猪圆环病毒2型病毒SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法

猪圆环病毒2型病毒SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法

国家标准 GB/T34745一2017 猪圆环病毒2型病毒SYBRGreenI实时 荧光定量PCR检测方法 Porinecirirustype2一\ethudfdetetngirusysYBR GreenIreal-timePCR 2017-11-01发布 2018-05-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/34745一2017 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由农业部提出 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/Tc181)归口 本标准起草单位:河南农业大学、动物卫生与流行病学中心 本标准主要起草人;魏战勇、郑兰兰,邵卫星,胡慧、陈红英、王亚宾、王学兵,崔保安,寇亚楠
GB/34745一2017 猪圆环病毒2型病毒SYBRGreenI实时 荧光定量PCR检测方法 范围 本标准规定了SYBRGreenI实时荧光定量PCR检测猪圆环病毒2型的技术要求 本标准用于检测猪圆环病毒2型核酸,适用于临床样品中猪圆环病毒2型的快速检测 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 缩略语 下列缩略语适用于本文件 Ct值:循环阂值(CycleThreshold DNA;脱氧核糖核酸(DeoxyribonucleicAcid EDTA:乙二胺四乙酸(EthylenediaminetetraaceticAcid PBSs;磷酸盐缓冲溶液(PhosphateBufferSaliney PCR;聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction) PCV2:猪圆环病毒2型(PoreineCircovirusType2) PMws;仔猪断奶后多系统衰竭综合征(PostweaningMultisystemicwastingSyndrome) Taq酶:TaqDNA聚合酶(TaqDNAPolymerase 值;解链温度(MeltingTemperature) 试剂 除非另有规定,仅使用分析纯试剂 所有试剂均用无RNA酶污染的容器(用DEPC水处理后高压 灭菌)分装 4.1蛋白酶K(配制见附录A):一20C保存 4.2裂解缓冲液(配制见附录A):4C保存 4.3异硫氢酸肌裂解液(配制见附录A);4C保存 4.4平衡酚(配制见附录A):4C保存 4.5盼-氯仿-异戊醉(25;24;1)混合液(配制见附录A);4C保存 4.6氯仿-异戊醇(24:1(配制见附录A);4C保存 4.7氧仿;常温保存 4.8异丙醇:常温保存 4.970%乙醇;用新开启的无水乙醇和灭菌去离子水配制(符合GB/T6682要求),一20C预冷
GB/T34745一2017 4.10sYBRGreenPreMix荧光染料预混酶;5U/L,-20C保存 5 仪器设备 5.1荧光定量PCR扩增仪 5.2高速台式冷冻离心机;可控温至4C,离心速度可达12000r/min以上 5.3组织研磨器或者研钵 5.44C冰箱、一20C冰箱和一70C以下超低温冰箱 5.5可调微量移液器(2AL,l0L,100L,200AL,l000AL) 5.6振荡器 5.7高压灭菌锅 o 耗材 6.1离心管(1.5mL) 6.2透明薄壁PCR管(0.2mL) 样品采集、运输及处理 7.1样品采集 7.11采样工具 棉拭子,剪刀、缀子、1.5mL离心管、研钵 以上采样工具经121C士2C下15min高压灭菌,并干 燥处理 7.1.2组织脏器 应采集疑似发病死猪的淋巴结、肺、脾、肝 用无菌的剪刀和锻子剪取待检样品,将采集的样品装人 -次性塑料袋或其他灭菌容器,编号,用冰盒装运送至实验室冻存备用 7.1.3血清、血浆 用真空采血管或无菌注射器采集发病猪的血液,分离血清及血浆,并分装至无菌离心管中,密封,编 号后保存于4C环境中送检 7.2样品运输 样品采集后,将采集的样品放人密闭的塑料袋内(一个采样点的样品,放人一个塑料袋内),存放于 含有冰袋的保温箱中,密封,送实验室 7.3组织样品处理 取待检样品2.0g于已洗净,灭菌并烘干的研钵中充分研磨,加10mL灭菌生理盐水混匀,反复冻 融3次,3000r/min离心15nmin,取上清液转人无菌的1.5mL离心管中,编号备用 血清和血浆样品 可不经特殊处理,直接用于检测 7.4样本存放 样本在2C8C条件下保存应不超过24h,若长期保存应放在一70C以下冰箱,应避免反复冻
GB/34745一2017 融(冻融不超过3次) 操作程序 8.1病毒DNA提取 8.1.1样品标记 取灭菌的1.5ml离心管,分别加人被检样品、阳性样品与阴性样品,并在离心管上做标记,避免 混乱 8.1.2NA抽提 取n十2支1.5mL离心管,分别加人被检样本n个、阴性对照、阳性对照各300AL.,加人等体积异 硫氰酸呱裂解液(或加人等体积样品裂解缓冲液混匀,再加人蛋白酶K至终浓度为2004g/mL)，37C 水浴60min(或55C水浴30min),然后加人等体积的平衡酚,混匀器上振荡混匀5s(不能过于强烈 以免产生乳化层,也可以用手颠倒混匀) 于12000r/min离心10min 取上清液,分别加人等体积的 酚-氯仿-异戊醇(25:24:1、氯仿-异戊醇(24:1)、氯仿进行抽提 取1.5mL.离心管,吸取各管中的上清液转移至相应的管中,不能吸出中间层,加人2倍体积异丙 醇,放置一20C沉淀60 nmin或一70沉淀30min. 于12000r/min n离心5min(离心管开口保持朝离心机转轴方向放置),小心弃去上清液,倒置于吸 水纸上,沾干液体(不同样品应在吸水纸不同地方沾干);加人600"L70%乙醇,颠倒洗涤两次 于12000r/min in离心5nin(离心管开日保持朝离心机转轴方向放置),小心倒去上清液,倒置于吸 水纸上,尽量沾干液体(不同样品应在吸水纸不同地方沾干) 自然风干 8.1.3NA溶解 加人20AL灭菌去离子水,轻轻混匀,溶解管壁上的DNA,12000r/min离心30s,冰上保存备用 长期保存应放置于一70C冰箱 8.2荧光定量CR检测 8.2.1荧光定量CR反应体系的配制 在反应混合物配制区进行 从试剂保存盒中取出上游引物P1、下游引物P2,SYBRGreenm PreMix,灭菌超纯水,在室温下融化后,3000r/min离心5s 设定PCR数为十2,其中n为待检样品 数，一管阳性对照及一管阴性对照,每个样本测试反应体系配制(见附录B). 计算好各试剂的使用量,加人一适当体积的离心管中,向其中加人12.5AL×n的SYBRGreem reMix.05Lx"的上游引物l.05Lx"的下游引物巴.,0.5Lx"的灭菌去离子水并充分混合 向每个定量R管中各分装24AL转移至样本处理区 均匀 8.2.2加样 在样本处理区进行 在各设定的定量PCR管中分别加人7.2中制备的未知样本DNA溶液各 1L，盖紧管盖后,500r/min离心30s 8.2.3荧光定量CR扩增反应 在样本检测区进行 将本标准7.3.2中加样后的PCR管放人荧光PCR检测仪内,记录样本摆放顺 序 在96孔板内记录或填写被检样品、阳性对照、阴性对照
GB/T34745一2017 设定sYBRGreenI实时荧光定量PCR检测猪圆环病毒2型的反应参数(见附录B) 试验检测结 束后,根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果 o 结果判定 9.1结果分析条件设定 直接读取检测结果 阀值设定原则根据仪器噪声情况进行调整,以值线刚好超过正常阴性样品 扩增曲线的最高点为准 9.2质控标准 9.2.1阴性对照 无Ct值并且无扩增曲线 9.2.2阳性对照 Ct值应<30.0,并出现典型的扩增曲线 否则,此次实验视为无效 读取检测结果,阔值设定原则 以阔值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点的结果显示阴性为准,或可根据仪器噪声情况进 行调整 9.3结果描述及判定 9.3.1阴性判定 无Ct值并且无扩增曲线,判为阴性,表示样品中无猪圆环病毒2型病毒 g.3.2阳性判定 Ct值<30.0,且出现典型的扩增曲线,判为阳性,表示样品中存在猪圆环病毒2型病毒 9.3.3有效原则 C值>30.0,且具有扩增曲线的样品建议重做 重做结果无Ct值者为阴性,否则为阳性
GB/34745一2017 附 录 A 规范性附录) 相关试剂的配制 A.1磷酸盐缓冲生理盐水(Ps)配方 A.1.10.2mol/磷酸二氢钠水溶液;称取27.6g磷酸二氢钠(NaHPOH.O),先用适量蒸憎水溶 解,最后稀释至1000ml A.1.20.2mol/几磷酸氢二钠水溶液;称取53.6只磷酸氢二钠(NaHPO7H,O)(或Na;HPO 12H.O71.6g或NaHPO2H.O35.6g),先用适量蒸馏水溶解,最后稀释至1000mL 0.01mol/L,pH7.2磷酸盐缓冲生理盐水(PIs)的配制取0.2mol/几磷酸二氢钠水溶液14mL. A.1.3 0.2mol!/L磷酸氢二钠水溶液36nmL,加氯化钠(NaCl)8.5g,用蒸憎水稀释至1000mL 经121 " 5min高压灭菌,冷却后,无菌条件下按每毫升加人1000IU青霉素、1000g链霉素 A.2裂解缓冲液 取0.02mol/L三(羚甲基)氨基甲烧(Tis-HCl)(pH7.5),0.03mol/儿乙二胺四乙酸(EDTA),加适量 蒸馏水溶解,再加人十二烧基硫酸钠(SDS)至终浓度为1%,慢速搅拌至溶解,最后定容至1000mL A.320 mw/ml蛋白酶K 20mg蛋白酶K,加人灭菌水1ml A.4异硫氮酸腻裂解液 59.08g异硫氮酸呱,l0ml.0.5mol/儿Tris-HCl(pH6.4),10ml.0.2mol/儿EDTA(pH8.0),再加 灭菌水定容到100ml A.5平衡酚 从一20C冰冻室中取出经过液化的盼,温度升至室温后,68C水浴加热使酚溶解,加人羟基唾咻 至终浓度为0.1% 加人等体积0.5mol/LTris-HCl(pH8.0)的缓冲液,用磁力搅拌15min,待两相分 开后,尽可能彻底地移除上层水相液 加人等体积0.1mol/儿Tris-Hcl(pH8.0)到酚中,搅拌15min 待两相分开后,尽可能彻底地移除上层水相液 重复抽提,直到酚相pH大于7.8 A.6酚-氧仿-异戊醇(25:24:1)混合液 将平衡酚、氯仿和异戊醇按体积比25:24:1混合,搅拌均匀 A.7氧仿-异戊醇(24:1 将氯仿和异戊醇按体积比24:1混合,搅拌均匀
GB/T34745一2017 录 附 B 规范性附录) 英光定量PCR检测用引物、反应条件及注意事项 B.1猪圆环病毒2型sYBRGreenI实时荧光定量CR检测用引物 猪圆环病毒2型sYBRGreenI实时荧光定量PCR检测用引物见表B.1 表B.1设计引物序列 序列 扩增目的片段 名称 长度 上游引物P1 5'-GGGCCAGAATTCAACCTTAACC3 猪圆环病毒2型 171bp "CGCACTTCGGATATATGTCA了" ORF2基因片段 下游引物P2 引物浓度均为20pmmol/l 引物的！值在58C62C之间,并且上下游引物的t值不能差别太大 引物的GC含量在40%~60%之间,45%~55%最佳 B.2猪圆环病毒2型sYBRGreenI实时荧光定量PCR反应体系 猪圆环病毒2型sYBRGreenI实时荧光定量PCR反应体系试剂配制见表B.2 表B.2测试反应体系配制表 试剂 用量 上游引物 P1 0.5AL 下游引物P2 0,5AL 12.5AL sYBRGreenPreMix(包含DNA聚合酶,dNTP,SYBRGn reen Al 模板DNA 灭菌去离子水 10.54L 猪圆环病毒2型sYBRGreenI实时荧光定量CR反应参数 B.3 设定sYBRGreenI实时荧光定量PCR检测猪圆环病毒2型的反应参数 第一阶段,预变性95C/3min 二阶段,95C/15s,55C/15s,72C/15s,40个循环;荧光信号的收集设置在第二阶段每次循 第 环的退火延伸时进行,以获得样本的扩增动力学曲线 第三阶段,反应结束后先加热至95,然后再降至60C,开始以0.5C/s递增至95C检测荧光信 号得出扩增产物的溶解曲线
GB/34745一2017 B.4使用时的注意事项 在检测过程中,应严防不同样品间的交叉污染 反应液分装时应避免产生气泡,上机前检查各反应管是否盖紧,以免荧光物质泄漏污染仪器

猪圆环病毒2型病毒SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法GB/T34745-2017

猪圆环病毒2型是一种致病性较强的病毒，可导致猪的多器官感染，引起严重的经济损失。因此，对其进行快速、敏感和特异性的检测非常重要。目前，SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR技术已成为检测猪圆环病毒2型的重要手段之一。

国家标准GB/T34745-2017规定了猪圆环病毒2型病毒SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法，其基本原理是利用SYBRGreenⅠ荧光染料与靶DNA结合，测定PCR反应体系中的荧光信号强度，进而确定靶物质的含量。具体步骤如下：

步骤一：核酸提取

从猪样品（如血液、组织等）中提取病毒核酸，并进行纯化处理。

步骤二：PCR反应体系制备

按照标准要求，制备PCR反应体系，包括模板DNA、引物、SYBRGreenⅠ染料和其他试剂等。

步骤三：PCR扩增

在热循环条件下，将PCR反应体系加热至不同温度区间，进行多轮扩增，得到目标病毒靶DNA的大量复制品。

步骤四：荧光检测

通过SYBRGreenⅠ染料与PCR产物结合发出荧光信号，利用实时荧光PCR仪实时检测荧光信号，测定荧光信号阈值（Ct值），据此计算靶物质的初始含量。

以上就是国家标准GB/T34745-2017规定的猪圆环病毒2型病毒SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法。该方法具有快速、敏感、特异性高等优点，可在短时间内对大量样本进行检测，为猪圆环病毒2型的预防和控制提供了有力手段。

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