GB/T28978-2012
马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法
DetectionandidentificationofClavibactermichiganensissubsp.sepedonicus
- 中国标准分类号（CCS）B16
- 国际标准分类号（ICS）65.020.01
- 实施日期2013-06-01
- 文件格式PDF
- 文本页数21页
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马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法
国家标准 GB/T28978一2012 马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法 DeteetioamdidenifieationofcClaribaetermichiganensissubsp.sepedoniews 2012-12-31发布 2013-06-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T28978一2012 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利
本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口
本标准起草单位厦门出人境检验检疫局检验检疫技术中心,福建 出人境检验检疫局检验检疫技术中心,浙江出人境检验检疫局 本标准主要起草人;廖富荣,林石明,吴媛,沈建国,吴志毅、陈青、张明哲,、陈红运、黄蓬英
GB/T28978一2012 马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法 范围 本标准规定了基于生理生化特性,致病性特征,血清学,分子生物学特征的马铃薯环腐病菌检测和 鉴定方法 本标准适用于马铃薯环腐病菌在马铃薯块茎、植株上的检测与鉴定
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SN/T1l35.5一2007马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法 马铃薯环腐病菌基本信息 中文名称:密执安棒状杆菌环腐亚种 名:马铃薯环腐病菌 拉丁学名:Caibacermichiganensissubsp.seedonicu 属于微杆菌科(Mierobacteriaceae)、棒形杆菌属(Claibacter)的成员
马铃薯环腐病菌(以下简称Cms)引起马铃薯环腐病,可通过带病的种薯进行远距离传播,也报道 可通过番茄等种子传播,关于Cms的其他信息参见附录A 方法原理 马铃薯环腐病菌具有独特的培养性状和生理生化特征,该病菌的生理生化特性、致病性特征,以及 血清学、分子生物学特征是制定本标准的主要依据
主要仪器设备 本标准的检测鉴定方法主要使用以下仪器设备: 微量榨汁机、酶标仪,洗板机,微量天平(感量:0.001g),生物培养箱、荧光显微镜、PCR仪、荧光 PCR仪,电泳仪、,水平电泳槽、凝胶成像仪,高速冷冻台式离心机,BOL0G自动微生物鉴定系统、浊度 计、水浴槽或恒温孵育器、pH计、各种量程的可调移液器(1000L200AL、100L、20L,10L、2L)
6 检测与鉴定 症状检查 马铃薯环腐病菌侵染马铃薯植株后,在马铃薯块茎、植株上可产生症状(参见附录A),通过症状检 查可以初步判断是否为Cms引起的病害
GB/T28978一2012 6.2表现症状样品中病原菌的分离 6.2.1培养基的选择 从马铃薯块茎,茎杆,叶片等植物组织中分离病原菌选择用MTNA培养基(见B.1)或NCP88培 养基(见B.2),用酵母葡萄糖矿物盐培养基(YGM)(见B.3)或葡萄糖营养琼脂(NDA)(见B.4)进一步 纯化
6.2.2分离纯化 按附录c给出的方法,从发病的植物组织中分离病原菌
当分离到疑似Cms的纯培养后,按6.4~ 6.6给出的方法进行鉴定,然后按6.7给出的方法进行致病性测定 6 潜伏侵染样品初筛与分离 6.3.1样品制备 按附录D的给出的方法,每份检测样品取200个马铃薯块茎,洗涤去除表面土壤后,切取维管束组 织制备马铃薯块茎悬浮液
6.3.2初筛检测 利用DAs-ELIsA方法(按6.5给出的方法)对制备马铃薯块茎悬浮液进行初筛检测
如果DAs ELISA检测结果为阳性的,则用RT-PCR方法(按6.6.1给出的方法)进行验证
6.3.3生物学测定 把初筛检测阳性的马铃薯块茎悬浮液接种到感病的茄子上,进行生物学测定(按6.7给出的方法
6.3.4分离纯化 按附录C给出的方法,把初筛检测阳性的马铃薯块茎悬浮液进行系列稀释(10 l、10-2、l10-3,分 别取100L涂布到MTNA培养基(见B.1)或NCP88培养基中(见B.2)上进行分离培养
对疑似Cms菌落按6.46.6给出的方法进行鉴定,然后按6.7给出的方法进行致病性测定
注:分离纯化可以和生物学测定平行进行
6.4BoL.oG鉴定 按附录E给出的方法,把疑似Cms的纯培养接种到BUG培养基(见B.7)上富集培养,然后接种到 GEN鉴定板上进行鉴定
5 6
DAS-L.IsA检测 对于表现症状的植物组织样品,按1:10的比例质量;体积)在检测样品中加人样品提取缓冲液 见B.10),研磨成匀浆后,离心,上清液作为检测样品
对于已分离纯化的细菌纯培养,用样品提取缓冲液(见B.10)制备约106CFU/mL
的菌悬液作为 检测样品
对于潜伏侵染的植物组织样品,制成样品悬浮液后(见附录D),用样品悬浮液进行检测 按试剂操作说明书或按sN/Tl135.5一2007中5.2给出的试验方法
用Cms已知菌株作阳性对 照,并设置相应的阴性对照
GB/T28978一2012 6.6分子生物学检测 6.6.1PCR检测 本标准提供多个检测Cms的PCR方法,任意选用其中一种PCR法进行检测,按F.1和F.2给出 的方法
用Cms已知菌株作阳性对照,并设置相应的阴性对照和空白对照
6.6.2实时荧光CR检测 本标准提供2个检测Cms的实时荧光PCR方法,任意选用其中一种方法进行检测,按F.1和F.3 给出的方法
用Cms已知菌株作阳性对照,并设置相应的阴性对照和空白对照
6.7致病性测定 按附录G给出的方法,把培养3d的纯培养物制备成约10'CFU/mL菌悬液,接种到510株茄子 幼苗的茎杆上
用新鲜配制的马铃薯环腐病菌已知菌株制备成约0CFU/ml~10'CFU/ml的菌悬 液作为阳性对照,接种了株茄子幼苗
用无菌水作为阴性对照,接种5株茄子幼苗 结果判定与报告 结果判定 当B1oLOG;检测或DAs-EILs检测或分子生物学检测(PCR方法或实时荧光PCR方法),其中 7.1.1 两种基于不同原理的方法检测结果为阳性、且致病性测定为阳性时,判定为马铃薯环腐病菌
与DAsEIL.SA检测或分子生物学检测(PCR方法或实时荧光PCR方法)初筛检测结果为阴 7.1.2 性,或只有其中一种检测方法结果为阳性时,判定为非马铃薯环腐病菌
7.2结果记录与保存 7.2.1记录各项实验数据,包括样品种类、来源,检测时间、地点、方法和结果等
DAs-ELISA检测结 果保存吸光值的数据报告,PCR检测结果保存电泳照片,实时荧光PCR检测结果保存采集的数据
7.2.2检出马铃薯环腐病菌的马铃薯块茎,茎秆,或叶片等样品,在超低温冰箱中保存,以备复核;分离 纯化的马铃薯环腐病菌保存到超低温冰箱中,或冻干后低温保存
GB/T28978一2012 附录A 资料性附录 马铃薯环腐病菌相关信息 A.1名称与分类地位 中文名称;密执安棒形杆菌马铃薯环腐亚种、密执安棒形杆菌环腐亚种、密执安棍状杆菌环腐亚种 8 拉丁名称:Cavibuctermicehigaensissubsp，seedonicwsSpeeckermann Kotthof，1914) Davis,Gillaspie,Vidaver8.Harris1984. 同物异名:Corynehacleri iummichiganensissubsp.sepedonicumSpieckermann&Kothof,1914) & & Vidaver，1982;Corynebacteriummichiganensispv.sepedonicumSpieckermann Carlson Kotthof,1914Dye&
Kemp1977;CoryneacleriumsepedonicumSpieckermann&
Kotthof,1914) Skaptason&.Burkholder1942 称;马铃薯环腐病菌 英文名称;Poatoringrot;baeterialringrol.ol wilt rotofpotato;ve vascdlarpotato Otato oirimgro A 英文缩写:CMS或Cms 分类地位;细菌界(IBacteria),厚壁菌门(Firmicutes),放线菌纲(Actinobacteria),放线菌亚纲(Acti nobacteridae),放线菌目(Actinomycetales),微球菌亚目(Mie ,微杆菌科Mierobacteriaceae) Cr0c0ccineae， 棒形杆菌属(Clailacter) A.2症状特征 A.2.1马铃薯块茎 A.2.1.1马铃薯块茎上的症状 块茎外部症状不明显,但横切后可看到维管束变为乳黄色以至黑褐色,重病薯维管束变色部分可连 成一圈,成环状,严重时皮层与髓部可以脱离
腐烂通常是从顶端的维管组织到块茎的中心皮层逐步发 展的
用手挤压切开的病薯,可看到维管束部分有乳白色或黄色菌液流出
经越冬贮藏的病薯,芽眼干 枯变黑或外表开裂
在病害晚期,由于次生菌的进一步侵染,维管束也可变黑并腐烂
A.2.1.2与青枯病(褐腐病)的区别 与茄科劳尔氏菌(Ralstoniasolanaceurum)引起的青枯病褐腐病)区别在于;在病害早期,马铃薯 环腐病腐烂组织通常保持乳白色、具粘稠的奶酪状特征,而马铃薯褐腐病腐烂组织呈褐色、更加粘稠、软 泥状
A.2.1.3 与黑茎病的区别 与胡萝卜软腐欧文氏菌马铃薯黑胫亚种(Eru rwinia.carotoorasubsp.atroseptica)引起的黑茎病区 别在于;黑茎病在块茎上腐烂成粘团状,腐烂始于胳部,呈放射状向髓部扩展,病部黑褐色,横切可见维 管束亦呈黑褐色,用手压挤皮肉不分离,湿度大时,薯块变为黑褐色,腐烂发臭
GB/T28978一2012 A.2.2马铃薯植株 A.2.2.1马铃薯植株上的症状 在田间,马铃薯环腐病在植株上的症状有时很少被发现，经常只出现在季节的末期
该症状很容易 被其他病害、衰老或机械损伤等混淆,所以在现场检验时很容易被遗漏
马铃薯环腐病引起萎蔫症状很 环顺赖引起整游通常是缓慢的.最初只局限于叶缘
少出现，只是叶片和块茎变小,偶尔植株矮化
感 染的嫩叶经常依旧展开,造成不成对的叶片
受侵染的叶片木质部堵塞,经常在脉间区域产生褪绿,黄 色到橙色,进一步向下影响到茎杆
受感染的小叶叶片、甚至茎杆,最终可能死亡 A.2.2.2与其他病害的区别 茄科劳尔氏菌、胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种、胡萝卜软腐欧文氏菌马铃薯黑胫亚种 nthemi)、孔状短小茎点霉(Phoma E.carotoora uhp.dwrprio),菊欧文民菌(E.chr 1rysan e.rigua a)等系统性病原也可以引起萎藉症状,与马铃薯环腐病菌引起的萎蔫症状的区别是 var.oeata 菊欧文氏菌侵染可以使茎杆变黑,而马铃薯环腐病菌不会使茎秆变黑
-其他几种病菌引起的萎蒿症状是使整个叶片或整个植株快速萎蔫,而马铃薯环腐病菌不会引 起快速萎薇
A.3寄主范围 anumtuberosum
在自然条件下,只侵染马铃薯(Solan 甜菜(Beavulgris)被认为也是该病菌的自 然寄主,但不表现症状
人工接种可以侵染西红柿(Lycopersiconesculentum),茄子(Sola auunnelo71 gena),醋栗番茄(Lycoersiconpimpinelifolium)等茄科(Solanaceae)植物,并都表现症状
A.4分布 欧洲;奥地利、白俄罗斯、塞浦路斯、捷克共和国、丹麦、爱沙尼亚、芬兰、德国、希腊、拉脱维亚、立陶 宛、荷兰、挪威、波兰、罗马尼亚、俄罗斯、斯洛伐克、瑞典、乌克兰、英国
亚洲:、日本、哈萨克斯坦、韩国、朝鲜、尼泊尔,乌兹别克斯坦 非洲;阿尔及利亚
北美洲;加拿大、美国
A.5形态特征 菌体棍棒状,球形,或卵圆形,单生或双呈“V”形,有时排列成栅栏状,大小(0.4Am一0.6Am)x (0.8 8m~1.2m)
不产生芽袍,无荚膜,无鞭毛,不能运动
该病菌革兰氏呈阳性,老龄菌易变为阴性
A.6培养性状 该病菌生长最低温度1C一2C,最高温度31C一33C,生长最适温度为20C一23C,在温度 55C条件下经10min致死,生长最适pH值为8.0~8.4
该病菌具有生理分化现象
GB/T28978一2012 生理生化特性 马铃薯环腐病菌的生理生化特征见表A.1 表A.1用于马铃薯环腐病菌鉴定的营养和生理性状特征 测试 反应 氧化发酵测试(Oxidativeandfermentativetest,o/F) 惰性的或微弱的氧化反应 氧化酶测试(Oxidasetest) 过氧化氢测试(Catalasetest) 硝酸还原反应(Nitratereduction 脉酶活性(Ureaseactivity HS的产生(HSproduetion) 咧嗓的产生(Indoleproduetion) 柠檬酸利用(Cit itrateutilization 淀粉水解(Starehhydrolysis) 或微弱 纤维素酶活性(Cellulaseactivity 十或微弱 37 下生长(Growthat37C 7%氯化钠下生长(Growthin7%NaCl 凝胶水解(Gelatinhydrolysis) 秦皮素苷水解(Aesculinhydrolysis) 甘油产酸Acidfromglycerol 乳糖产酸(Acidfromlactosey -或微弱 鼠李糖产酸(Aeidfromrhamnose) 水杨诫产酸Acidfromsaliein 注:十为阳性反应，一为阴性反应
A.8侵染途径 A.8.1带菌种薯是主要的初侵染源,采用切块播种时,切刀传病是扩大再侵染的主要途径
切一刀病 薯的切刀能传染24一40个健薯
病菌从伤口侵人,潮湿时也可从皮孔侵人
A.8.2病菌可以在盛放种薯的容器上存活,这些容器也是薯块感病的来源之 A.8.3环腐病细菌在土壤中不能长期存活,当年收获遗留田间的病薯不能成为次年初侵染源
A.8.4滥溉水或雨水也可将病薯腐烂释放出来的细菌传到健薯或健株根茎上
A.8.5带菌种薯的细菌随养分和水分的流动沿维管束依次向上进人新芽、茎、叶柄和叶内,形成系统 侵染
病菌破坏输导组织,阻塞养分和水分的流通,造成地上部分卷叶、矮化和萎蔫
当葡匈茎长出时 病菌又沿葡匈茎的维管束进人新生薯块,但种子不带菌
A.8.6病害发生的最适温度18C一24C,16C以下症状出现少,当土温超过31C时,细菌生长受抑 制,病害发生轻
GB/T28978一2012 附 录 B 规范性附录 培养基及缓冲液的配制 B.1MINA培养基 酵母提取物2.0g;甘露醇2.5g;K,HPO0.25g;KH,PO0.25g;NaCl0.05g;MgsO7H,O 0.lg;MnsOH.O0.015g;FeSO,7H.O0.005g;琼脂Oxoidno.1)16.0g;蒸僧水加至1.0L
溶解,调整pH值到7.2 高压灭菌后(121C,15min),冷却至50C,加人抗生素;三甲氧节二氨嗜0.06g,禁酸0.002g 两性霉素B0.01g 抗生素保存溶液;三甲氧紫二氨喘唉(5mg/mL)和慕院酸(5mg/mL)保存在96%的甲醇中,两性 霉素B(1mg/ml)保存在二甲基亚碱中
保存溶液用无菌过滤器过滤
基础培养基保质期3个月
当加人抗生素后,保存在冰箱中的培养基保质期1个月
B.2NCP88培养基 营养琼脂23g;酵母提取物2.0g;D甘露醇5g;K,HPO2g;KH,PO0.5g;MgsO
7H,O 5g;燕懈水加至1.0L
溶解,调整pH值到7.2. 0.25 高压灭菌后(121,15min),冷却至50,加人抗生素:多粘菌素B0.003g,禁酸0.008g,放 线菌酮0.2g 把抗生素溶解在保存溶液中;綦啶酸保存在0.01mol/1的NaOH,放线菌酮在50%乙醇中,多粘 菌素B在燕僧水中
保存溶液用无菌过滤器过滤
基础培养基保质期3个月
当加人抗生素后,保存在冰箱中的培养基保质期1个月
B.3酵母矿物盐培养基(Yesgensemineralsalsmedium,YGNMy Baeto酵母提取物2.0g;D(十)葡萄糖(一水合物)2.5g;K,HPO40.25g;KH,PO0.25g; Mgso7H.o0.1g;MnsOH.00.015g;NaC0.05g;FesO7H.o0.005g;Bacto琼脂18g" 蒸馏水加至1.0L
溶解,0.5L体积的培养基在115C下高压灭菌20r min
,NDA B.4葡萄糖营养琼脂(Nutriemtdextroseagar, 含有1%D(十葡萄糖(一水化物)的Difcobacto营养琼脂'
115C下高压灭菌20min
Dfcobacto营养琼脂是由Difco提供的产品的商品名
给出这一信息是为了方便本标准的使用者,并不表示对 1 该产品的认可
如果其他等效产品具有相同的效果,则可使用这些等效产品
GB/T28978一2012 B.5改良YGM培养基(YGM-modified 酵母提取物2.0g;K,HPO0.25g;KH,PO0.25g;MgsO
7H,O0.lg;MnSO
H,O0.15g; Na(Cl0.05g;FesO7H.O0.005g;澳百里酚蓝0.05g;蒸僧水加至1.0L
在115C下高压灭菌20nmin. B.6NBY培养基 营养琼脂23g;酵母提取物2.0g;KHPO0.5g;K;HPO2.0g;MgSO
7H.O0.25g;D(一) 甘露醇5.0g;蒸僧水加至1.0L
在115C下高压灭菌20min
B.7BUG培养基,pl7.3 称取57的BUG琼脂培养基粉末(BoL.0G公司到1000mL燕倡水或去离子水中,煮沸游 解;冷却后(25C)调整pH值至7.3士0.1
121C灭菌15min;冷却至45C50C,分装至培养皿中 B.850mmol/1磷酸缓冲液,pH7.0 该缓冲液用于植物组织中细菌的提取
NagHPO.(无水)4.26g;KHPO2.72g;燕榴水加至1.00L
溶解,调pH值至7.0,在121C下 高压灭菌15min. 以下试剂对于细菌提取可能是有益的:Lbrollakes(抗絮凝剂0.5g;LXCsiliconeantifoam(防沫剂 1.0mlL;焦磷酸四钠(抗氧化剂1.0g;聚乙烯毗咯婉酮40000(PVP40)(PCR抑制物的结合物)50g
B.g10mmol/儿磷酸缓冲液,pH7.2 该缓冲液用于马铃薯块茎顶部提取物离心浓缩后重新悬浮和稀释
NaHPO12H,02.7g;NalHPO2H,O0.4g;蒸僧水加至1.0L
溶解,调pH值至7.2,在 121C下高压灭菌15min
B.10样品提取缓冲液pH7.4 Na.so).1.3g;PVP(Mw24000一40o00)20.0g;NaN,0.2g;Tween-2020mL..游于1L的1义 PEBST(见B.11),调pH到7.4
B.111×PBST,pH7.4 NaCl8.0g,KHPO0.2g,NaeHPO1.15g,KCl0.2g,NaN,0.2g,加人900ml燕僧水溶解 用NaOH或HCI调节pH值到7.4,然后加水至1L 然后向上述溶液中加人0.5ml的Tween-20 BG培养基粉末是由BIOL0G公司提供的商品名
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GB/T28978一2012 附 录c 规范性附录 植物组织中病原菌的分离纯化 C.1表现症状样品的制备 C.1.1从表现症状的马铃薯块茎维管束环或者茎杆或叶片的维管束等检测样品中去除腐烂或褪绿组 织(如果需要,使用70%乙醉进行表面消毒). C.1.2加人少量的蒸水或50mmol/L的磷酸缓冲液(见B.8)悬浮,或研磨样品
C.1.3每个检测样品从10"稀释到10- C.2潜伏侵染样品的制备 C.2.1按附录D给出的方法,从未表现症状的马铃薯块茎样品中制备马铃薯块茎悬浮液
C.2.2把马铃薯块茎悬浮液进行系列稀释(10-'、10-、10-). C.3病原菌的分离培养 c.3.1方法一 C.3.1.1分别取100AL系列稀释的样品悬浮液,涂布到MTNA培养基(见B.1)或NCP88培养基中 见B.2). C.3.1.2利用Cms已知的菌株(如NCPPB4053)制备成10CFU/mL的菌悬液作为阳性对照,进行 10倍系列稀释,并涂布到MTNA培养基或NCP88培养基中
C.3.2方法二 C.3.2.1 用涂布器把最初100L马铃薯检测样品涂布到第一块MTNA培养基或NcP88培养基平 板上,然后把该涂布器使用到第二块琼脂平板上,用涂布器上的残留物进行划线
最后,在第三块琼脂 平板上重复,酒过涂布器产生一个有效稀释" c.3.2.2利用Cms已知的菌株(如NCPPB4053)制备成10'cFU/mL的菌悬液作为阳性对照
c.3.3培养与检查 c.3.3.1平板在黑暗中,21C一23C下培养
Cms最适宜的生长温度21,28C将对生长造成伤害 C.3.3.23d后检查平板,并与阳性对照比较,然后在5d、7d和10d后观察平板 洼:从植物组织上分离通常需要10d. C.3.3.3在平板过分生长之前,也就是在3d5d之后,观察是否有疑似菌落
C.4病原菌的纯化 把Cms疑似菌落转移到YGM培养基(见B.3)上培养、纯化,通常重复2一3次
用菌落放大灯观 察菌落形态,确保疑似菌落已纯化
GB/T28978一2012 附 录 D 规范性附录 潜伏侵染的马铃薯块茎样品的制备 D.1洗涤 把200个马铃薯块茎放在自来水下冲洗,去除薯块表面土壤,晾干
D.2块茎顶部维管束组织的切取 用解剖刀(或其他合适的工具),去除每个马铃薯块茎块茎顶端部分的表皮,切下块茎顶部,并尽可 能挖除块茎顶部上圆锥形的非维管束组织,保留块茎顶部的维管束组织
解剖刀通过在70%酒精浸泡 后、燃烧消毒
注:切下的块茎顶部最好立即处理,或在24h内处理
否则,保存在一20C中,但不要超过2周
D.3马铃薯块茎悬浮液的制备 D.3.1在块茎顶部的维管束组织中加人约40mL50mmol/L的磷酸缓冲液(pH7.0(见B.8),在摇 床上(50r/min100r/min),低于24下搅动4h或4C下放置16h一24h
注也可以把块茎顶部的维管束组织放人搅拌机中粉碎;或者放人密封样品塑料袋中压碎 D.3.2轻轻倒出上清液,在4C一10C下7000片离心15min(或10000片离心10min),倒掉上 清液
注如果极其混浊,在低速下离心谁清(低于180片离心10min,C一10C);然后把上清液进一步离心 D.3.3在沉淀中加人1mL无菌的10mmol/儿磷酸缓冲液(pH7.2)(见B.9),把沉淀重新悬浮,即为 马铃薯块茎样品悬浮液
D.3.4把制备的样品悬浮液分成相等的两份:一份用于检测鉴定,另一份加人无菌的甘油至终浓度为 10%一25%体积分数)并保存在一20C冰箱中备用
10o
GB/T28978一2012 附 录 规范性附录 BIoLoG;微生物自动鉴定系统鉴定 E.1细菌的纯培养 把经分离纯化的纯培养(见附录c),用BIoLOG微生物自动鉴定系统进行鉴定
通过菌落放大灯 观察菌落形态确认为纯培养物
E.2纯培养的富集培养 采用“十”字交叉法画线,将纯化的培养物接种到BUG培养基上(见B.7),在21C23C下培养 16h~24h
E.3菌悬液的制备 E.3.1先关掉浊度计的开关,调整指针到0%T
用吸水纸擦干净接种液IF-A的试管外壁
打开浊 度计的开关,将IF-A空白液置于浊度仪中,调整指针至100%T
用标准浊度液(85%TTurbidity Standard,或65%TTurbdityStandard)检查浊度仪的准确性
E.3.2观察培养16h~24h后或更长时间的培养基纯培养平板外观,用记号笔在准备鉴定的菌落背 面作好标记,标记1一3个菌落
E.3.3取无菌棉签粘取1个准备鉴定的菌落(注意不要带出培养基) E.3.4将无菌棉签小心插人上述IF-A接种液的试管中
首先将无菌棉签沿试管内壁旋转几圈,将菌 落转至试管内壁,然后用无菌棉签上下划动.并转动试管,将菌落均匀分散
E.3.5将试管置于试管架上静置5min,然后用浊度计测量浊度值
如果浊度值不在90%98%T 范围内,通过添加菌体或空白接种液把浊度值调整到预定的浊度值范围内,最佳为94%T E.3.6把调整好浓度的菌悬液用于下一步接种使用
E.4GEN皿鉴定板的接种与培养 E.4.1从4C冰箱中取出96孔GEN微孔板,放置在工作台上,使之达到室温
E.4.2将制备好的菌悬液倾人V型加样槽中
保留约1mL菌悬液在试管中,不要倾人加样槽
.4.3用八道移液器吸取菌悬液到GEN鉴定板中,每孔加100AL菌悬液
然后室温下静置 E 10min 左右
注:加样需小心,不要溅出,以避免污染;接种时间不得超过20min E.4.4将鉴定板放人密闭的盒或袋中(为防止水分燕发,可加人湿的纸团或纱布),在30C培养箱中 培养4h24h 3 F-A是由BoL.oG公司提供的商品名
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4GEN微孔板是由BIOL(0G公司提供的商品名
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如果其他等效产品具有相同的效果,则可使用这些等效产品
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GB/T28978一2012 E.5上机读数 E.5.1打开计算机并打开应用软件“MieroStation/MieroL.og3;”,并打开读数仪电源(MieroStation) r"标签下选择读数仪的型号(Mierosation1或MieroStaion2), E.5.2点击“Setup”标签， Reader 点击“initializereader”按钮， Port”显示“Open”,下方显示“Ready”时,仪器初始化完毕
另外 在“Program ee标签下设置数据库
option"标签下设置显示信息、在Database/ 点击“Read”标签,选择“ReadSetup”标签,设置输人、输出模式
如在InputMode下列菜单中 选择“Reader”,UseBatch下列菜单中选择“No”;在AutomaticPrint-out 下列菜单中选择“Yes”可以自 ”,点击等号后的“Dat 动打印结果,否则选“No”;在“SaveToDataFile”下列菜单中选择“Yes” eFile Name”,输人文件名称及保存的路径,不保存数据则选“No” 在下列区域输人样品识别 E.5.4点击右上角的“ReadNewPlate”按钮,显示“PlateInformation” 信息 t上输人3个字母的计划信息 Project -PlateNumber;输人微孔板数量(可选项); PlateType下列菜单中选择微孔板类型"GEN” Protoeol:下列菜单中选择程序“A” ncubationHours;输人微孔板孵育时间
E.5.5在放置微孔板前,用软棉布或纸擦拭微孔板的底部,以去除底部的指纹及污染
E.5.6把微孔板放人读数仪的样品架内,取下微孔板盖,并确认A1孔在左上角,合上读数仪样品腔的 盖子
点击“Read”按钮开始读数,结果将显示在“ReadInformation”内
E.5.7 E.6结果判定 -般观察孔出现紫色较多的时候便可以开始上机读数(一般在8h以后),24h基本可以确定结果， 根据以下显示结果判定: 当结果显示“NoIDYet”，或显示SpeeiesID但非Cavibactermichigaensissubsp. sepedonicus时,则BoLOG检测结果为阴性; 当PROB接近或等于1,SIM>0.75,DIS<5.0,且结果显示为“SpeciesID;C'aouibaclermichi ganensissubsp.sebedonicus”时,则BOLOG检测结果为阳性
E.7注意事项 使用MicoStation鉴定过程中,应注意以下几点
-用于鉴定的菌株应完全纯化,并利用特定培养基经几次转代培养保证微生物的活性 -应在无菌环境下操作,以避免污染; 尽量使用一次性玻璃器皿,以避免残留的清洁剂对结果造成影响 用于鉴定的GEN皿微孔板,使用前都应预热,使之达到室温; 浊度仪每次使用前都应校正; -用于接种的菌悬液浓度应用浊度仪进行测量,使菌悬液浓度位于特定浓度范围 制备菌悬液时，一定不要将培养基挑进去; -从打开铝箔袋把微孔板暴露在空气中,到接种完成,在20min以内完成
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GB/T28978一2012 附 录 下 规范性附录 分子生物学检测 F.1NA模板的制备 F.1.1快速制备法 马铃薯块茎悬浮液 按照以下方法从马铃薯块茎悬浮液中提取DNA: -吸取100AL悬浮液到1.5mL的离心管中,并盖上盖子; 13000r/min离心3min; 倒掉上清液,放人100L的50mmol/INaOH溶液; 在加热槽或水浴中(>95C)加热10min15min; 把样品转移到冰上冷却 -在PCR或实时荧光PCR反应前,用磷酸缓冲液稀释10倍; 取24L用于PCR或实时荧光PCR反应
F.1.1.2纯培养 按照以下方法从分离纯化的纯培养中提取DNA 用超纯水制备大约10CFU/mL的菌悬液; -取100AL菌悬液到1.5ml的离心管中,并盖上盖子; 13000r/min离心3min; 在加热槽或水浴中100C加热4nmin 在冰上冷却后,用于PCR或实时荧光PCR反应 F.1.2总DNA的常规制备 根据不同的样品类型,选择合适的DNA提取方法 -对于分离纯化的纯培养,推荐使用革兰氏阳性菌DNA提取方法提取DNA
对于具有症状的马铃薯块茎、叶片或茎杆等植物组织,从病斑上取0.1只的植物组织,研磨后， 使用植物DNA提取方法或其他商用的DNA提取试剂盒提取总DNA
对于无症状的马铃薯块茎样品.取IoL样品悬泽液(见附录c)挺取DNa F.2PCR检测 F.2.1引物及序列 目前,有多对可用于特异性检测的PCR引物,引物及序列见表F.1
另外,引物Ns-7-F(5'-gag gcaataacaggtetgtgatgc3')和Ns-8-R(5'-tcegcaggtteacctacgga-3')是用于扩增植物内18SrRNA基因的 引物,可作为PCR内对照,从马铃,茄子和番茄中扩增的DNA片段大小为377bp. 13
GB/T28978一2012 表F.1用于马铃薯环腐病菌PCR检测的特异引物及序列 引物名称 引物序列(5'-3' 扩增大小 目的基因 参考文献 PSA-1 ctccttgtggggtgggaaaa 502bp IGS [9 PSA-R tactgagatgtttcacttcccg CMSIF1 gtactcggccatgaegtgg [10 1066bp ISl121" CMSIR1 tactgggtcatgacgttggt CMSIF2 tcceacggtaatgctegteIg [10 885bp 1Sl121 CMSIR2 gatgaagggtcaagctggtc CmsSpl ccttgtggggtgggaat [11] 215bp 1GS CmsSp5r tgtgatccacegggtaaa Cms50F gagcgcgatagaagaggaactc 193bp Cms50 [12] Cms50R cctgagcaacgacaagaaaaatatg Cmms72aF ctactttcgCggtaagcagtt [[12],[13 213bp Cms72 Cms72aR gcaagaatttegetgectatce 16s-23srRNA基因间隔区(Intergeniespacerregionofthe16s-23srRNAgenes) nsertionelementIS1121 cs1质粒及染色体中的插人因子ISI121l Cms基因组序列中该亚种的特异性序列
F.2.2PC扩增 25AL的反应体积;2.5l.10×PCR缓冲液含Mg十),0.5AL的dNTP各10mmol/I),0.5AL aoDNA聚合酶,上游引物1L(10amol/L),下游引物1L(10mol/L),2L的DNA模板,17.5L的 分子级H,(O
在PCR仪上完成反应,反应程序见表F.2
所有检测样品都需重复一次
注1，当使用由引物PsA-1/PsAR和Ns7-F/Ns8R组成的多重PCR方法检测时,除特异引物外,还应加人另外 -对引物PsA1/PsAR和Ns子F/八s总R.并相应减少Ho的体积,使总体积为25L 注2:引物CMSIF1/CMSIR1和CMSIF2/CMSIR2组成巢式PCR,先由CMSIF1/CMSIR1扩增后,再由CMSIF2/ CMSIR2扩增
表F.2普通CR反应条件 引物对 预变性 反应循环 总延伸 94笔变性60s.62C退火45s,72笔延伸90s;共40循环 Splf/Sp5r 95C,5min 72,7min 5变性60s,64退火60s,72延伸60s;共10循环 PSA-1/PsA-R 95,5min 72,7min 95变性30s,62退火30s,72C延伸60s;共25循环 94变性45s,55C退火60s,72延伸10s;共10循环 Cms50F/Cms50R 95C,5min 72,7min 94变性45s,55退火40s,72延伸15s;共40循环 94C变性45s,60C退火60s,72延伸15s;共10循环 Cmms72aF/Cms72aR 95C,5min 72C,7min 92c变性45s,60退火40s,72延伸20s;共40循环 cdAF/cdlAR" 92 C变性 退火 C延伸 30s.60 45s.72 72C.7min 95,5min 130s;共40循环 CMSIF1/CMSIR1 95C,5min 94变性60s,60退火60s,72延伸60s;共35循环 72,7min CMsIF2/cMsIR2 95,5min C变性60s,60 72,7min C退火 C延伸60s;共35循环 60s.72 引物序列见表F.3,扩增片段大小为150bp 1
GB/T28978一2012 F.2.3凝胶电泳 PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析
每个样品取5l的PCR产物与1L的6×上样缓冲液 混合均匀,并加到置于0.5×TBE缓冲液的1.5%琼脂糖凝胶孔中,然后在120V下电泳
电泳结束 后,在0.54g/L.的嗅化乙锭(EB)溶液中染色约5min,然后在清水中清洗后,在凝胶成像系统中观察， 拍照,并保存照片 F.2.4CR检测结果的判定 在阴性对照和空白对照没有产生条带阳性对照产生预期大小的条带情况下 如果检测样品出现与阳性对照大小一致的条带,则为阳性; -如果检测样品未出现与阳性对照大小一致的条带,则为阴性
F.3实时荧光PCR检测 F.3.1 引物及探针 使用TaqMan检测系统,引物及探针序列见表F.3
表F.3实时荧光PCR所使用的引物 终浓度 引物名称 引物序列5'-3' 目的基因 参考文献 Amol/儿 CelA-F tcteteagteattgtaagatgat 0.75 CelA-R [13] attcgaccgctctcaa 0.75 CellulaseA CeA FAMt t-BHQ1 0.16 probe" [-ttcgggcttcaggagtgcgtgt- Cms50-2F 0.3 cggagCgcgatagaagagga Cms133R 0.3 Cms50 [1们 ggcagagcatcgctcagtacc Cms50-53T HEX-aaggaagtcegtcggatgaagatgcg-BHQ1 0.2 注:TaqMan探针Cms50-53T和CelAprobe也可以标记其他合适的报告基团和淬灭基团
纤维素酶A基因 探针;5'端标记报告基团6-carboxy-florescein(FAM)(荧光发射最大波长517nm),3'端标记标记悴灭基 团BHQ1 探针;5'端标记报告基团Hex(荧光发射最大波长553nm),3'端标记标记悴灭基团BHQ1 F.3.2实时荧光PCR步骤 25l.的反应体积;10Al.2×定量PCR反应混合液,加人上下游引物及相应的TaqMan探针(使用量 见表F.3),2L的DNA模板,ddH,O补足体积
所有检测样品都需重复一次
反应条件见表F.4
表r.4实时荧光CR反应条件 引物对及探针 预变性 反应条件 9530s,60C45s,72c32 celAF/celA-R,cedlAprobe s,共40循环 95"C,5min Cm50-2F/Cms133R,Cms50-53T 95C,5min 9515s，64C45s,共40循环 15
GB/T28978一2012 F.3.3实时荧光PCR结果的判定 在阳性对照C值<34,阴性对照和空白对照的Ct值多40前提下 -如果检测样品的Ct值<35时,则判定为阳性; -如果检测样品的Ct值多40时,则判定为阴性; -如果35
GB/T28978一2012 -或者在茎杆上以约5°的斜角进行斜切,切口长约1.0cm、深约茎杆直径的三分之二; 注:解剖刀必需在70%酒精浸泡后、然后燃烧消毒,以避免交叉污染
在切口上加人1滴(约5aL10L的马铃薯块茎悬浮液(见附录D),或加人1滴约 10CFU/ml的菌悬液; 用无菌的凡士林(或用1:1配制的石蜡油和凡士林)封住切口
G.3.2.2接种对照样品 用已知的Cm、菌株配制成1010的菌悬液,用相同方法接种5株的茄子,作为阳性对照
用无 菌的10mmol/1磷酸缓冲液(见B.9),使用相同的接种方法接种5株的茄子,作为阴性对照
G.3.3注射接种 用无菌的注射器把马铃薯块茎悬浮液(见附录D)、或用纯培养制备的约10"CFU/mL的菌悬液注 射到子叶上方的茎杆中
培养与观察 G.4.1把接种后的茄子苗放在18C一24C的温室中,至少培养4周,并保证充足的光照(每天光照 16h)和湿度(最好高于70%),以及充足的水分以避免因水分流失或缺少水分而萎蔫
最适宜的温度 是21C
G.4.21周后定期检查症状,并计算显示症状的植物数量
Cms在茄子上引起叶片萎蔫,可能开始于 叶缘
萎蔫组织可能最初显示暗绿色或斑驳,但在变坏死前转暗淡
脉间萎藉经常有油脂状的水溃出 现,而坏死组织经常有一个明亮的黄色边缘
G.4.3一旦症状出现,按附录C给出的方法从萎的叶片或茎杆上重新分离
用70%酒精擦拭叶片 和茎杆进行表面消毒
G.4.4用PCR等方法对茄子汁液和重新分离的纯培养进行检测验证
或对重新分离的纯培养进行 革兰氏染色
G.4.5在某些情况下(特别是生长条件不理想情况下),Cms可能以潜伏侵染形式存在茄子内,甚至在 接种4周后也没有显示症状
如果观察到4周后还没有症状产生,在接种位置的上方切取1cm的茎 杆,然后采用PCR等方法进行检测
如果检测结果是阳性的,则按附录C给出的方法重新分离
G.5生物学测定结果的判定 在阳性对照的茄子上显示出典型的症状,并且阴性对照的茄子上没有发现症状: -如果接种的茄子未显示症状,且PCR等方法检测结果为阴性,生物学检测结果则是阴性的 如果从接种的茄子上重新分离到Cms,生物学检测结果则是阳性的
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GB/T28978一2012 参 考 文 献 [1]程池,杨梅,等.Biolog微生物自动分析系统 -细菌鉴定操作规程的研究.食品与发酵工业 2006,32(5):50-54. [2]东秀珠,蔡妙英,等.常见细菌系统鉴定手册.北京;科学出版社,2001;267-277. [3] OEPPO/EPPO.EPPOStandardPM7/59(1);Cavibucermichiganensissubsp.sepedoni cus.BulletinO)EPP/EPPOBulletin,2006,36:99-109. delaCruzAR,WwieseMV&.SchaadNw.Asemi-selectivemediumfortheisolationofClaiacter mniechi iganensissubsp.sepedonicusfrompotatotissue.PlantDisease,1992,75;830-834. RudolphK.PhysiologicalcapabilitiesofClaiactermichig ganensissubsp.sepedonicus JansiIng anddevelopmentofasemiselectivemedium.JournalofPlantPathology,1998,105:590-601. CABInternational,2005.CropProtectionCompendium，2005Edition.Wallingford,UK: CABInternational.www.cabicom icompendium.org/cpc. PalomoJL,lopezMM,Gareia-BenavidesP,VelazguezE,Martinez-MolinaE.Evaluationof theAP150CHandAPIZYMsystemsforrapidcharacterizationofClavibactermichiganensissubsp seedonicus,causalagentofpotatoringrot.EuropeanJournalofPlantPathology,2006,l15:443-451. 8. Comparisonoftheefectivenessoffiveextractionmethodfor [8 MartinJ Beaumanoir ClazibacermichiganensissubspsepedonicusandRalstoniasolanacearufrompotatotubers BulletinOEPP/EPP(OBulletin,2001,31,l53-157 &. DinesenI" DeBoerSH.ExtractionofClazuibaclermichiganensissubsp.sepedonicusfrom compositesamplesofpotatotubers.AmericanPotatoJournal,1995,72:133-l42. PastrikKH..DeteetionofcCaoibactermichiganensissubsp.sepedonicusinpotatotubers 10 bymultiplexPCRwithcoamplificationofhostDNA.EuropeanJournalofPlantPathology,2000,106 155-165
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马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法GB/T28978-2012
马铃薯是我国重要的经济作物之一，然而环腐病的发生危及着马铃薯产业的稳定发展。为了确保马铃薯种植和运输中的疫情防控，我国发布了GB/T28978-2012标准，规定了马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法。
该标准主要包括以下内容：
1. 样品采集
在检疫鉴定前，需要对样品进行采集并进行处理。样品的采集应该遵循一定的规范，以确保采集到的样品具有代表性。在采集样品时，应该注意避免污染和交叉感染。
2. 菌种鉴定
在样品采集后，需要进行菌种的鉴定。该标准主要包括了常规的菌种鉴定方法，如形态学观察、生理生化试验等。同时该标准还规定了PCR方法、ELISA方法等现代生物技术方法的应用。
3. 病原学检测
病原学检测是马铃薯环腐病菌检疫鉴定的核心部分。病原学检测主要包括对病原菌的检测和鉴定。该标准规定了不同样品类型下的病原学检测方法，并且对于各类样品的处理方法也进行了详细说明。
4. 结果判断
在进行完上述步骤后，需要根据检测结果来进行判断。该标准规定了判断标准和方法，以确保判断结果的可靠性。
总之，GB/T28978-2012标准提供了一套科学的、规范的马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法。在马铃薯种植和运输过程中，严格按照该标准进行检测和鉴定，能够有效预防和控制环腐病的发生和传播，保证了马铃薯产业的稳定发展。
