裙带菜

裙带菜

国家标准 GB/T25166一2010 裙 带 菜 Wakame 2010-09-26发布 2011-05-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T25166一2010 裙 带 菜 范围 本标准规定了裙带菜[UndariabinnatifidaHarvey)Suringa]主要形态构造特征,生活周期与繁 殖、遗传学特征以及检测方法 本标准适用于裙带菜的种质检测和鉴定 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 NY/T5283一2004无公害食品裙带菜养殖技术规范 名称与分类 3.1种名 裙带菜[Undariapinnatifda(Harv.)Suringar] 3.2分类 褐藻门(Phaeophyta)、褐子纲(Phaeosporeae)、海带目(L.aminariales)、翅藻科(Alariaceae)、裙带菜 属(Unaria 主要形态构造特征 外部形态特征 4.1.1抱子体形态 藻体明显分为固着器、柄和叶片三部分 裙带菜抱子体外部形态见图1 袍子叶; -固着器; -中肋 -柄; -叶片; 图1裙带菜抱子体的外部形态
GB/T25166一2010 4.1.2固着器 由多次双分枝的圆柱形假根组成,其末端有吸盘 4.1.3柄 扁平,其腹背隆起而稍圆,柄的边缘有狭窄的龙骨 藻体接近成熟时,在柄的两侧形成耳状袍子叶， 抱子叶定义见NY/T52832004中的3.3 4.1.4叶片 褐色具光泽 幼时长盾形,边缘光滑无缺刻,为单叶 成藻为羽状裂片,叶片的中部是由柄部延伸 而来的中肋,中肋扁平隆起直达叶片的顶端 成藻一般长1.0m一2.5m,宽50cm100cm 4.2袍子体内部构造特征 表皮 4.2.1 由一层个体小,排列紧密和整齐的细胞组成,呈栅栏状 细胞含粒状色素体 4.2.2皮层 外皮层细胞呈柱状,大小不等,排列不整齐 内皮层细胞大小相近,排列较整齐 4.2.3髓部 细胞呈丝状或树枝状,排列疏松 生活周期与繁殖 5.1生活史 明显的抱子体(2n,大型)与配子体(n,微型)不等世代交替型 5.2生命周期 裙带菜的生命周期为一年 5.3繁殖 5.3.1性成熟年龄 8个月12个月 5.3.2无性繁殖 弛子体柄部产生抱子叶,抱子叶上产生抱子囊群,抱子囊内形成游抱子 游抱子单细胞,梨形,长 9Am~11m,宽5Am6Am,有两条侧生不等长鞭毛,长的14.0Am16.5Am,伸向前端,短的 5.34m~7.0am,伸向后端 5.3.3有性繁殖 卵配方式 雄配子体产生精子囊,每个精子囊产生一个梨形精子,精子(n)长4Am~5Am 雌配 子体产生卵囊,每个卵囊产生一个卵n),卵成熟后排出体外粘着在卵囊口处与精子结合生成合子 (2n) 遗传学特征 染色体数 6 抱子体细胞染色体数2n=60. 6 2 DNA序列特征 2.1ITS-1序列:总长度242bp 6 ccgatcaggaaggggacaccctcctgacactaccgtcgtgcgcgtcggttttgtaaaccccgagaaagaa 71 aatcgttacgcgatgttgggcgaggggcgcctcgccgagggttaattccctcgaatcaaagegcacccca 14 cttttcaaccccattaaactctgaatctgaactcaaaaggggggcatgCgcgCgcccgCgcgcgCggctc 211 ccccaacctttaacgttgtaaaactttcagcg 6.2.2ITS-2序列:总长度273bp
GB/I25166一2010 cccctccctccccctctctttgtggggggggggggggtttcggggcggactatgagtgttccggagcgtc 71 cgcgctccgagtgcacccaatctcgtgaacgaagcctctcgCgccctgccgcacagagttgttgacggCg 141ctcgctteggcggcgactctcgactcaccaaacgtgcgcggggattcgcctgcttcattccggeteatge 21l cttttccccccccccgcccccacgcaagtgagggagggagggaaggagaggccatatccacac 6.2.3裙带菜不同晶系核糖体ITS全序列(ITS-1+ITS-2)变化幅度为010个碱基 检测方法 形态构造特征检验 采用肉眼和显微镜观察相结合的方法 7.2染色体检验 7.2.1标本的制备 压片法 7.2.2染色液 2%地衣红溶于70%的乙酸中 7.2.3 染色方法 固定材料在自来水中浸泡15nin30min后压片 揭开盖片,滴人乙酸地衣红后盖片0.5h,用滤 纸吸出多余的染色液,石蜡封片 7.3裙带菜IIs序列的检测 7.3.1裙带菜配子体基因组DNA的提取 取约1g(湿重)的裙带菜配子体,加少量石英沙和PVP40,在液氮中研成粉末 将粉末转至50mL 的离心管中,加人15ml裂解缓冲液(10mmol/LTris-HCl,10mmol/1EDTA,1.0mol/儿LNaCI. 1.0%cTAB,1%sDs,pH=8.0),在65C保温1h,期间摇匀几次 用等体积的酚;三氯甲烧:异戊 醇(25:24:1,体积比)抽提两次,再将水相转移至一新的50ml离心管中,加人1/10体积NA酶， 37C保温1h,再用三氯甲烧:异戊醇(24:1,体积比)抽提一次,用2/3体积的异丙醇沉淀回收DNA DNA最后溶于100Al的TE(10mmol/儿Tris-HCI,pH=8.0;1mmol/L EDTA,pH=8.0)中 7.3.2IIs特异性扩增 总反应体积为20AL,含10mmol/儿Tris-HCl,pH=8.3,50mmol/1 KC,1.5mmol!/IMgCl Taqpolymerase1U,！种dNTP各2mmol/儿L,两个引物各4mmol/L一6mmol/L(正向引物P1;5’ CGCGAGTCATCAGCTcGCATT-3';反向引物P2:5'-AGcTTcACTcGcCGTAcTGG-3'),模板 DNA10ng,其余用双燕水补满 PCR反应参数:96C预变性5min;96C,30s;72,60s;55,30s,37个循环;72C,保温 5min 7.3.3测序 参照DNA测序仪进行测序(参见附录A) 判定规则 被检样品完整并符合本标准第4章要求的为合格样品 如被检样品不完整需增加第5章,第6章 内容进行检验,均符合上述质量要求的为合格样品
GB/T25166一2010 附 录 A 资料性附录 DA序列的测序 A.1测序样品预处理 PCR扩增完毕,将样品置于一20C条件下 利用PCR产物纯化试剂盒进行纯化 具体操作如下 a)往PCR产物中加人4倍体积75%异丙醇,室温沉淀30min 在3200r/min下离心30min; b) 去掉上清,加8倍体积75%异丙醇 室温静置10min; 在3200r/min下离心10min,去上清; c 在50C烘干3min以除去残留的异丙醇,或置于温箱中盖上保鲜膜至无异丙醇; 加人适量的无菌去离子水稀释,1000r/min振荡混匀 O 测序 3 A.2 A.2.1纯化后的PCR产物在AB1PRISM3730测序仪上采用Sanger双脱氧链终止法原理从两端进 行测序 注:本标准以ABPRISM3730测序仪为例,不排除采用具有同等工效的其他型号的测序仪 A.2.2设立双脱氧测序反应 要求 引物;测序引物即为扩增引物 a b 微量滴定板;为96孔U形微量滴定板; 链延伸-链终止反应混合液的配制 c A.2.3测序凝胶的制备 A.2.4准备样品和列表.上样到微量滴定板中进行测序 A.2.5电压160V/em,温度42C A.2.6根据凝胶的荧光放射自显影,运用计算机读取DNA序列 A.3数据处理 利用相关的生物信息学软件读取所测裙带菜ITS序列,并同GenBank中公开的近缘种序列进行比 对,确定裙带菜ITs(包括ITs-1,5.8S和ITs-2)序列的起点和终点 利用软件MEGA计算裙带菜不同 品系ITs序列的变异数目