinanimalceleultureproeess 2020-03-06发布 2020-03-06实施国家市场监督管理总局发布国家标涯花管理委员会国家标准
GB/38506一2020 前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC387)提出并归口本标准起草单位:测试技术研究院生物研究所、信达生物制药(苏州)有限公司、华派生物工程集团有限公司、上海市计量测试技术研究院、上海张江生物技术有限公司、四川大学、成都柏奥特克生物科技股份有限公司、上海迈泰君奥生物技术有限公司、泰州迈博太科药业有限公司、上海百迈博制药有限公司本标准主要起草人:周李华、周凯松、宋航、邱文英、李剑凤、刘刚、黄林、马丽侠、李振华、杨坤、李妍、蒋子敬、方鹏飞、崔利凯、郝伟伟,叶德萍,梁智杰张大鹏、张丽燕,郭怀祖,徐进、郭清城、戴建新
GB/T38506一2020 动物细胞培养过程中生化参数的测定方法范围本标准规定了动物细胞规模培养过程中细胞密度、细胞活率,pH值、溶解氧、渗透压、葡萄糖含量、细菌内毒素、乳酸含量的测定方法本标准适用于仓鼠卵巢细胞(CHO)、小鼠骨髓瘤细胞(NsO,SP2/0)、非洲绿猴肾细胞 Vero)、乳仓鼠肾细胞(BHK-21)犬肾表皮细胞(MDCK)、猪睾丸细胞(ST)规模培养过程中生化参数的检测,其他真核细胞规模培养过程中生化参数的检测也可参考使用规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 wS/T350血清葡萄糖测定参考方法药典(2015年版)二部(国家药典委员会) 药典(2015年版)三部(国家药典委员会术语和定义、缩略语 3.1术语和定义下列术语和定义适用于本文件 3.1.1 细胞密度celdensity 细胞通过培养后,单位体积样品中细胞的总数 3.1.2 细胞活率cellviabilty 细胞培养过程中,活细胞数目占总细胞数目的百分比 3.2缩略语下列缩略语适用于本文件 ATP;腺苷三磷酸(Adenosinetriphosphate) NADH;还原型辅酶I烟酰胺腺喋岭二核苷酸,还原态)(Nicotinamideadeninedinueleotide) NAD(P);烟酰胺腺喋岭二核苷酸磷酸(Nicotinamideadeninedinucleotidephosphate) NAD(P)H:还原型辅酶I烟酰胺腺噪吟二核苷酸磷酸，还原态)(Nicotinamideadenine dinucleotidephosphate OPC;开放平台通信(OpenPlatformCommunications) PBS;磷酸盐缓冲液(PhosphateBufferedSaine'
GB/T38506一2020 -般要求 4.1除非另有说明,在分析中仅使用确认为分析纯或药用级的试剂及符合《药典》 2015年版)二部中规定的纯化水或注射用水 4.2试验使用的试剂质量应避免过期造成的试剂性能改变因此测定前应根据试剂说明书或产品质检报告验证试剂质量注:荧光染料,缓冲液等试剂不宜长时间保存台盼蓝会由于错配导致死细胞测量结果过高或过低， 4.3为减少或避免取样可能导致的污染风险,细胞培养过程中各参数测定宜采用在线检测 4.4在线检测时,相关设备应根据生产厂商的安装确认方案、操作确认方案进行确认,并将其形成文件在测定前,生产厂商和/或使用者应进行设备性能确认 4.5在线检测时电极直接插人细胞发酵液中检测,无需取样离线检测时,应按照无菌操作要求进行取样,取样后按照检测参数和检测方法要求,进行离心,稀释等样品处理后立即检测,不能立即检测的样品应放置于2C8C并在不超过6h内检测 S 细胞密度的测定 5.1悬浮细胞密度的测定 5.1.1血球计数法 5.1.1.1原理将待测样品悬浮液置于血球计数板上,于显微镜下直接计数,进而推算出细胞数目 5.1.1.2试剂和材料 PBS缓冲液;可自行配制亦可购买商业化产品 5.1.1.3仪器设备及器具 5.1.1.3.1血球计数板:l6格×25格或25格×16格 5.1.1.3.2倒置显微镜;放大倍数×400 5.1.1.3.3微量移液器:20L一200AL100AL~1000AI 5.1.1.4测定步骤取900AlLPBS缓冲液至离心管中,加人细胞悬液100ML,依次进行10倍系列稀释,取适宜稀释度进行计数,使得细胞数量每大方格为100个300个将盖玻片盖于计数板中心上方,上下吹打,轻轻混匀,用微量移液器将细胞悬液沿盖玻片边缘缓缓加人,不留气泡,不外溢,静置2min3min 在显微镜下对大方格的细胞进行计数,重复计数三次,取平均数注实际检测过程中,可根据预计细胞密度调整所需PIs缓冲液和细胞悬液用量 5.1.1.5结果计算 16格×25格的血球计数板按式(1)计算,25格×16格的血球计数板按式(2)计算 AX10xdx400 N= 00
GB/38506一2020 Ax10'xdx400 N= 80 式中 N 每毫升悬浮液中细胞数,单位为个计数板观察细胞数,单位为个 A 细胞溶液的总稀释倍数计算结果表示为整数 5.1.2自动图像分析法 5.1.2.1 原理将采集的源图像数据进行平滑处理,通过直方图阔值处理,再经过腐蚀去填充孔洞,图像灰度化、对比度增强、边缘检测、二值化变换以及数学形态学和修正一系列图像处理计数和分析,得出细胞的确切数量 5.1.2.2试剂台盼蓝溶液(0.4%,W/);称取4.00g台盼蓝,加少量水研磨,用水溶解后定容至100mL用定性滤纸过滤,，4C存放使用时,用PBs溶液稀释至0.4% 根据需要可直接购买商业化商品 5.1.2.3仪器设备自动细胞计数仪;主要由图像处理系统、图像预处理系统、图像分剐和图像计数四部分组成 5.1.2.4分析步骤启动自动细胞计数仪,设定细胞类型根据仪器的线性范围和上样体积要求取适量细胞悬液加至台盼蓝染料中(细胞悬液和台盼蓝染料按照1;1比例混匀),上下吹打,轻轻混匀取适量样本混合物加至计数池中,按照仪器操作说明,通过高清图像分析系统,自动分析细胞密度、活率及形态注可使用其他等效染料,如嚷幽蓝等 5.1.3电容法 5.1.3.1原理根据测定时的细胞悬液浓度建立细胞悬液浓度与电容值线性关系,计算出K值将常数K值输人在线细胞检测仪检测系统中,得到细胞密度 5.1.3.2设备电容法在线细胞检测仪;测量范围,0pF一400pF;精度,0.01pF 5.1.3.3测定步骤 5.1.3.3.1在线细胞检测仪的电容“0”点校准接通电源,开机稳定30min,将电极放人空白细胞培养液中,并设置合适的温度、搅拌转速以及 pH,各参数需与细胞培养过程中的参数保持一致,待电容数据稳定后进行电容“o”点校准注具体校准操作依据厂家要求进行相应调整 5.1.3.3.2细胞密度与在电容值正相关常数“K”确定向生物反应器内加人细胞培养接种的细胞悬液(其浓度为NM),检测得到细胞电容值尸连续使用
GB/T38506一2020 4个批次细胞悬液浓度与细胞电容值数据统计,统计结果做出线性关系图,绘制标准曲线,根据线性关系结果可得出式(3)中常数K的数值 5.1.3.3.3测定和结果计算将常数K值输人在线细胞检测仪检测系统中,即可依据式(3)在线得到活细胞密度 M=KP .(3 式中 M 细胞悬液密度,单位为个每毫升(个/mL); 细胞电容值,单位为皮法(pF); 细胞密度与电容值正相关常数 K 计算结果表示到小数点后两位 5.1.4拉曼光谱法 5.1.4.1原理单色光照射到样品上后,只与散射分子本身的结构有关对与人射光频率不同的散射光谱进行分析,得到分子振动、转动方面信息,进行分子结构研究和定性定量检测 5.1.4.2设备 5.1.4.2.1拉曼光谱仪,主要由控制系统、激光光源、探头,光学组件和成像系统组成 5.1.4.2.2生物反应器 5.1.4.3测定步骤和结果统计 5.1.4.3.1光强度校正按照仪器操作说明要求,将拉曼探头通过光纤与拉曼光谱仪相连,进行光强度校正 5.1.4.3.2灭菌将校正后的拉曼探头安装在生物反应器上,与生物反应器一起灭菌一次性反应器可直接将探头插在相应孔里面 5.1.4.3.3测定按照仪器操作说明,启动拉曼光谱仪,加人培养基,接种,运行拉曼光谱采集程序,设定曝光时间 10s,扫描75次，一个样品测量大概需要15" min 注:曝光时间和扫描次数可依据不同品牌仪器要求做相应调整 5.1.4.3.4结果统计导人细胞密度数学模型,拉曼光谱仪每测量一次自动将光谱保存在制定文件夹,通过数学模型计算出工艺参数结果,相应结果显示在屏幕上,可通过OPC传输到数据库系统或工艺控制系统 5.2贴壁细胞密度的测定 5.2.1微球载体等作为细胞培养载体的贴壁细胞密度测定用适量消化液(可用0.25%的胰蛋白酶等)消化细胞,使细胞完全悬浮,然后按5.1.1或5.1.2测定
GB/38506一2020 5.2.2片状载体作为细胞培养载体的贴壁细胞密度测定 min60min，用结晶紫染色液完全浸没片状载体,在37裂解30 ,使细胞裂解,然后按5.1.1或 5.1.2测定细胞活率的测定 6.1原理话细胞的细胞膜是一种选择性的膜,只允许物质选择性的通过,而细胞死亡之后,细胞膜受损,通选透性增加根据活细胞和死细胞的细胞膜通透性差异,加人染料后,死细胞着色,活细胞不着色,从而可得出活细胞数目占总细胞数百分比 6.2试剂和材料同5.1.1.2和5,1.2.2 6.3设备同5.1.1.3 6.4测定步骤和结果计算吸取适量细胞悬液,加人0.4%台盼蓝溶液,使得台盼蓝终浓度为0.04%,在3min内按5.1.1或 5.1.2进行计数,被染色成蓝黑色的细胞计为死细胞数D 细胞活率按式(4)计算 D X ×100% 式中: x 细胞活率; 细胞总数,单位为个; C 死细胞数,单位为个计算结果表示到小数点后两位 pH的测定 7.1原理通过测量细胞培养液中氢离子活性,根据能斯特方程,离子活度与电极电位成正比,对待测细胞悬液建立起电极电位与活性的关系曲线,得出待测细胞培养液酸性、中性和碱性的数值 7.2试剂 pH校准液;可根据需要选择不同pH校准液注:pH校准液可用pH4.01标准缓冲液(邻苯二甲酸氢钾),pH7.00标准缓冲液(混合磷酸盐)和pH9.18标准缓冲液(棚砂)等 7.3设备 7.3.1在线pH电极以及离线台式pH计;精度0.1 7.3.2微量移液器:20Al200AL100L~1000L
GB/T38506一2020 7.4测定步骤 7.4.1总则 pH在线检测可与离线检测同时进行,离线检测的结果可用于在线检测结果的复核、校准 7.4.2在线检测在线检测前,需对pH电极进行校准,校准完成后将电极安装到反应器,再进行检测 7.4.3离线检测离线检测前,应对离线pH计进行校准取5ml10mL细胞培养液至15ml离心管中,按《中华人民共和国药典2015年版)三部中的物理检查法(通则0631)进行检测检测过程中避免晃动培养液在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的5%,否则,应重新测定;所取样品应及时检测,避免长时间暴露空气中,导致样品pH变化带来的测量误差 7.5结果计算检测后直接读数计算结果表示到小数点后两位 8 溶解氧的测定 8.1原理氧透过隔膜被工作电极还原,产生与氧浓度成正比的扩散电流,通过测量此电流,得到细胞培养悬液中溶解氧的浓度溶氧检测离线后偏移较大，一般采用在线检测 8.2设备在线溶氧电极 8.3测定步骤 8.3.1仪器校准使用溶氧电极对培养过程中溶解氧进行在线实时测定在检测前需对安装溶氧电极的设备进行灭菌灭菌结束后需根据培养条件设定起始培养参数,控制稳定后维持溶氧电极活化2h以上再进行校正根据不同厂家和型号要求,可进行100%一点或0,100%两点校准 8.3.2测定灭菌、校准完成后,按照仪器操作说明设定条件,实时监测细胞培养过程中培养液的溶解氧含量样品在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值未超过算术平均值的5%,否则,应重新测定 8.4结果计算在线检测后直接读数计算结果表示到小数点后两位
GB/38506一2020 渗透压的测定 9.1原理根据溶液的渗透压摩尔浓度与冰点温度下降值呈线性关系为基础,测量溶液的冰点来测定溶液渗透压 9.2设备冰点渗透压仪 g.3测定步骤渗透压采用离线检测取2nml细胞悬液,150片300片离心5min10min,取上清液按《中华人民共和国药典2015年版)三部中的物理检查法(通则0632)渗透压摩尔浓度测定法进行测定在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的5%,否则,需重新测定 g.4结果计算按《药典》2015年版)三部中的物理检查法(通则0632)计算结果,结果表示为整数葡萄糖的测定 10 10.1原理在己糖激酶催化下,葡萄糖和ATP发生磷酸化反应,生成葡萄糖-6-磷酸在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶催化下脱氢.生成6-磷酸葡萄糖酸,同时使NAD(P)还原成NAD(P)H.在NAD(P)转化成NAD(P)H的同时,伴有340nm处摩尔消光系数的上升,摩尔消光系数变化与葡萄糖含量成正比,通过检测339nm 处的摩尔消光系数即可测定细胞悬液中葡萄糖含量 10.2试剂 0.2.16-磷酸葡萄糖脱氢酶试剂 10.2.20.11mol/L饱和Ba(OHI)溶液 1.5%TieHcI原液 10.2.3 1.2%TrisBase原液 10.2.4 10.2.50.2%Tris-白蛋白原液 10.2.61g/I安息香稀释液 10.2.722g/儿LZnso溶液 10.2.810g/L葡萄糖标准原液;精密称取105C干燥至恒重的葡萄糖标准品1.,00g,溶解稀释后定容于100ml.容量瓶中 10.2.90.5%酚献指示剂;精密称取0.5《酚酣,用无水乙醉溶解,定容至100ml 亦可购买商业化产品 10.3设备 10.3.1紫外可见分光光度计
GB/T38506一2020 10.3.2微量移液器;20lL~200L,100AL1000L 0.3.3天平;感量0.01g 10.4测定步骤取2ml细胞培养液,150g300离心10min,取上清液按照wS/T350的方法或使用生物传感器进行检测在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的5% 否则,需重新测定 0.5结果计算计算结果表示到小数点后两位细菌内毒素的测定 11.1原理当细菌死亡或自溶后便会释放内毒素,通过用监试剂与细菌内毒素产生凝集反应来定性检测或半定量检测细菌内毒素 11.2试剂凝胶法欲试剂 11.3设备 11.3.1恒温箱 1.3.2微量移液器;20AL200l、,100儿L~1000AL 11.3.3旋涡混合器 11.4测定步骤取2mL细胞培养液,150g一300离心5nmin~10min,取上清液按照《药典》 (2015年版)三部中的微生物检查法(通则1143)细菌内毒素检查法进行 11.5结果计算按照《药典)(2015年版)三部中的微生物检查法(通则1143)计算结果,计算结果表示到小数点后一位乳酸含量测定 12 12.1原理乳酸在乳酸脱氢酶的作用下生成丙酮酸,同时使烟酰胺腺喋岭二核苷酸还原生成NADH和H 检测生产底物计算发酵液中乳酸含量 12.2试剂乳酸检测试剂盒或设备,不同检测设备配套不同试剂
GB/38506一2020 12.3设备根据检测机理不同,所用设备包括生化分析仪,分光光度计等 2.4测定步骤取适量细胞培养液,l50g300g离心l0min,取上清液按试剂盒或设备操作说明进行检测在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的5% 否则,应重新测定 2.5结果计算按试剂盒说明书计算结果,计算结果表示到小数点后两位 3试验报告试验报告应包括如下内容试样名称; a b细胞类型; 试样编号 c d)技术依据; 主要仪器设备; e 测试参数 f 试验温度、环境; g hh) 测试日期、试验人员

动物细胞培养中生化参数的测定方法GB/T38506-2020

引言

动物细胞培养已经成为现代生命科学研究中不可或缺的技术手段。在动物细胞培养过程中，各种生化参数的测定对于了解细胞状态、判断培养环境是否适宜以及评估细胞生长情况等方面都具有重要作用。

GB/T38506-2020标准简介

GB/T38506-2020标准是我国针对动物细胞培养中生化参数测定制定的新标准。该标准旨在规范动物细胞培养中生化参数的测定方法，提高测定结果的准确性和可比性。

GB/T38506-2020标准中的生化参数

GB/T38506-2020标准中规定了以下生化参数的测定方法：

细胞数量：采用显微镜计数或涂片法计数
细胞存活率：采用染色或不染色方法测定
酸碱度：使用pH计或酸碱指示剂测定
溶氧量：使用溶氧电极测定
营养物质含量：包括葡萄糖、乳酸、氨基酸等，采用分光光度法或高效液相色谱法测定
代谢产物含量：包括乳酸、尿素、乙酸等，采用分光光度法或高效液相色谱法测定

实验操作步骤

根据GB/T38506-2020标准，进行动物细胞培养中生化参数的测定需要按照一定的操作步骤进行。

准备培养物质和实验仪器
收集细胞样本
细胞数量和存活率的测定
酸碱度和溶氧量的测定
营养物质含量和代谢产物含量的测定
数据处理和结果分析

总结

GB/T38506-2020标准中规定的动物细胞培养中生化参数的测定方法，为动物细胞培养过程中的实验操作提供了具体的指导和参考。在进行动物细胞培养时，科研人员应该严格按照标准要求进行生化参数的测定，以确保实验结果的准确性和可靠性。同时，在实验操作中也应注意安全，避免对人体造成伤害。

本文详细介绍了GB/T38506-2020标准中动物细胞培养中生化参数的测定方法，希望能够为相关科研人员提供参考，并促进动物细胞培养技术的发展。