GB/T35806-2018
动物流感检测H7N9亚型流感病毒双重荧光RT-PCR检测方法
Animalinfluenzadetection—Protocolofduplexreal-timeRT-PCRforinfluenzavirussubtypesH7andN9
- 中国标准分类号（CCS）B41
- 国际标准分类号（ICS）11.220
- 实施日期2018-09-01
- 文件格式PDF
- 文本页数10页
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动物流感检测H7N9亚型流感病毒双重荧光RT-PCR检测方法
国家标准 GB/T35806一2018 动物流感检测H7N9亚型流感病毒 双重荧光RT-CR检测方法 Animalinfluenzadetection一Protoeolofduplexreal-timeRT-PCR orinfuenzavirussuhtypesH7andN9 2018-02-06发布 2018-09-01实施 中华人民共利国国家质量监督检验检疙总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/35806一2018 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草
本标准由农业部提出 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/Tc181)归口
本标准起草单位:北京出人境检验检疫局检验检疫技术中心、出人境检验检疫协会,农业 科学院哈尔滨兽医研究所、检验检疫科学研究院
本标准主要起草人;蒲静、高志强、汪琳、乔彩霞、张锡全、周琦、张鹤晓、张伟,尹捍、柏亚铎、刘艳华、 刘环、王秀荣,包红梅、韩雪清、王慧煜
GB/T35806一2018 动物流感检测H7N9亚型流感病毒 双重荧光RI-PCR检测方法 范围 本标准规定了同时检测H7和N9亚型动物流感病毒核酸的TaqMan双重荧光RT-PCR操作 方法
本标准适用于H7和N9亚型动物流感病毒核酸的快速检测和筛查
规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的
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GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T19438.1一2004禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法 GB19489实验室生物安全通用要求 缩略语 下列缩略语适用于本文件
Ct(或Cp)值;每个反应管内的荧光信号量达到设定的阀值所经历的循环数(ThresholdCyele，or CrossingPoint DEPC;焦碳酸二乙酯(Diethypyrocarbonate) FAM.梭基荧光素(Carboxyfluorescein HA:血凝素(Hemagglutinin HEX;六氧-6-甲基荧光素(Hexachlorofluorescein MGB;小沟结合物(MinorGrooveBinder NA:神经氨酸酶(Neuraminidase TAMRA:竣基四甲基罗丹明(Carboxytetramethylrhodamine) 荧光RT-PCR;实时荧光反转录聚合酶链反应(RealtinmeRT-PCR) 试剂和材料 4.1试剂 4.1.1总则;除另有说明,所用试剂均为分析纯,所用液体试剂均需使用无RNA酶的容器进行分装 4.1.2TRIzol:2笔25C保存
4.1.3氧仿;2C8C预冷
4.1.4异丙醇;-一20预冷 4.1.5DEPC水:配方见A.1
GB/T35806一2018 4.1.675%乙醇;用新开启的无水乙醇和DEPC水配制,-20C预冷
4.1.7PBs(含青霉素和链霉素);配方见A.2
4.1.8H7和N9亚型流感病毒双重荧光RT-PCR检测引物、探针序列,反应液配方见附录B 4.1.9阳性、阴性对照 阳性对照:为灭活的H7N9亚型流感病毒液或体外转录的H7和N9cRNA
阴性对照:为已知流感病毒阴性的动物组织悬液
4.2仪器设备 4.2.1荧光PCR检测仪及配套反应管(板)
4.2.2高速台式冷冻离心机(离心速度不低于12000r/min). 4.2.3台式离心机
4.2.4振荡器
42.5组织匀浆器
4.2.6冰箱(2C8C和一20两种). 4.2.7微量移液器(5AL、10AL、100AL、1000AL)及配套吸头
4.2.81.5ml.离心管(无核酸酶)和5mL采样管
5 实验室的标准化设置与生物安全管理 本方法的实验室设置与管理见GB/T19438.1一2004中的附录C;实验室生物安全管理见 GB19489
6 样品的采集与前处理 6.1总则 采样过程中样本不得交叉污染,采样及样品前处理过程中应戴一次性手套,注意无菌操作
6.2采样工具 6.2.1采样专用商品化棉拭子,剪刀,锻子,研钵,5ml.采样管,商品化一次性采样袋 6.2.2除商品化棉拭子,采样袋外，上述采样工具应经121C士2C,15min高压灭菌并烘干或经 60C干烤2h. 6.3样品采集 6.3.1拭子样品 根据动物种类,可采集咽喉拭子,泄殖腔拭子禽)或鼻拭子(猪等其他动物)
采集方法如下 取咽喉拭子时将拭子深人喉头及上颁裂来回刮2次3次并旋转,取分泌液; -取泄殖腔拭子时将拭子深人泄殖腔旋转一圈并沾取少量粪便; -取鼻拭子时将拭子深人鼻腔来回刮2次3次并旋转,取分泌物
将采样后的拭子放人盛有2.0mLPBS(含青霉素和链霉素)的采样管中,编号
6.3.2组织样品 病死禽采集肺脏或气管分泌物等组织;其他动物用无菌剪、毁采集肺脏等组织脏器,装人无菌采样
GB/35806一2018 袋或其他灭菌容器,编号
6.4样品贮运 样品采集后置保温箱中,加人预冷的冰袋,密封,24h内送实验室
6.5样品处理 6.5.1拭子样品 样品在振荡器上充分混合后,将拭子中的液体挤出,3000r/min离心5min,吸取上清液转人无菌 的1.5ml离心管中,编号备用
6.5.2组织样品 用无菌的剪刀和毁子剪取待检样品2.0g于研钵中充分研磨,再加10.0mLPBS含青霉素和链霉 素)混匀3000r/min离心5min后,取1.0ml.上清液转人无菌1.5ml灭菌离心管中,编号备用 6.6样品存放 采集或处理好的样品在28C条件下保存应不超过24h;若需长期保存,应放置一70C冰箱 中,但应避免反复冻融(冻融不超过3次). 其他样品说明 急性感染且出现病毒血症的动物也可采集全血分离血清或血浆进行检测
H7N9流感病毒疫情监测需要采集环境样品,应根据具体环境情况采集可能含有流感病毒的样品 如笼具表面、禽鸟粪便、产品加工砧板或用具表面等环境样品
双重荧光RT-CR检测操作方法 7.1样本核酸的提取 7. 在样本制备区进行,采取TRIzol裂解法提取
也可采取其他等效的RNA提取方法
. 7.1.2待检样品、阳性对照和阴性对照的份数总和用n表示,取n个灭菌1.5ml离心管,逐管编号
7.1.3每管加人600LTRlol. 7.1.4每管对应编号分别加人300L待检样品、,阳性对照或阴性对照,混匀
71.5每管加人200L氯仿,充分颠倒混匀,于4c.,1200r/nm离心151 min
716 新取n个灭菌的1.5ml离心管,逐管编号,每管加人5004L异丙醇(一20C预冷 7.1.7吸取7.1.5各管中的上清液500L,转移至7.1l.6相应的管中,避免吸出中间层,颠倒混匀
7.1.8于4C、12000r/ )r/min离心15min, ,轻轻倒去上清,倒置于吸水纸上,沥干液体,不同样品应在吸 水纸不同地方沥干
7.1.9每管加人600L75%乙醉(一20C预冷),颠倒洗涤
7.1.10于4、12000 r小 离心10min,轻轻倒去上清,倒置于吸水纸上,沥干液体,不同样品应在 min 吸水纸不同地方沥干
7.1.114000r/min离心10s,将管壁上的残余液体甩到管底部,用微量移液器尽量将其吸干
注意一 份样本换用一个吸头,吸头不要碰到有沉淀一面
7.1.12室温干燥3min
不宜过于干燥,以免RNA不溶
7.1.13每管加人11lALDEPC水,轻轻混匀,溶解管壁上的RNA,2000r/min离心5s,获得RNA溶
GB/T35806一2018 液,冰浴保存备用
提取的RNA应立即进行荧光RT-PCR扩增,或者4C保存不超过8h;若需长期保 存应放置一70C冰箱中 7.2双重荧光T-CR扩增试剂的准备与配制 在反应混合物配制区进行
每个检测反应体系需使用15L荧光RT-PCR反应液
根据7.1.2中提到的"值,按B.2配制反 应液,充分混匀后分装,每个反应管15L
转移反应管至样本制备区
7.3加样 在样本制备区进行
在上述7.2的反应管中分别加人7.1.13中制备的RNA溶液10aL,使每管总体积达到25AL,记录 反应管对应的样品编号
盖紧管盖后,500r/min离心30s
7.4荧光RT-PCR反应 在检测区进行
应使用能采集并区分FAM和HEx或Ic)这两种不同荧光信号的多通道荧光PCR仪
将7.3中加样后的反应管放人荧光PCR检测仪内,编辑样品表后,选定FAM检测通道读取H7亚 型流感病毒检测结果,并选择TAMRA淖灭基团;选定HEX(或VIC)检测通道读取N9亚型流感病毒 检测结果,并选择无荧光淬灭基团
之后如下设置反应参数 第一阶段,反转录42C/30min; -第二阶段,预变性94C/31 min; -第三阶段,92C/15s,53C/10s,60C/35s,40个循环,在第三阶段每次循环的退火延伸时 收集荧光
试验结束后,根据收集的荧光曲线和Ct(或Cp)值判定结果
结果判定 8 8.1结果分析条件设定 值设定原则;根据仪器噪声情况进行调整,以值线刚好超过阴性对照品扩增曲线的最高点 为准
8.2质控标准 8.2.1阴性对照通过两个检测通道读取数据均无C(或Cp)值并且无扩增曲线
8.2.2阳性对照通过两个检测通道读取数据出现两条对应的特征性扩增曲线,且Ct(或Cp)值均应 <30.0. 8.2.3如阴性和阳性对照不满足以上条件,此次试验视为无效 8.3结果描述及判定 8.3.1阴性 两个检测通道均无c(或Cp)值并且无特征性扩增曲线,表明样品中无H7亚型和N9亚型流感病 毒核酸
8.3.2双检测通道阳性 两个检测通道出现两条对应的特征性扩增曲线,且Ct(或Cp)值<30.0,表明样本中同时存在H7
GB/35806一2018 亚型和N9亚型流感病毒核酸
8.3.3单检测通道阳性 当有一个检测通道出现特征性扩增曲线时,按照下面的原则进行结果判定: 如仅FAM检测通道出现特征性扩增曲线且Ct(或Cp)值<30.0,而HEX(或VIC)检测通道 无Ct(或Cp)值并且无扩增曲线,表示样本中存在H7亚型流感病毒核酸,但不含有N9亚型 流感病毒核酸
-如仅HEX(或VIC)检测通道出现特征性扩增曲线,且Ct(或Cp)值<30.0,而FAM检测通道 无Ct(或Cp)值并且无扩增曲线,表示样本中存在N9亚型流感病毒核酸,但不含有H7亚型 流感病毒核酸
上述结果描述及判定可参见表1
表1结果描述与判定 类型 FAM检测通道HEX(或Vc)检测通道 结果描述判定 阳性 阳性 同时存在H7亚型和N9亚型流感病毒核酸 存在H7亚型流感病毒核酸,但不含有N9亚型流感病毒 阳性 阴性 核酸 存在N9亚型流感病毒核酸,但不含有H7亚型流感病毒 阴性 阳性 核酸 阴性 阴性 无H7亚型和N9亚型流感病毒核酸 8.3.4有效原则 任一检测通道的Ct(或Cp)值>30.0,且出现典型扩增曲线的样品建议复检
复检仍出现上述结果 的,判相应通道检测的流感病毒亚型为核酸阳性,否则判为阴性
GB/T35806一2018 附 录 A 规范性附录) 溶液配制 以下所用试剂均为分析纯
DEPC水配方 A.1 将DEPC加人去离子水(符合GB/T6682要求)中至终浓度为0.1%<体积分数),充分混合均匀后 作用12h,分装,121C士2C高压灭菌30min冷却后冷藏备用
A.2磷酸盐缓冲液(Ps)配方(含青霉素和链霉素 A.2.1A液 0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液;NaH,PO
H.027.6g,溶于燕榴水中,最后定容至1o00mL
A.2.2B液 0.2mol/儿磷酸氢二钠水溶液:NaHPO7H.O53.6g或NaHPO12H.O71.6【或 NaHPO2H.O35.6g),加蒸馏水溶解,最后定容至1000mL
A.2.30.01mol/L,pH7.2磷酸盐缓冲液(PBs)(含青霉素和链霉素)的配制 取A液14mL,B液36ml,加NaCl8.5g,牛血清白蛋白5g,用蒸馏水定容至1000mL 经 121C士2C,15tmin高压灭菌后,冷却后,无菌条件下分别按10000U/mL加人青霉素和链霉素
GB/35806一2018 附录 B 规范性附录 引物探针序列及荧光RI-PCR反应液配方 引物和探针 B.1 本标准方法中使用的引物探针名称和序列见表B.1
表B.1引物和探针的名称及序列 引物或探针名称 序列(5'-3' H7上游引物 5'-AAAATAGAATACAGATWRACCCRGT H7下游引物 GTGCAcYGcATGTTcc-3 5'- H7探针 5'-[FAM]-cTTcGGGGcATcATGTTTYMTwCTTcTRG-[TAMRA]-3" 5'-cCAAATcAGAAGATTCTATGCACYT-3' N9上游引物 N9下游引物 GGTTTGCYATTcCwATGARYA-3' N9探针 5'-[VIC]或[HEX]-GcCACTGCYATYRTAATA-[MGB]3' 注:引物和探针可由生物公司合成,纯度为HPLC级,用DEPC水溶解并稀释至终浓度10mol/L,一20保存备用 B.2荧光RT-PCR反应液配方 本标准方法中使用的H7N9荧光RT-PCR的反应液组分及含量见表B.,2
表B.2荧光RI-PCR反应液的组分及含量 组分 1个检测体系的加人量 5×RT缓冲液" 5.,0Al Mg(Cl.(25mmol/1) 3.0Al dNTP(10mmol/L 1.,0从l H7上游引物(204mol/L 0,5Al 0.5 H7下游引物(20Hmol1 Al H7探针(104mol/L) 0.375l N9上游引物(20Amol/L 0.6254 N9下游引物(204mol/L) 0.625AL N9探针104mol/I 0.5Al M-MlV反转录(200U/4L 0.54l 025儿 RNA酶抑制剂(40U/AL) Ex" 0.25nl TS#6UE
GB/T35806一2018 表B.2(续 组分 1个检测体系的加人量 DEPC 水 1.875A 5×RT缓冲液的组成为;375mmol/1KC,15nmmol/LMgCl、50tmnmol/1DTT,250mmol/LTris-HC pH8.3,25) ExTaqHs酶;具有5'-3'外切活性
B.3注意事项 在检测过程中,应严防不同样品间的交叉污染
反应液分装时应避免产生气泡,上机前检查各反应管是否盖紧,以免荧光物质泄露污染仪器
动物流感检测-H7N9亚型流感病毒双重荧光RT-PCR检测方法GB/T35806-2018
什么是H7N9亚型流感病毒？
H7N9亚型禽流感病毒是一种最近发现的、可感染人类的病毒。它是由多种不同禽类（包括鸡、鸭和鹅）中的流感病毒基因片段重新组合而来的。
为什么要检测动物流感？
动物流感是一种病毒性疾病，它可以传染给人类。当动物流感病毒在人类中传播时，可能会导致严重的健康问题，甚至会引起全球性大流行病。
双重荧光RT-PCR检测方法是什么？
RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）是一种常用的核酸检测技术，可快速、准确地检测出病毒的核酸序列。GB/T35806-2018标准中规定了一种双重荧光RT-PCR检测方法，可以同时检测H7和N9基因片段，从而确定病毒亚型。
双重荧光RT-PCR检测方法的优点
- 高灵敏度：此方法可以检测到极低浓度的病毒核酸。
- 高特异性：此方法可以准确地检测出H7N9亚型流感病毒。
- 快速：此方法只需要数小时就可以得到结果。
- 易于操作：此方法具有简单、快捷、易学等特点，适用于大规模的检测。
使用双重荧光RT-PCR检测方法的注意事项
- 严格控制实验室环境，以防污染。
- 准确制备试剂和标准品，以确保检测结果的准确性。
- 正确处理样本，并严格按照操作规程进行实验。
- 在实验中添加内标，以检测反应的可靠性。
结论
GB/T35806-2018标准中规定的双重荧光RT-PCR检测方法可以快速、准确地检测出动物中的H7N9亚型流感病毒。这种方法具有高灵敏度、高特异性、快速和易于操作等优点，因此在动物流感的检测中具有重要的应用价值。
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