国家标准 GB/T28976一2012 草莓潜隐环斑病毒检疫鉴定方法 Deteetioamdidentifieationofstrawberrylatentringspotvirus 2012-12-31发布 2013-06-01实施国家质量监督检验检疫总局发布国家标准化管理委员会国家标准
GB/T28976一2012 前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口本标准起草单位;上海出人境检验检疫局、宁波出人境检验检疫局、江苏出人境检验检疫局本标准主要起草人:杨翠云、于翠闻伟刚、郑建中,印丽萍、李彬
GB/T28976一2012 草莓潜隐环斑病毒检疫鉴定方法范围本标准规定了草莓潜隐环斑病毒的检疫鉴定方法本标准适用于植物材料,包括无性繁殖材料、种子和苗木中草莓潜隐环斑病毒的检疫鉴定规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 sN/T1840植物病毒免疫电镜检测方法 SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样草莓潜隐环斑病毒基本信息中文名:草莓潜隐环斑病毒学名:strawberrylatentringspotvirus 缩写SLRSV 分类地位:Secoviridae科,温州蜜柑矮缩病毒属(Sadwauirus) 草莓潜隐环斑病毒的其他信息参见附录A 方法原理病毒粒子的形态特征、为害症状、血清学特性和分子生物学特征是检疫鉴定该病毒的主要依据,采用DAsELISA,RT-PCR,实时荧光RT-PCR,免疫电镜和鉴别寄主反应等方法进行检疫鉴定仪器设备,设施、用具和试剂仪器设备酶标仪,PCR仪,实时荧光PCR仪,超净工作台、电子天平(感量0.001g),电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、电子透射显微镜、水浴锅、高速冷冻离心机、超低温冰箱(一80)、高压灭菌锅、制冰机、微波炉,涡旋振荡器 5.2设施植物隔离检疫闻 5.3用具可调式微量移液器olL.0L.oL.aoL.Iw,L)及相应的无RNiwc吸头.无RNae离心管,PCR管、研钵、样品袋、标签,锻子,放大镜等 5.4试剂 5.4.1除有特殊说明外,所有实验用试剂均为分析纯或生化试剂
GB/T28976一2012 5.4.2SLRsV抗体、Trizol,焦碳酸二乙酯(DEPC),液氮、三氯甲婉、异戊醇、异丙醇,乙醇、8筑基乙醇、AMV反转录酶、TaqDNA聚合酶、,DNA相对分子质量标记、澳化乙锭、琼脂糖、澳酚蓝等血清学和分子生物学检测试剂配制见附录B 症状观察及抽样 6.1症状观察现场检疫主要观察进境植物材料上病毒为害的症状,SLRSV为害症状描述参见附录A 6.2抽样发现有病毒为害症状的植物材料直接送检;未发现症状的,则按SN/T2122中规定进行抽样,并送实验室检疫鉴定检疫鉴定鉴定流程判定样品中是否携带草莓潜隐环斑病毒,应经过两种或两种以上的检测方法相互验证具体操作流程可参照图1 稍毒寄主植物/样品 RTPCR DAS-ELISA 两种方法检测两种方法检测仅一种方法检测结结果均为阳性果为阳性结果均为阴性样品携带SLRsv 样品不携带M.Rsv 兔免疫电镜、鉴别寄主反应或实时荧光RTPCR 至少一种方法检测结果均为阴性检渊结果阳性图1sSLRS鉴定流程图
GB/T28976一2012 7.2双抗体酶联免疫吸附方法(DAS-ELISA 对种苗、球茎或由种子催生长出的叶片研磨,并按质量和抽提缓冲液1;10的比例稀释,制备的汁液分别盛装于离心管中,离心后吸取上清液作为待测样品,并设阳性对照,阴性对照和空白对照具体操作步骤见附录C 7.3RI-CR方法植株叶片,种球或种子液氮研细,取0.lg用于提取植物总RNA 具体操作步骤见附录D. 实时荧光RI-PCR方法植株叶片,种球或种子液氮研细,取0.1用于提取植物总NA 具体操作步骤参见附录E 7.5鉴别寄主测定方法在栽种于植物隔离检疫闻中的鉴别寄主植物真叶长出后用于摩擦接种,对DASELISA或 RT-PCR检测sLRsV呈阳性的样品加人适量接种缓冲液研磨后接种鉴别寄主当任意一种鉴别寄主植物出现如下描述症状时,即可判定接种成功对接种后表现隐症的鉴别寄主植物,还需要对接种叶片结合DAs-ELISA或RT-PCR方法验证,如果结果阳性则判定样品携带sLRsv wpdiwm 苑色蔡(Chenopliumamaranticolor)或昆诺黎(Cheno guinoa):接种叶7d内局部褪绿 a 或坏死斑,以后是系统褪绿或变形,有时出现坏死或轻微的褪绿斑; b菜豆(Phaseolusvuwlgaris);接种叶出现局部褪绿或坏死斑; c)黄瓜(Cuucumissativus):系统感染黄瓜,引起脉间褪绿和坏死,有时无症状 d)黄花烟(Nicotfianarustica)或矮牵牛(Petuniahybrida);属系统性侵染且无症状出现 7.6免疫电镜方法利用草莓潜隐环斑病毒抗血清富集植物材料中的病毒,在透视电子显微镜下观察病毒颗粒的形态特征,具体操作步骤按照SN/T1840规定进行如观察到直径为30nm的球状病毒粒子,即可判定免疫电镜结果阳性结果判定 8.1样品经DASELISA或者RT-PCR检测结果为阴性,判定该样品不携带草莓潜隐环斑病毒 8.2样品经DAs-ELISA检测为阳性,如果RT-PCR结果阳性,且序列测定结果证实与所检测的草莓潜隐环斑病毒一致;或者经实时荧光RT-rCR检测为阳性时,可判定样品携带草莓潜隐环斑病毒 8.3样品经DAS-ELISA或者RT-PCR检测结果为阳性，经免疫电镜观察到病毒颗粒或者接种鉴别寄主植物出现相应的症状时,可判定样品携带草莓潜隐环斑病毒样品保存与记录结果 9.1样品保存;经检测确定携带草莓潜隐环斑病毒的样品应保存在适合的条件下以备复核如种子保存在干燥室温环境中;种苗、鳞球茎等样品保存在一80C冰箱中,做好登记和标记工作样品保存期限至少1年
GB/T28976一2012 9.2记录包括:样品来源、种类、取样人员、实验的时间、地点方法和结果、检疫员的签字等酶联免疫吸附测定法检测应有酶联板反应的数值,生物学测定应有鉴别寄主的症状照片,免疫电镜检测需要有电镜图片,RT-PCR检测应有电泳图及序列测定分析结果实时荧光PCR需要有荧光曲线图与C值结果记录与资料保存期限至少1年
GB/T28976一2012 附录A 资料性附录草莓潜隐环斑病毒相关资料 A.1寄主范围 SLRSV寄主范围比较广自然条件下,SLRsV可以侵染许多野生和栽培的寄主植物在机械接种的167种双子叶植物中,受侵染的高达27科126种植物该病毒主要为害草莓、覆盆子,欧洲甜樱桃、百合、芦笋、黑莓、黑醋栗、红醋栗、葡萄、李子、桃子、大黄和水仙等多种植物 A.2为害症状 SLRsV影响寄主植物的整个生长期,绝大多数是系统性侵染但不表现症状系统感染草莓(Fra pp.)覆盆子(Rdn.idee)和洲卫矛(Ewnymewpua)形成不同程度的斑驳;,为害欧洲 garia 甜樱桃(Pruusaium),桃(Prunusersica),西洋接骨木(Sambucusnigra、黄瓜(Cucumissalius) 等,引起脉间褪绿和坏死等症状;为害芹菜(ApiunLmn.)形成舌形叶;为害刺槐Robinia sa)形成绿色环斑及矮化 seudloacacia)造成花叶症状;还可以侵染玫瑰(Rosrugo. A.3分布地区欧洲比利时,前捷克和斯洛伐克、芬兰、达国、德国,意大利,卢森堡,荷兰、波兰、葡萄牙,瑞士、,西班牙,英国大洋洲:新西兰美洲;加拿大 A.4传播方式 A.4.1介体传播 SLRSV传播介体主要为裂尾剑线虫(Xiphinemadiversicaudalum)和考克斯剑线虫(Xiphinema ori),并且成虫和若虫都可以传毒 A.4.2种子及无性繁殖材料传毒病毒可通过种子及种球,块茎和苗木等无性繁殖材料远距离传播,如可以随百合和郁金香等种球的调运进行传播该病毒为害薄荷(Menthaarensis),宝盖草(L.amiumamlericaule),悬钩子(Rubus Linn.、繁缕(Selariamedia),昆诺藜(Cheoodliumquina)和芹菜(ApiumLinn.)等寄主植物并以种传的方式进行传播,在薄荷等寄主上的种传率超过70% A.4.3摩擦接种传毒 SLRsV为害草本植物时,病毒的汁液易通过摩擦接种传毒但当sLRsV为害木本植物时,其中的多酚类物质抑制了病毒的侵染性,病毒汁液应置于2%的烟碱溶液中或高pH值的缓冲液中才易接
GB/T28976一2012 种成功 A.5粒体形态 SLRSV颗粒大小相等,直径30nm,通常有明显的六边形轮廓 A.6基因组 SLRSV单链RNA,总长12.6kb由两部分组成,分别长为7.8kb和4.8kb 在蛋白质组成上 sLRsV颗粒包含两种多肚分子,相对分子质量分别是43kDa和27kDa,而多面体属病毒一般只有一种相对分子质量为55kDa的多肽
GB/T28976?2012 ? B 淶?? B.110PBSr?(plH7.4) ?(NaCD) 80g (KH,PO 2g (NaaHPO. 1.5g ?(? 2g (Tween-20) 5ml 900mL?,?(HCI)pH7.4,1000ml B.2???(pH7.4) (NasO. 1.3g ???(PVP) 20g (NaN 0.2g -2o Tween- 20nl. 900mL1PBST,HCIpH7.4,1000 ml B.3建?pH9.6 ?(NaecO. 1.59g ?(NaHcO 2.93g ?900ml?,?(HCI)pH9.6,1000ml B.4??建?(pH7.4) 800mL 1PBST? ???(BSA 2g PVP(MW2400040000 20 g ??1000ml B.5(pNPp)?(pHI9.8 97mL ? NaN 0.2 g ?600ml???,?(HC)pH9.8,??1000mL
GB/T28976?2012 B.6??? (NaOH)120g1000ml.??,?3mol/L B.7??TAE(50 ??(Tris 242g 52.1mL ?EDTA0.5mol/L 100tmL ????1TAE B.8??(EB)?(10g/L λ? 20mg ?? 20ml
GB/T28976一2012 附录c 规范性附录双抗体酶联免疫吸附方法(DAs-EL.IsA C.1检测 C.1.1根据检测需要将适量的孔条放于酶联板架上,包括2个阳性对照孔,2个阴性对照孔,2个空白对照孔和多个待检测样品孔待测样品孔每个样品重复一次 C.1.2每孔加人100AL的SLRsV的包被抗体溶液,封口膜包好,37C孵育2h4h(或4C冰箱过夜) C.1.3将酶联板孔中溶液控干,用200AL的1×PBST洗涤液洗涤酶联板3次,每次3min,然后在滤纸上控干将100L待测样品溶液加人到待检测孔中,对照孔中也各加人100L相应的阴性对照、阳性对照和空白对照封口膜包好,37C孵育2h(或4C冰箱过夜) C.1.5洗涤,步骤同C.1.3 C.1.6用酶标抗体稀释缓冲液按照要求稀释SLRsV酶标抗体,每孔加人100AL酶标抗体溶液,封口膜包好,37C孵育2h4h C.1.7洗涤,步骤同C.1.3. C.1.8将pNPP溶于底物缓冲液中,使最终浓度为1mg/mlL 每孔加人100L.配好的底物溶液,室温孵育0.5h2h 必要时每孔加人50AL的3mol/儿氢氧化钠溶液终止反应 C.1.9酶标仪405nm波长下检测各孔的吸收值并记录 C.2结果判定 C.2.1质量控制要求缓冲液孔和阴性对照孔的oD值小于0.15,阴性对照孔的oD值小于0.05时按0.05计算阳性对照有明显的颜色反应,孔的重复性以样品oD值的平行允许率控制,按照式(C.1)进行计算 OD1一OD P= ×100% .. C.1 oDoDT? 式中: 平行允许率; OD -重复样品l; OD. 重复样品 2 当重复检测样品OD值平行允许率(P)小于20%时,判定检测结果有效 C.2.2若满足不了C.2.1的质量要求,则不能进行结果判定 C.2.3在满足了C.2.1的质量要求后,则按如下原则作出判定样品ODs/阴性对照OD值大于2,结果判定为阳性; 样品OD/阴性对照OD值在闵值附近,判为可疑样品,需重做或用其他方法进行验证; 样品OD/阴性对照OD值小于2,判为阴性
GB/T28976一2012 附录D 规范性附录 RT-CR方法 D.1RNA提取 D.1.1取0.1g待测样品,液氮研细,加人1mlTrizol,混匀,倒人1.5mL离心管中 D.1.2加人0.2mL三氯甲烧,猛烈振荡15s,411000r/min离心10 min， 1,小心吸取上层无色水相到新离心管中 D.1.3加人等体积异丙醇,混匀,一20C静置10min,！C12000r/min离心15min,保留沉淀 D.1.4加人1mL.75%冷乙醇,悬浮沉淀,4C8000r/min离心10min,干燥沉淀 D.1.5加人30AlDEPC-H.O,溶解沉淀(必要时,55C一60水浴10min,加速溶解),存于一80 备用注，或者按照商品RNA提取试剂盒进行操作 D.2引物序列正向引物SLRsV-F:5'-GATGcCTATcGGTACTTTGGTTC3'’ 反向引物SL.RsV-R:5'-GTAGTTGCcGGATTCAATCTcC-3’ 扩增片断长度298bp D.3反转录利用提取的RNA在PCR管中进行反转录首先加人2AL 模板RNA，1Al下游引物 (20pmol/L).9LDEPc-H.0混合后70C温育5min,立即置于冰上2min后加人4L.AMV缓冲液,2l.dNTP(10mmol/1L),ll.AMV反转录酶(5U/L),1MLRNA酶抑制剂(40U/L),42 反应1h 也可采用RT-PCR一步法试剂盒,操作步骤按使用说明进行 D.4核酸扩增 PCR反应体系见表D.1,每个样品设2个平行处理反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整检测时以含草莓潜隐环斑病毒材料的cDNA或含有草莓潜隐环斑病毒目标片断的质粒作为阳性对照,以健康植物材料的cDNA作为阴性对照,以水代替模板作为空白对照 PCR反应条件:94C3min;94C30s、54C45s、72C45s.30个循环;72C10min延伸表D.1PCR反应体系名称储存液浓度终浓度加样量/l PCR缓冲液 10 dNTP 2.5mmol/L 0.2mmol/I MgC 25mmol/L. 2.0mmol/L 10o
GB/T28976一2012 表D.1(续加样量/Al 名称储存液浓度终浓度上游引物 0.2 204mol/L 0.164mol/1 下游引物 0.2 20mol/L 0.164mol/1 DNA聚合酶 5U/L Tu" 0.06U/pl 0.3 cDNA 2.5 补水至 25 D.5琼脂糖凝胶电泳检测 D.5.1制备凝胶用1×TAE配制1.5%琼脂糖凝胶,加热融化后冷却至55C左右 D.5.2加澳化乙锭将澳化乙锭(EB3)加人到配制好的凝胶中,EB终浓度为0.54g/ml 将凝胶倒人凝胶槽中,捕上样品梳子冷却凝固后拔掉梳子,在电泳槽内加人1×TAE,缓冲液要没过凝胶表面约1mm， D.5.3加样将加样缓冲液与样品混合后加人样品孔同时设计PCR的阴性对照和阳性对照,并加人相对分子质量标准物(Marker) D.5.4电泳接通电源,以3V/enm一5V/em电场强度进行电泳,0.5h后观察结果 D.5.5结果观察电泳结束后,将整个凝胶置于凝胶成像系统上观察,记录结果 D.6结果判定 D.6.1通过观察,在298bp位点上,阳性对照应出现相应条带,阴性和空白对照不会出现相应条带,此时如果检测样品在上述位点上呈现出条带应被判为阳性,否则应被判为阴性 D.6.2如果是阳性可通过测序的方式进一步确认如果PCR产物序列与草莓潜隐环斑病毒的序列同源,则可判定样品为草莓潜隐环斑病毒阳性,若序列不同源,则可判定样品为草莓潜隐环斑病毒阴性 11
GB/T28976一2012 附录 E 规范性附录实时荧光RT-PCR方法 E.1实验步骤 E.1.1引物和探针设计引物序列:sLRsV-FP;5'-AGATGGccTCcAGTAccAcCcAGA-3 SLRSV-RP:5'-CCCCAAAGTGTTCCTTTCACA-3” 探针序列:SLRSV-MGB-PROBE:FAM-5'-CTCACCAGTATGCTGCTT-3’-MGB E.1.2RNA提取及反转录操作方法见附录D. E.1.3实时荧光PCR反应体系实时荧光PCR反应体系见表E.1,每个样品设2个平行处理并设阳性对照、阴性对照和空白对照,以含有草莓潜隐环斑病毒的cDNA为阳性对照;以健康植物材料的cDNA作为阴性对照;以水代替 DNA模板作为空白对照每种对照各做2个平行管表E.1实时荧光CR反应体系贮备液浓度终浓度加样量/l. PCR缓冲液 10× 2.5 MgC 25mmol/ 3.0mmol/1 dNTP 10mmol/L 0.2mmol/L 0.5 正向引物 20Amol/L 0.24Amol/L 0,3 反向引物 20mol/1 0.244mol/I 0.3 TaqDNA聚合酶 0.2 5U/l 0,04U/l 探针 0.5 20mol/L 0.44mol/L eDNA 补水至 25 E.1.4实时荧光PCR反应参数反应条件;预变性94C10min,94C15s,60C40s,72C40s,共40个循环本反应条件适用于 AB17500型荧光PCR仪,如使用其他荧光PCR仪,可根据仪器性能进行适当调整操作方法按照仪器的使用说明进行,反应结束后保存各项数据和图像 12
GB/T28976一2012 E.2结果判定 E.2.1闭值设定闵值设定根据仪器噪音情况进行调整,或以阀值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点,结果显示阴性为准 E.2.2结果判定在阳性样品和阴性样品C值正确的情况下,进行以下判定 -待测样品的Ct值为40或无Ct值时,则判定结果阴性; -待测样品的C值小于或等于35时,则判定结果阳性; 待测样品的Ct值小于40而大于35时,应重新进行测试,如果重新测试的C值为40时,则判定结果阴性如果重新测试的Ct值小于40而大于35时,则判定结果阳性 13

草莓潜隐环斑病毒检疫鉴定方法GB/T28976-2012

草莓是一种重要的水果，在全球范围内受到广泛关注。然而，草莓生产过程中会遇到很多病害问题，其中潜隐环斑病毒是草莓生产中常见并且具有破坏性的病毒之一。

为了保障草莓产业的健康发展，我国制定了GB/T28976-2012《草莓潜隐环斑病毒检疫鉴定方法》标准。该标准规定了检测样品的采集、处理、检测方法和结果判定等内容。

样品采集和处理

样品采集需要选择健康的草莓植株，采集叶片和茎尖，并立即送检。在采集过程中要注意手套的更换，以免因人为原因造成污染。

采集回来的样品需要进行处理，先用去离子水冲洗，再用三氯乙酸（TCA）混合匀浆，沉淀后用0.01mol/L磷酸盐缓冲液重悬，得到提取液作为检测的样品。

检测方法

GB/T28976-2012标准规定了两种检测方法：间接酶联免疫吸附试验（IC-ELISA）和反转录聚合酶链式反应检测法（RT-PCR）。

IC-ELISA是一种常规的免疫学检测方法，其优点是操作简单、结果可靠，适用于大批量的检测。而RT-PCR则是一种基于核酸的检测方法，其灵敏度高、特异性强，但需要较为专业的实验条件和设备。

结果判定

对于IC-ELISA和RT-PCR的检测结果，均需经过阳性对照和阴性对照的比较，才能确定样品是否为潜隐环斑病毒阳性。

总之，GB/T28976-2012标准提供了一份规范的草莓潜隐环斑病毒检疫鉴定方法，对于保障草莓产业的健康发展具有重要意义。