蜂王浆中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定液相色谱-质谱/质谱法

蜂王浆中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定液相色谱-质谱/质谱法

国家标准 GB/T2340g一2009 蜂王浆中土霉素、四环素、 金霉素、强力霉素残留量的测定 液相色谱-质谱/质谱法 Determinationofresiduesofosytetraeyeline，tetraeyeline chlortetracycline，anddoxycyclineinroyaljelly LC-MS/MSmethod 2009-03-28发布 2009-07-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管蹬委员会国家标准
GB/T23409一2009 前 言 本标准的附录A、附录B和附录C为资料性附录 本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口 本标准起草单位;江苏出人境检验检疫局 本标准主要起草人:徐锦忠、丁涛、张晓燕、魏云计,章宇、刘艳、李丽花、吴斌、蒋原、陶宏锦
GB/T23409一2009 蜂王浆中土霉素、四环素、 金霉素、强力霉素残留量的测定 液相色谱-质谱/质谱法 范围 本标准规定了蜂王浆中四环素、土霉素、金霉素、强力霉素残留量的液相色谱-质谱/质谱测定方法 本标准适用于蜂王浆中四环素,土霉素,金霉素,强力霉素残留量的测定 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682一2008,ISO3696:l987,MOD) 方法提要 试样用提取液提取后,调节溶液的pH值,用固相萃取柱萃取,洗脱液浓缩后用甲醇水溶液定容,液 相色谱-串联质谱仪测定,外标法定量 试剂和材料 除非另有说明,所有试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水 甲醇;色谱纯 4.2甲酸;色谱纯 4.3三叙乙酸 4.4氢氧化钠 4.5甲脖-水:(2十8.,体积比);量取20mL甲醇(4.1)与80ml水混合 4.6甲脖-水:(3十7,体积比);量取30nl甲醇(4.1)与70ml水混合 4.71%三氯乙酸水溶液;称取10g三叙乙酸于200ml水中,溶解后,加水至1L 4.81.0mol/L磷酸氢二钠水溶液;称取358g磷酸氢二钠(NaHPO12H.O)于600ml.水中,溶解 后,加水至1L 四环素Tetracycline,CAs号:64-75-5、土霉素Oxytetracy ycline,CAs号;2058-46-0)、金霉素 (Chlortetraeyehine.,CAs号，57-625)、强力霉素Doxyeye cline,CAs号:24390-14-5标准物:纯度 95% 4.10四环素、土霉素,金霉素,强力霉素药物标准储备溶液;1.0mg/ml 准确称取适量的四环素、土 霉素,金霉素、强力霉素药物标准物质,用甲醇配成1.0mg/mL的标准储备液 储备液贮存在一18C 冰柜中,可使用6个月 4.11空白样品提取液;用不含四环素类药物残留的样品,按照7.1制备空白样品溶液 4.12四环素、土霉素,金霉素,强力霉素药物标准工作溶液:用空白样品提取液(4.1l)分别配成四环 mL 素、土霉素、金霉素、强力霉素药物浓度为5ng/ml、10ng/ml、20ng/mL、50ng/ml、100ng/" /ml标准工作溶液,标准工作浴液在4C保存,现用现配 200 ng
GB/T2340g一2009 4.13聚苯乙烯毗咯婉酮填料固相萃取柱或相当者:60mg,3mL 使用前分别用5mL甲醇和5mL 水预处理,保持柱体湿润 滤膜:0.45Am,水相 4.14 仪器与设备 5.1液相色谱-质谱仪(串联四极杆);配有电喷雾离子源 5.2分析天平;感量分别为0.lmg和0.0lg 5.3自动浓缩仪或相当者 5.4液体混匀器 5.5真空泵;真空度大于或等于80kPa 5.6移液器l0ml 5.7离心管;50mL,具塞 5.8刻度离心管;10 ml 5.9离心机;8000r/min. 试样的制备与保存 6 试样的制备 将实验室样品,自然解冻至室温,搅拌均匀,分出0.5kg作为试样 制备好的试样置于样品瓶中， 密封,并做上标记 在制样的操作过程中,应防止样品污染或发生残留物含量的变化 试样的保存 贮存在一18C冰柜中 测定步骤 提取 称取2g试样(精确到0.001g),置于50ml具塞离心管中,加人15ml1%三氯乙酸溶液(4.7). 于液体混匀器上快速混合2min,6500r/min离心5min,取10ml上清液,用1mol/LNaHPO,(4.8) 调节pH值为6.07.0 将溶液以1mL/min左右的流速通过固相萃取柱,待溶液完全流出后,用 5ml水洗离心管并过柱,然后再用5ml甲醉水(4.5)洗柱,弃去全部淋出液 在65kPa的负压下,减 压抽干10min,最后用5ml 甲醇(4.1)洗脱,收集洗脱液于10mL刻度离心管(5.8)中,于50C用氮气 吹干仪吹干,用甲醇-水(4.6)定容至1.0mL,过0.45Am的滤膜(4.14)到进样瓶中,供液相色谱-质谱 仪测定 7.2测定 7.2.1液相色谱条件 色谱柱;高纯硅胶Ca柱，5m，I50mmX2.1mm(内径)或相当者 a) 流动相.0.1%甲酸水溶液十甲醇,梯度参见附录A b) e)流速:0.25mL/min: 柱温:室温 d) eo 进样量;25L 7.2.2质谱条件 参见附录B 7.2.3液相色谱-质谱测定 四环素、土霉素,金霉素,强力霉素药物标准工作溶液(4.12)在液相色谱-质谱设定条件下分别进 样,以样品峰面积为纵坐标,工作溶液浓度(ng/mL)为横坐标,绘制6点标准工作曲线,用标准工作曲线 对样品进行定量,样品溶液中四环素、土霉素、金霉素、强力霉素药物的响应值均应在仪器测定的线性范
GB/T23409一2009 围内 在上述色谱条件下,药物参考保留时间分别为四环素5.82min,土霉素6.05min,金霉素 6.96min，强力霉素7.75 谱图参见附录C mIn 7.2.4阳性样品的确证 按照上述(7.2.17.2.3)条件测定样品和标准工作液,如果检测的质量色谱峰保留时间与标准工 作液一致,允许偏差小于士2.5%;定性离子对的相对丰度与浓度相当标准工作液的相对丰度一致,相对 丰度偏差不超过表1的规定,则可判断样品中存在相应的被测物 表1定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 >50% >20%50% >l0%20% 10% 允许的相对偏差 士20% 士25% 士30% 士50% 7.3空白试验 除不称取试样外,均按上述(7.17.2)步骤进行 结果计算 结果按式(1)计算 c;一co×V X m×100o 式中: 试样中被测组分残留量,单位为毫克每千克(mg/kg); X 由标准曲线而得的样液中药物的含量,单位为纳克每毫升(ng/mL); 由标准曲线而得的空白试验中药物的含量,单位为纳克每毫升(ng/mL); cor -样品溶液定容体积,单位为毫升(mL); 样品溶液所代表试样的质量,单位为克(g). 测定低限和回收率 9 测定低限 本标准测定低限;四环素,土霉素,金霉素,强力霉素均为0.005mg/kg 9.2回收率 回收率见表2 表2土霉素、四环素、金霉素、强力霉素添加浓度及其回收率范围的试验数据 药物名称 添加浓度/(mg/kg) 回收率范围/% 0.005 85,2~114.4 0.010 93.6120.2 土霉素 0.040 88.6120.8 0.005 92.2~115.4 四环素 0.010 76.4一103.0 0.040 73.5~100.1 07.0~123.6 0.005 金霉素 0.010 86.6~102.6 0.040 71.389.8 0.005 80,8l15,2 强力霉素 65.876.9 0.010 0.040 71.8100.6
GB/T2340g一2009 附 录A 资料性附录 液相色谱-质谱/质谱法梯度洗脱条件 表A.1液相色谱梯度洗脱程序 时间/min 流速/mL/min 甲醇/% 0.1%甲酸/% 8C 0.25 20 0.25 5.00 95 7.00 0.25 95 7.1o 0.25 20 80 2d 9.00 0.25 80
GB/T23409一2009 B 附 录 资料性附录 质谱条件及选择反应监测条件 表B.1质谱条件 电离方式 ESI+ 毛细管电压 4.5kV 源温度 350C 氮气,0.060MPa 气帘气 辅助气流 氨气,5. 0L/h 扫描时间 0.1s 缸气，0.2Pa(1.50mTor 碰撞气 监测模式 选择反应监测SRM 表B.2选择反应监测条件 药物名称 定性离子对(m/z 定量离子对(m/z 碰撞气能量/八V 461/426 18 土霉素 461/443 461/426 25 461/337 445/4l0 18 445/427 四环素 445/427 479/44 2 金霉素 479/462 18 479/462 15 445/428 强力霉素 445/428 445/410 27
GB/T2340g一2009 c 附 录 资料性附录 标准物质色谱图 保图时间:5.82 0 0 w3 四环素 9 加 保留时间6.05 100- 890 60- 土霉素 40- 0 保留时间6.96 100 80 60- 金霉素 40- 唱 保留时间:7.75 100 80 60 强力霉素 40- 20 奔爷 /min 图C.1四环素、土霉素、金霉素、强力霉素药物标准物质分离子流图