GB/T36853-2018
黄瓜细菌性角斑病菌检疫鉴定方法
DetectionandidentificationofPseudomonassyringaepv.lachrymans
- 中国标准分类号（CCS）B16
- 国际标准分类号（ICS）65.020.01
- 实施日期2019-04-01
- 文件格式PDF
- 文本页数11页
- 文件大小1.54M
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黄瓜细菌性角斑病菌检疫鉴定方法
国家标准 GB/T36853一2018 黄瓜细菌性角斑病菌检疫鉴定方法 DeteetionandidentifieationofPseudomonassyringaepw.laehrymans 2018-09-17发布 2019-04-01实施 国家市场监督管理总局 发布 币国国家标准化管理委员会国家标准
GB/36853一2018 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草
请注意本文件的某些内容可能涉及专利
本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口
本标准起草单位:检验检疫科学研究院、黄岛出人境检验检疫局、中华人民共 和国烟台出人境检验检疫局、湖南出人境检验检疫局、农业科学院生物技术研究 所、南京农业大学
本标准起草人:田茜、夏明星赵文军、粟智平、黄迎波、李为民、胡白石、田艳丽
GB/36853一2018 黄瓜细菌性角斑病菌检疫鉴定方法 范围 本标准规定了黄瓜细菌性角斑病菌的样品制备,分离培养,免疫学及分子生物学等检测方法 本标准适用于可能携带黄瓜细菌性角斑病菌的黄瓜种子、植株及其产品的检疫鉴定 黄瓜细菌性角斑病菌基本信息 2 中文名;黄瓜细菌性角斑病菌、,黄瓜角斑病菌 学名:Pseucloonassyringaepv.lacryansSmith8&
Bryan)YoungDye8&
Wilkie1978 (Poebnya) 异名:Bacillus Smith&
BryanHolland1920,Bacteriumburgeri luslachrymnans 1915.Chlorobaceter lachrymansSmith&
Bry Burgvts1935,Bacteriwmachrymansmith&Bryan" n)Patel&.Kulkarni1951,PhytoonaslachrymansSmith8. BryanBergeyetal.1923,Pseudo Nikiforuk1972,Pseudomoaslachrymans(Smith&
Bryan) onasburgeriPotebnyaKorobko Carsner1918,Pseudoonaslachrymans cucumisGorlenko1961 ularleafspot 英文名:Cucurbitangu 分类地位:细菌界(Ba acteria 变形菌门(Pro oteobacteria ,y-变形菌纲(Gammaproteobacteria),假单 胞菌目(Pseudormonadales),假单胞菌科(Pseudomonadaceae),假单胞菌属(Pseudoonas) 传播途径;带菌种子是病原菌远距离传播的主要方式,病原菌由气孔、伤口,水孔侵人寄主,通过灌 溉水、风雨、气流、昆虫及农事操作等在田间传播蔓延
黄瓜细菌性角斑病菌的其他信息参见附录A
方法原理 根据黄瓜细菌性角斑病菌与抗体之间的特异性反应进行免疫学检测;根据黄瓜细菌性角斑病菌的 特异性DNA序列进行分子生物学检测;根据黄瓜细菌性角斑病菌的培养性状、生物学特性、寄主范围 及危害症状等对病原菌进行分离培养及致病性测定
仪器设备和主要试剂 4.1仪器设备及用具 PCR仪、实时荧光PCR仪、超净工作台、高压灭菌锅、恒温培养箱、制冰机、高速冷冻离心机,台式 小型离心机、超低温冰箱、常规冰箱、,旋涡振荡器、微量进样器、电泳仪、凝胶成像系统
4.2主要试剂 除另有规定外,所有试剂均为分析纯
分子生物学检测所需试剂见附录B和附录c. 营养琼脂(NA)培养基配制方法;牛肉浸膏3.0g,蛋白陈5.0g,酵母膏1.0g,葡萄糖10.0g,琼脂 5.0g,加双蒸水至1000mL,调节pH至7.0,湿热灭菌(121C,15min).
GB/T36853一2018 5 田间观察检测 5.1症状观察 对大田及保护地种植黄瓜进行调查,参照附录A中的症状描述观察有无黄瓜细菌性角斑病的症 状,对出现典型症状或可疑症状的植株进行拍照记录,并采集表现症状的植株送实验室进行检测鉴定， 田间无症状植株可随机采样
5.2现场检测 采用商品化免疫胶体金试纸条进行现场检测,按照操作说明进行检测及结果判定
6 实验室检测鉴定 6.1样品制备 6.1.1植株样品 对于有症状样品,低倍显微镜下观察病健交界处组织有无溢菌现象,若有溢菌现象,选取新鲜组织 叶片、茎秆、果实)上的病健交界处(对于无症状样品,随机选取植物组织),在75%乙醇或含有效氯1% 的次氧酸钠溶液中表面消毒50s一60s,无菌水清洗3次,然后将其移至灭菌培养皿中,加5滴~10滴 无菌水,用灭菌慑子或剪刀将病组织捣碎,静置5min~10min,即制成组织悬浮液,用于分离培养、免 疫学检测及分子生物学检测 6.1.2种子样品 对于种子样品,随机抽取待检种子300g左右,平均分成3份5份,用微型粉碎机轻微破碎(至2 3以上种子破碎),加人适量pH7.0的0.01mol几磷酸缓冲液或生理盐水,使种子完全浸没,室温振荡 4hdI08r/mm).4七浸泡过夜
将浸袍液1o00r/mim离心1mim,去沉淀，上请液10o0r/min离心 10nmin,弃上清液,取沉淀,用无菌水悬浮,制成1ml一2ml样品悬浮液,用于分离培养,免疫学检测及 分子生物学检测 6.2免疫学检测 采用商品化ELISA方法进行检测,按照说明书进行操作及结果判定
6.3分子生物学检测 6.3.1模板制备 对于植株或种子样品,按照6.1的方法制备成样品悬浮液后,直接用商业化植物基因组DNA提取 试剂盒按照操作说明提取样品总DNA,一20保存备用
对于纯培养菌株,可直接或经裂解处理后(97笔沸水浴10min;12000r/min离心10min,取上清 液，一20C保存)作为分子生物学检测反应模板
根据实验室条件,可选择下列任一方法(6.3.2或6.3.3)进行检测
6.3.2PCR凝胶电泳检测 对于种子、叶片等样品,以已知带菌的黄瓜种子或植物组织作阳性对照(若无已知带菌材料,可用模
GB/36853一2018 拟带菌方式代替),以健康的黄瓜种子或植物组织为阴性对照,以双蒸水代替模板作为空白对照,对待测 样品进行PCR凝胶电泳检测
对于纯培养菌株,以Pseudomoassyringaepv.lachrymans标准菌株 做阳性对照,用非Pseudomomassyringaepv.lachrymans的植物细菌做阴性对照,以双蒸水代替模板 作为空白对照,对待测样品进行PCR凝胶电泳检测,具体检测步骤见附录B 6.3.3实时荧光PCR检测 实时荧光PCR检测具体步骤见附录C,对照设置同6.3.2
6.4分离培养鉴定 对于植株样品,按照6.1.1的方法制备成组织悬浮液后,用灭菌接种环蘸取悬浮液在NA培养基平 板上划线分离,重复3次
对于种子样品,按照6.1.2的方法制备成样品悬浮液后,用无菌水进行10倍梯度稀释3次,各取 100L稀释液在NA培养基上涂板,或直接用灭菌接种环蘸取样品悬浮液在NA培养基平板上划线分 离,各重复3次
将培养皿平板置于26C恒温培养48h一72h后观察是否有直径1mm1.5mm,白色,有光泽,圆 形,边缘整齐的可疑菌落产生
挑取可疑单菌落进行纯化,转接2次3次,随后进行致病性测定以及 免疫学或分子生物学鉴定6.2或6,3)
6.5致病性测定 使用无菌水将纯培养的菌株配制成1o'CFU/ml的细菌悬浮液,采用金刚砂摩擦法接种或刺伤喷 雾法接种在预先培育的4叶期健康黄瓜植株上,每一菌株接种3株5株,用无菌水接种作对照,接种 后保湿24h,在(24士2)C,光周期为16h条件下培育,第3天始观察记录发病情况
结果判定 7.1植株样品 对于有典型症状植株样品,免疫学或分子生物学检测结果为阳性，即判定为检出黄瓜细菌性角斑病 菌
无症状植株样品.免疫学或分子生物学检测结果阳性，经分离培养及致病性测定为阳性,即判定为 检出黄瓜细菌性角斑病菌
7.2种子样品 对于种子样品的直接检测,免疫学或分子生物学检测为阳性,初步判定为检出黄瓜细菌性角斑病 菌,若分离培养及致病性测定为阳性,则确定种子样品检出具有活性的黄瓜细菌性角斑病菌
样品及资料保存 8 8.1样品及菌种保存 样品经登记和经手人签字后妥善保存
对检出黄瓜细菌性角斑病菌的样品应保存于4C冰箱中 以备复核
该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理
从检测样品中分离并鉴定为黄瓜细菌性角 斑病菌的菌株,应妥善保存
可采用甘油保存或冻干保存
对不需要长期保存的菌株应及时灭菌处理
GB/T36853一2018 8.2结果记录与资料保存 完整的实验记录应包括;样品来源、种类,时间,检测时间、地点、方法和结果等,并要有实验人员和 审核人员的签字
现场检疫发现的可疑症状等应及时拍照保存,PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照 片,实时荧光PCR等需有原始实验数据及相关结果图片
GB/36853一2018 附录A 资料性附录) 黄瓜细菌性角斑病菌其他信息 A.1症状特征 主要危害叶片,叶柄、卷须和果实,苗期至成期均可受害
幼苗期子叶染病,开始产生近圆形水浸 状凹陷斑,以后变褐色干枯
成株期叶片上初生针头大小水浸状斑点,病斑扩大受叶脉限制呈多角形 黄褐色,湿度大时,叶背面病斑上产生乳白色黏液,干后形成一层白色膜,或白色粉末状物,病斑后期质 脆,易穿孔
茎、叶柄及幼瓜条上病斑水浸状,近圆形至椭圆形,后呈淡灰色,病斑常开裂,潮湿时瓜条上 病部溢出菌脓,病斑向瓜条内部扩展,沿维管束的果肉变色，一直延伸到种子,引起种子带菌
病瓜后期 腐烂,有臭味,幼瓜被害后常腐烂、早落
叶片上表现症状参见图A.1
图A.1叶片上表现症状 A..2寄主范围 黄瓜Cuucuissativu4s、 冬瓜Benine as hispida、西瓜C'itrwlluslanatus)、西印度黄瓜 Cucunisauguria),甜瓜(Cuct wmismelo)南瓜(Cueurbiamwchata),西葫芦(Cueurhia加ro),丝瓜 Luf/acutangula)佛手瓜(Seehiuedwle)等
A.3分布 在世界各地均有分布,主要分布在世界上温暖,潮湿的地区
具体如下 -欧洲:奥地利、白俄罗斯、捷克、斯洛伐克、丹麦、南斯拉夫、法国、德国,英国、希腊,匈牙利、意大 利、摩尔多瓦、荷兰、波兰、罗马尼亚、俄罗斯、瑞土、斯洛伐克、乌克兰; 亚洲;、印度、伊朗、以色列、日本,哈萨克斯坦、朝鲜、韩国、老挝、菲律宾、新加坡、塔吉克斯 坦、泰国、土耳其、乌兹别克斯坦 -非洲:阿尔及利亚、埃及、加蓬、肯尼亚、南非、津巴布韦; 中美洲;马提尼克、瓜德罗普岛、尼加拉瓜、波多黎各、特立尼达、多巴哥;
GB/T36853一2018 北美洲;加拿大、墨西哥,美国; 南美洲;阿根廷、巴西、哥伦比亚、委内瑞拉; 大祥洲:澳大利亚、新西兰
A.4病原菌形态及培养性状 菌体短杆状相互连接呈链状,端生l根一5根鞭毛,大小(0.7wm一0.94m)x(I.44m~2m),有 莫膜,无芽抱,革兰氏染色阴性
在金氏B平板培养基上,菌落白色,近圆或略呈不规则形,扁平,中央 凸起,污白色,不透明,具同心环纹,边缘一圈薄且透明,菌落直径5mm~7mm,外缘有放射状细毛状 物,具黄绿色荧光
该菌属好气性,不耐酸性环境
生长适温24C一28C,范围4C一39C,48C 50C经10min致死
GB/36853一2018 附录B 规范性附录 PCR凝胶电泳检测 B.1引物序列 PsL-F;5'-GTTcGGcGAcGCAATCcAATG-3'" PsL-R;5'-GTTG.AcTTcTTcGGcGGTGG-3 B.2CR反应体系及条件 5L反应体系:2×PCR反应预混液12.5AL引物PsL-F(10mol/L)1ALl,引物PsL-R 104mol/L)1AL，模板1AL,补充超纯水至25AL
PCR反应程序:94C/5min;94C/30s,58C/30s,72C30s35个循环;72C/8min;4C保存
注:不同仪器可根据具体要求将反应参数作适当调整
B.3PCR凝胶电泳 PCR产物用2%琼脂糖凝胶进行电泳,电泳结束后,EB染色,凝胶成像系统观察拍照
扩增产物 片段大小为179bp B.4结果判定 阳性对照在预期大小位置产生明显条带,阴性对照在预期大小位置未产生条带,若样品出现与阳性 对照大小一致条带,判定为阳性,否则为阴性
GB/T36853一2018 附 录 C 规范性附录 实时荧光PCR检测方法 C.1引物及探针序列 PsL-F;5'-GTTcGGCGACGCAATcAATG-3" PsL-R;5'-GTTGACTTcTTcGGcGGTGG-3' PSL-PB1;5'FAM)-CCGGAGCTGGCAGGCAAACTCAC-(BHQ1)3 C.2实时荧光PCR反应体系及程序 25L反应体系;2×荧光PCR反应预混液12.5L,引物PSL-F(10mol/L)1AL,引物PSL-R 10mol/I)1AL，探针PsL-PB1(10Mmol/L)0.5ML,模板1L,补充超纯水至25AL
PCR反应程序;第一个循环为9510nmin;随后40个循环,95C10s,58C45s， C.3结果判定 在阳性对照Ct值34,阴性对照和空白对照的C值之40前提下 -如果检测样品的Ct值<35时,则判定为阳性; 如果检测样品的Ct值>40时,则判定为阴性 如果35
黄瓜细菌性角斑病菌检疫鉴定方法GB/T36853-2018解读
一、标准概述
《黄瓜细菌性角斑病菌检疫鉴定方法GB/T36853-2018》是由中国国家标准化管理委员会发布的检疫标准，主要适用于对黄瓜细菌性角斑病菌进行检疫鉴定。
二、标准内容
该标准主要包括以下内容：
- 术语和定义
- 检测器材、试剂、培养基等
- 操作规范
- 结果判定
- 质量控制
- 附录
三、鉴定方法
该标准规定了黄瓜细菌性角斑病菌的检疫鉴定方法，包括：
- 样品采集与处理
- 细菌分离与纯化
- 生理生化特性检测
- 16S rDNA序列分析
- 致病力检测
四、注意事项
在进行黄瓜细菌性角斑病菌检测时，需要注意以下事项：
- 检测前应对检测器材、试剂、培养基等进行验证和质量控制
- 在样品采集和处理过程中，要避免交叉污染
- 在细菌分离和纯化过程中，要注意细菌菌株的纯度和活力
- 在生理生化特性检测过程中，要严格按照操作规范进行
- 在16S rDNA序列分析和致病力检测过程中，需要进行质量控制
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