国家标准 GB/T28068一2011 柑桔溃疡病菌实时荧光PCR检测方法 DetectionofXanthomonaseitrisubsp.citriusingthereal-timme fluorescentPCR 2011-12-30发布 2012-06-01实施国家质量监督检监检疫总局发布国家标准花管理委员会国家标准
GB/T28068一2011 前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口本标准起草单位;重庆大学,农业部农业技术推广服务中心、北京出人境检验检疫局本标准主要起草人王中康股幼平、王福祥、高文娜、夏玉先、李正国、曹月青
GB/T28068一2011 柑桔溃疡病菌实时荧光PCR检测方法范围本标准规定了柑桔溃疡病菌(Xanthomomascitrisubsp.ciri,xcc)的实时荧光PCR检测的样品制备、检测技术、操作方法及结果判定标准本标准适用于柑桔植物材料中柑桔溃疡病菌的实时荧光PCR检测和病害鉴定规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB5040柑桔苗木产地检疫规程 GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求术语和定义下列术语和定义适用于本文件柑桔溃疡病eitruseankerdisease 由柑枯溃疡病菌引起的国内外柑桔检疫性细菌病害症状特征表现为柑桔叶片,枝条和果实表面出现隆起的木栓化溃疡病斑,造成柑桔落叶落果,树势衰弱,严重影响柑桔产量与果品外观质量柑桔溃疡病菌Xanthononaseilrisubsp.citri 指引起亚洲型柑桔溃疡病的病原细菌,为黄单胞菌属的柑桔黄单胞柑桔亚种新组合(Schaad2006 Young2008) 实时荧光PCRreal-timefluorescentPCR 实时荧光聚合酶链式反应，一种在体外扩增微量的特殊DNA片段的方法,在扩增过程中由于荧光物质的释放并被实时检测而能够快速、灵敏地检出模板DNA的存在扩增引物primer 人工合成的寡核苷酸序列,其序列与待扩增的目标DNA序列中的一段相同,用于引导DNA体外扩增 3.5 扩增模板templet DNA体外扩增中所用的待扩增的粑标序列 Ct值eyelethresholdvalue 实时荧光PCR反应中每个反应管内的荧光信号达到设定阀值时所经历的循环数
GB/r28068一2011 柑桔溃疡病菌重组质粒利用特异性引物扩增柑桔溃疡病菌(Xa anhomonascitrisubsp.citri)基因组模板,获得的柑桔溃疡菌特异性DNA扩增序列构建重组质粒,将该重组质粒转导到大肠杆菌JM109菌株中繁殖培养后,重新提取出获得的质粒DNA 用于作为柑桔溃疡病菌检测的阳性对照柑桔溃疡病菌基本信息拉丁学名;柑桔黄单胞菌柑桔亚种Xanhomonascitrisubsp.citriGabrielet.al(1989) 病害名称;柑桔溃疡病citruscancerdisease 分类地位;假单胞菌科Pseudomonaceae,黄单胞菌属Xanthomonas,柑桔黄单胞Xanthomonas [Gabrielet.al(1989)] citr 主要分布于亚洲的,印度和东南亚,美洲的美国、巴西、乌拉洼、巴拉洼和阿根廷等国家和地区葡萄柚,甜橙、柠檬,莱檬,柑桔和枞等柑桔种和品种带菌种苗,接穗及商品果实是远距离传播的主要途径;田间则主要由夹风雨和农事操作传播柑枯溃扬病菌其他信息参见附录A 利用柑桔溃疡病菌亚种通用引物对xceF05/XeeR05,以常规PR方法可以检测出柑桔材料中柑桔黄单胞柑桔亚种(A菌系)和褐色黄单胞莱檬亚种(BC/D菌系)(检测引物、检测方法及结果判定参见附录B) 方法原理本标准采用的实时荧光PCR检测包括了荧光染料法和荧光探针法两种检测方法其原理是,利用病菌特有DNA序列设计引物,在PCR扩增时加人荧光染料,荧光染料与扩增形成的产物-DNA双链结合而发出荧光被检测器实时检测(荧光染料法),或在合成特异性引物的同时合成一条特异性的荧光双标记探针,探针5'端和3’端分别标记荧光素报告基团和淬灭基团,如果反应体系中存在待测目标DNA 模板,引物和探针则与模板上的序列配对而特异性结合,当PCR扩增延伸到探针结合部位时,Tag DNA聚合酶将探针水解成单核苷酸,使标记在探针上的报告基团游离出来并发出荧光信号被检测器实时检测(荧光探针法) 由于初始模板量的不同,反应管内的荧光物质达到设定的可检测闵值时所经历的Ct值不同,因此Ct值可以用于判定检测样品的初始菌量实验室设置柑桔溃扬病菌PCR检测实验室主要参照GB/T19495.2设置与管理检测实验室应至少分为三个相对独立的工作区域;样本制备区、反应试剂配制区和检测区;每个工作区域应有明确标记,避免不同工作区域内的设备、物品混用材料与试剂 7.1仪器与器材 7. 1.1实时荧光PCR仪高速台式离心机生物安全柜或超净工作台
GB/T28068一2011 冰箱(冷藏室4C和冷冻室一20C) 7.1.5涡旋混匀仪刀.1.6紫外灭菌灯刀.1.7微量可训移被器(0.5AL一10L..0,l~10AL.I00儿-100AL 7.1.8带谴芯Tip头 Z1.R反应管0.2nml.八联管》 .1.10微滤柱 " 高压灭菌锅 7.2试剂 7.2.1磷酸二氢钠(NaHPOH.O) 7.2.2磷酸氢二钠(Na,HPO7H.O). 7.2.3三胫甲基氨基甲婉(Tris). 7.2.4 二胺四乙酸(EDTA. 乙 7.2.5实时荧光PCR混合试剂(Real-timePCRMasterMix) 采样及样品处理 8.1采样及样品处理工具 8.1.1样品袋;牛皮纸袋或信封(一次性使用 8 1.2枝剪 8.1.3剪刀,锻子 8.1.4塑料离心管(1.5mL,50mL) 8.1.2一8.1.4的取(制)样工具应经121C士2C,15min高压蒸汽灭菌田间取样每个样品采集后或实验室处理每个不同样品后,工具应用70%酒精棉球擦拭2次以上,以避免样品间相互污染 8.2取样方法 8.2.1田间采集田间实地取样参照GB5040. 取带有柑桔疑似溃疡病病斑的柑桔叶片、嫩梢和果实样品(柑桔溃疡病症状特征参见附录A) 口岸检疫及调运检疫抽样 8.2.2 种苗抽取显现疑似症状植株或随机抽取植株(无症材料)10株,每株取叶片5片,共50片;接穗等材料则随机直接抽取10份材料;商品果采集带有疑似病斑的果实样品采集后立即装人样品袋按规定编号密封后,做好相关记载,包括样品品种、目测症状,采样人,采集地,采集时间等及时寄送检测实验室 8.3样品存放采集的植物材料若需短暂保存,应置于4C条件下,可保存1周检测后余下的植物材料应置于条件下保存7d,以备复测的需要 8 样品DNA制备操作样品DNA制备在检测实验室样品制备区进行所制备的DNA样本在4C条件下保存应不超过
GB/r28068一2011 7d,在一20C冻存不超过30d,避免反复冻融样品制备的具体操作过程见附录C PCR检测操作所用引物对与探针荧光染料法PCR检测所用特异性引物对cQUXccF02/cQUXccR02,序列为cQUXccF02 5'-ACGAGAAAGAACTTcGCccC-3',cQUXccR02:5'-TCTGACCACATcGCATAGGA-3' 荧光探针法PCR检测所用特异性引物对cQUXccF06/CQUXccR06,序列为CQUXccF06. 5'*-GCGGCTATTGGcTGACTTCA-3'和cQUXccR06;5'-GTAGGGcGGACCTTGGGAT-3” 荧光标记探针CQUXccP1,序列为5’-TcCCTCCATAACGAACTcCGCAAGGCACG-3” 9.2扩增准备 rR扩增反应体系为25,AL 准备R扩增反应管,分别加人反应液2aL.,最后加人制备的待测样品2aL 每个样品设置3次重复每次PCR检测应设立相应的阳性对照、阴性对照和空白对照 9. 3 扩增过程扩增过程中,设置每次循环的延伸阶段采集荧光荧光染料法检测应在扩增结束后立即进行熔解曲线分析,以验证扩增的特异性熔解曲线的反应程序为;97,1nmin;57C,1min;从57开始每升高0.5保持10s,连续升高80次到97g 为止) 检测结束后,根据采集的荧光曲线和ct值判定结果实时荧光PCR扩增的准备及扩增具体操作过程见附录D(不同PCR仪具体程序参数可能稍有调整) 推荐使用柑桔溃疡病菌实时荧光PCR检测试剂盒试剂盒组成、功能及使用注意事项参见附录E 结果判定及描述 10 10.1结果分析条件设定直接读取检测结果值设定原则根据仪器噪声情况自动调整,以值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准 10.2质控标准 10.2.1阴性对照及空白对照无C值并且无扩增曲线否则,此次检验视为无效 10.2.2阳性对照的C值应<28.0,并出现典型的上升扩增曲线杏则,此次检验视为无效阴性 10.3 测试样品检测无Ct值和扩增曲线,且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常,判定该样品为阴性,表示样品中无柑桔溃疡病菌 10.4阳性测试样品检测C值<35,出现典型的扩增曲线,且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常,判定
GB/T28068一2011 该样品为阳性,表示样品中存在柑桔溃疡病菌 10.5其他情况 Ct值大于36的样品,建议重做实时荧光PCR扩增,扩增结果按上述标准判定扩增结果Ct值若仍大于36,结果判定为阴性
GB/r28068一2011 附录A 资料性附录柑桔溃疡病症状及病原菌的名称及鉴别特征比较 A.1分类命名 A.1.1概要柑桔遗扬病是由柑枯黄单胞细菌引起的柑精重要检疫性病害;主要随惜菌苗木或接穗远距离传播随夹风雨溅射在田间扩散近年来,柑桔溃疡病菌的分类地位和命名变动较大,原来的柑桔溃疡病菌的A,B/C/D和E菌系，依据16SrRNA基因、多基因分类新方法和培养特征等综合分类方法已经归人三个不同的细菌种下的三个亚种;柑精黄单胞柑枯亚种(A菌系),褐色黄单胞莱檬亚种(/D菌系)和首瘤黄单胞积袖亚种 E菌系 A.1.2柑桔黄单胞柑桔亚种(Xanthomnaseitrisubsp.citri 原称为A系的柑桔黄单胞柑桔亚种(Xanthomnascitrisubsp.eitri),是依据N.w.Schaad(2006) 相J.M.yosx(o8的黄单胞属最新分类命各的调整确认,是分布最广,危害最重的一种柑精遗疡树的检疫性细菌,可以侵染芸香科柑桔属、积属的大部分柑桔种类病菌在血清学,DNA-DNA复性测定、,ITs测序,rep-PCR和培养特征等方面都不同于其他黄单胞属的细菌 A.1.3褐色黄单胞莱檬亚种(X.fuscanssubsp.auranifoli 根据DNA-DNA复性测定和多基因测序的相似率,把仅引起南美的墨西哥莱檬、柠檬、酸橙和柚子溃疡病的原B/C/D菌系归人褐色黄单胞莱檬亚种(Xanthomoasfuscanssubsp.awrantifo/i). A.1.4首黄单胞积柚亚种(X.alfalfaesubsp.citrumelonis) 原柑精溃疡病菌E菌系,引起美国佛州柑桔苗的柑桔斑点病现依据病害症状、同工酶谱带等不同于柑精里种的特征.,归人到首瘤黄单慰炽帕亚种x.alae.swhp.“ citrumelonis 柑桔溃疡病症状 A.2.1主要症状柑桔溃扬病菌可以侵染柑桔叶片,枝条和果实等地上部分主要症状特征为产生两面木栓化病斑中心突起呈火山口状 A.2.2叶片症状叶片初始病斑呈圆形、微突起、半透明脓泡状;病斑两面隆起、圆形或近圆形,周围大多有黄色晕圈和袖圈;老病斑木栓化,表面粗糙开裂呈火山口状,晕圈不明显;病斑单生,严重时愈合成片在潜叶蛾危害的伤口处往往成片发生[图A.l)] 与柑桔疙痴病等叶部类似症状的区别在于受害叶片仪一面出现隆起的近圆锥形病斑,另一面凹陷病斑较多时,叶片扭曲畸形,病斑周围仅有黄色晕圈而无袖圈
GB/T28068?2011 ???? ??? ????? b ?A.1?????? A.2.3??? ?,??,?????,?л??[?A.l1b] A.2.4??? ??л??,??????,???財?? ????,?[?A.lc)] A.3? ????????A.1 A.1??????? ?citrusbacterialcanker ????(CBS) A B/C/D ?? ?? ???? ?? Xanthonasfuscans Xanthomoasalfalfae" Xanthomonaseilrisubsp. subsp.auranifoliGabrielet subsp.Cilromelonis CitriGabrielet.al1989 al.,(1989) Gabrielet.al.,(1989 ??; ? ?? ī ?????? Χ ,,,? ,?ī γ?С; γС??;γ ???,???? ????, ?? ???,???,? ????,Χ ???? ?,???? ?? YDc,28C?30C YDc,28C?30C YDc,28C?30 40h44hγ?;56h60hγ?,?30h34hγ? ??? ??? ,????
GB/r28068一2011 表A.1(续) 柑精溃疡病eitrusbacterialcanke" 病害名称柑精斑点病(CBS) A型溃疡梢 B型/C型/D型溃疡病利用麦芽糖,阿拉伯糖,不能不能利用麦芽糖,可沉淀石蕊能利用菊糖,使纤维二利用菊糖;可碱性水解石蕊牛牛乳,不能水解酪糖、甘露醇产酸乳,可水解酪肮鉴别特征对CPl,CP2噬菌体不对CPl,CP2噬菌体敏感对cP.CP2噬菌体不敏感敏感与柑桔亚种抗体血清学反应与柑桔亚种抗体血清学血清学反应呈阳性有差异反应呈阴性
GB/T28068一2011 B 附录资料性附录柑桔溃疡病菌柑桔亚种和褐色亚种的常规CR检测 B.1采样及样品制备同柑桔溃疡病实时荧光PCR B.2CR扩增 B.2.1扩增引物根据柑桔溃疡病菌专有的保守蛋白基因设计通用引物对XceF05/XceR05,序列分别为5'-TTc GGCGTCAACAACCTG3’/5'-AACTCCAGCACATAcGGG;TC-3'(扩增柑桔溃疡病菌保守蛋白基因序列413bp) 用无菌超纯水配制25Amol/L母液 B.2.2扩增体系配制常规PCR反应液,25AlL 反应体系,各种成分终浓度为 Mg2 2mmol/L dNTP 200丛mol/1 Taq酶 1U/25AL 引物各 0,5mol PCR缓冲液(pH9.1) 1X B.2.3加样取PCR反应管,每管中加人PCR反应液234L,再分别加人2L待测样品浸出液同时以新鲜制备的阴性对照,阳性对照和空白对照2AL/每管代替待测模板作为对照盖紧管盖,3000g瞬时离心以混匀并去除气泡;转移至PCR,扩增区 B.2.4PCR扩增设置好各反应管在定量PCR仪上的孔位并做好标记记录,按照预设孔位将各检测样品及对照放人常规PCR检测仪内进行PCR扩增扩增程序为(不同PCR仪可能稍有差异 95C裂解变性 44 min 94CDNA变性 30 s 58C退火 0 35次循环 s 72C延伸 30 s 72C延伸 7minm B.3扩增产物检测 PCR反应结束后,各反应管取10L扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,另一泳道加DNAMarker
GB/r28068一2011 100bpDNALadder) 100V电压下电泳30min. 电泳后的凝胶经GoldViewer荧光染料染色后,在凝胶成像系统上观察分析并拍照电泳结果 B.4结果判定 B.4.1质控标准阳性凝胶图像阳性对照出现413p左右特征性扩增条带,阴性对照,空白对照无此条带 B.4.2阳性凝胶图像样品泳道中出现413p左右特征性扩增条带,阳性对照,阴性对照,空白对照正常,判定样品为阳性,表示样品中带有柑桔溃疡病柑桔亚种或褐色亚种 B.4.3阴性凝胶图像样品泳道中没有特异扩增条带,阳性对照,阴性对照,空自对照正常,判定样品为阴性,表示样品中不带可检出的柑桔溃疡病柑桔亚种和褐色亚种 10
GB/T28068一2011 附录 c 规范性附录柑桔溃疡病菌检测试剂配制和样品制备 C.1样品制备试剂 C.1.10.01mol/L磷酸缓冲液(pH7.2PBs缓冲液 A液;0.2mol/1磷酸二氢钠水溶液,NaHPOH.O27.6g,溶于蒸憎水中,定容至1000mL B液:0.2nmol/L，磷酸氢二钠水溶液,Na,HPO7H,O53.6g,或Na;HPO12H,O71.6g,或 NaHPO2H.035.6g)加蒸馏水溶解,定容至1000ml 将0.2mol/儿A液14mL与0.2mol/儿B液36ml混合均匀即成0.01mol/儿磷酸缓冲液 C.1.2IE缓冲液取0.1mol/儿LTris-HCl(pH7.4)20ml,加人0.5mol/LEDTApH8.040mL.,用灭菌超纯水定容至200mL,4C保存 C.2样品制备 C.2.1工作台及操作者消毒灭菌样品处理在超净工作台或生物安全柜中进行工作台和操作者双手应消毒灭菌 C.2.2疑似症状柑桔样品制备切取柑桔组织表面的溃疡病疑似病斑,放人1.5mL微量离心管中,加人PBS液500AL,室温条件下浸泡20 min,经8000g离心5min,弃去上清液,以试管底部残液(约100AL)直接作为待测模板 C.2.3无症柑桔样品制备对需检测的无症材料,取植物组织5g~10g,用10ml一20mlPBS液浸泡,150r/min富集振荡培养1h~1.5h,10000离心5min,弃去上清液,以试管底部残存液(约500AL)经微滤柱过滤,以 200MLTE缓冲液再次洗涤离心,去滤液最后以100AL.TE缓冲液将滤膜上的菌体洗脱,洗脱液作为待测模板 C.2.4阳性对照配制按照C.2.2方法以典型柑枯溃疡病病斑制备浸出液,或经致病性验证的柑枯溃疡病菌纯培养,或以柑桔溃疡病菌特异DNA序列无害化重组质粒DNA作为阳性对照 c.2.5阴性对照按照c.2.3方法制备健康柑桔植株叶片浸出液作为阴性对照 1
GB/r28068一2011 附录D 规范性附录柑桔溃疡病菌CR检测操作程序 D.1扩增试剂配制在反应试剂配制区进行 D.1.1用无菌超纯水配制25mol/L柑桔溃疡病菌特异性引物对母液(用于荧光染料法,引物序列为 CQUXccF02;5'-ACGAGAAAGAACTTcGcccC-3',cQUXceR02;5’-TCTGACCACATcGCAT AG;GA-3',扩增柑桔溃疡病菌特异性基因序列为278bp) D.1.2用无菌超纯水配制25Amol/L柑桔溃疡病菌特异性引物对CQUXccF06/CQUXccR06母液用于荧光探针法,引物序列为cQUXccFO65'-GCGGCTATTGGCTGACTTCA-3'和cQUXce R06;5'-GTAGGGcGGACCTTGGGAT-3',扩增柑桔溃疡病菌特异性基因序列为119bp) D.1.3以无菌超纯水配制25mol/L荧光标记探针cQUxceP1母液(序列为5’-TccTcCATAAC GAAcTcGCAAGGCcAcG3') D.2加样(反应体系为25HL D.2.1方法1试剂盒方法(推荐方法从固相化试剂盒中取出0.2mL.PCR固相化试剂检测管,管中分别加人23L样品恢复液,再在不同管中分别加人2L待测样品DNA液、阳性对照、阴性对照、空白对照(灭菌超纯水),盖紧管盖,转移至PCR反应区 D.2.2方法2自配试剂方法 D.2.2.1荧光染料法 D.2.2.1.1加人引物对cQUXccF02/CQUXccR02母液到荧光PCRMasterMix(含dNTPs,Mg 热启动DNA聚合雕.R级冲液.sYBRGrenl费光染料)中,加灭菌超纯水使反应被中引物终浓度为0.25mol/L,1×PCRMasterMix,混匀 D.2.2.1.2取0.2mLPCR反应管,编号后每管中加人23L上步所配反应液 D.2.2.1.3分别加人待测样品液2AL/每管;以新鲜制备的阴性对照、阳性对照和空白对照2L/每管代替待测模板作为对照盖紧管盖,3000瞬时离心,以混匀并去除气泡 D.2.2.1.4转移至PCR反应区 D.2.2.2荧光探针法 D.2.2.2.1在避光条件下加人荧光标记探针cQUXceP母液和引物对cQUXcF06/cQUXccR06 母液到PCRMasterMix(含dNTPs,Mg,热启动DNA聚合酶、PCR缓冲液)中,使引物终浓度为 0.3amol/L,探针浓度为0.2umol/L,1×PCRMasterMix,混匀分别加人待测样品液2AL每管;以新鲜制备的阴性对照、阳性对照和空自对照2L/每管 D.2.2.2.2 代替待测样品作为对照,盖紧管盖,300从瞬时离心,以混匀并去除气泡 D.2.2.2.3转移至PCR检测区 12
GB/T28068一2011 D.3实时荧光CR扩增(在检测区进行 D.3.1荧光染料法PCR扩增 D.3.1.1扩增程序在iCyclerT(Bio-Rad,USA)实时荧光PCR仪上进行的扩增程序为(其他型号PCR仪扩增程序参数可能稍有变化). -95笔裂解&酶活性热启动4min,一个循环(×1); -94变性15s,61C退火,72C延伸30s,共40个循环(×40),在每个循环的延伸阶段72 时采集荧光10 S; 末次延伸72,7min D.3.1.2熔解曲线分析 PCR扩增结束后立即进行熔解曲线分析,以验证扩增的特异性熔解曲线反应程序为;97c， nmin;57,1min;从57丫开始每升高0.5保持10s,升高到97c止验证检测结束后,设备自动记录并生成报告根据仪器采集荧光曲线和C值判定结果 D.3.2荧光探针法PCR扩增在icyeer(Bio-Rad,UsA)实时荧光PCR仪上进行的扩增程序为(其他型号PCR仪扩增程序参数可能稍有变化); 95C变性& 酶活性热启动4min,1个循环; -94C变性15s,61C退火,72C延伸30s,共计40个循环(×40),在每个循环的延伸阶段 72)同步采集荧光 -末次延伸72,7min 检测结束后,设备自动记录并生成报告根据仪器采集的荧光曲线和C值判定结果 13
GB/r28068一2011 附录 E 资料性附录柑桔溃疡病菌实时荧光CR检测试剂盒组成及使用说明 E.1检测试剂盒组成每个试剂盒最多可检测48个样品,包括以下成分: -样品制备液 30mL×4瓶固相试剂恢复液 50L×4支阳性对照(无害化Xacc特异序列重组质粒DNA) 20ng×5支阴性对照(健康柑桔植株DNA 20ng×5支同相化试剂检测管 8联管×6条 E.2说明 E.2.1样品制备液的主要成分为磷酸缓冲液 E.2.2恢复液用于溶解荧光PCR固相化混合试剂 E.2.3用于荧光染料法检测的固相试剂管中包含除待测样品DNA外的所有PCR扩增反应试剂及荧光染料,用于荧光探针检测的固相化试剂反应管中包含除待测模板DNA外的所有PCR反应试剂及荧光探针 E.3功能所列试剂盒可用于柑精溃疡病叶片枝条和果实等组织材料样品中柑枯溃疡病菌的实时荧光CR 检测和病害鉴定具体操作按使用说明进行 .4使用注意事项 E.4.1发生褐变的柑精组织材料不宜作为PCR检测样品 E.4.2在制样及检测过程中,应严格防范不同样品间的交叉污染,所有用具应彻底清洗并消毒;移液器头尖应一次性使用,并且转移每个样品时都应更换,以免交叉污染 E.4.3上机前检查各反应管是否盖紧,以免茨光物质泄露污染仪器,反应管内避免产生气泡 E.4.4全部检测过程可在室温(23C)下进行,PCR固相化试剂盒可以在室温条件下置于干燥器内密封保存,使用时取出所需数量,剩余部分立即放回干燥器中 14

柑桔溃疡病菌实时荧光PCR检测方法GB/T28068-2011

柑桔溃疡病是柑桔树上常见的一种病害，由于其症状不明显，容易被忽视，因此迅速准确地检测出柑桔溃疡病菌非常重要。传统的检测方法主要依赖于繁琐的样品处理和培养技术，而实时荧光PCR检测方法则可以在较短的时间内进行检测，且具有高度的特异性和灵敏度。

GB/T28068-2011标准规定了针对柑桔溃疡病菌的实时荧光PCR检测方法，下面将对该方法进行详细介绍：

实验材料

1. 溶解水：超纯水或去离子水

2. PCR模板DNA：包括已知浓度的阳性对照DNA和待检测样品DNA

3. PCR试剂盒：包括PCR mix、探针和引物等

4. 实时荧光PCR仪：用于扫描PCR反应体系产生的荧光信号

实验步骤

1. 提取样品DNA并定量，将所需的体积依据GB/T28068-2011标准加入PCR反应体系中；

2. 加入PCR试剂盒，混合均匀后进行PCR反应；

3. 采用实时荧光PCR仪扫描PCR反应体系中产生的荧光信号，得到相应的荧光曲线图；

4. 根据荧光曲线图的结果，判断是否有柑桔溃疡病菌污染。

结果分析

实时荧光PCR法的结果根据荧光曲线图的形态进行分析，阳性样品荧光曲线呈指数型增长，阈值循环数（CT值）在标准范围内（根据GB/T28068-2011标准），而阴性样品荧光曲线则呈线性增长或无明显增长。根据阈值循环数和荧光曲线的形态，可以判断样品是否受到柑桔溃疡病菌污染。

结论

实时荧光PCR检测方法是一种快速、特异性高、灵敏度高的检测方法，能够有效地检测出柑桔溃疡病菌的污染情况。该方法符合GB/T28068-2011标准，并已经在实际的病害监测中得到了验证。相信随着技术的不断发展，实时荧光PCR检测方法将会在柑桔病害防控中起到更加重要的作用。