蜂蜜中林可霉素、红霉素、螺旋霉素、替米考星、泰乐菌素、交沙霉素、吉他霉素、竹桃霉素残留量的测定液相色谱-串联质谱法

蜂蜜中林可霉素、红霉素、螺旋霉素、替米考星、泰乐菌素、交沙霉素、吉他霉素、竹桃霉素残留量的测定液相色谱-串联质谱法

国家标准 GB/T22941一2008 蜂蜜中林可霉素、红霉素、螺旋霉素、 替米考星、泰乐菌素、交沙霉素、 吉他霉素、竹桃霉素残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Determinationofincomycin，erythrmsycim，spiramycin，tilmicsin. ylosin，joSamycin，kitasamyein,oleandomycinresidesinhoney- LC-MS-MSmethod 2008-12-31发布 2009-05-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管蹬委员会国家标准
GB/T22941一2008 前 言 本标准的附录A、附录B为资料性附录 本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口 本标准起草单位;秦皇岛出人境检验检疫局 本标准主要起草人:曹彦忠、张艳梅,贾光群、张进杰、石玉秋、庞国芳
GB/T22941一2008 蜂蜜中林可霉素、红霉素、螺旋霉素、 替米考星、泰乐菌素、交沙霉素、 吉他霉素、竹桃霉素残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 范围 本标准规定了蜂蜜中林可霉素、红霉素、螺旋霉素、替米考星、泰乐菌素、交沙霉素、吉他霉素、竹桃 霉素残留量液相色谱-串联质谱测定方法 本标准适用于蜂蜜中林可霉素、红霉素、螺旋霉素、替米考星,泰乐菌素,交沙霉素、吉他霉素、竹桃 霉素残留量的测定 本标准的方法检出限均为2.0g/kg 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度正确度与精密度第1部分:总则与定义 (GB/T6379.1一2004，ISO5725-1:1994,IDT GB/T6379.2测量方法与结果的准确度(正确度与精密度第2部分;确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法GB/T6379.2一2004,ISO5725-2:1994,IDT G;B/T6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682一2008,ISO3696:1987,MOD) 原理 蛟蜜中残留的林可霉素、红霉素、螺旋霉素、替米考星,泰乐菌素,交沙霉素、吉他霉素、竹桃霉素用 三羚甲基氨基甲婉(Tris)缓冲溶液(pH=9)提取,过滤后，经OasisHLB固相萃取柱''或相当的固相萃 取柱净化,用甲醇洗脱并蒸干,残渣用乙睛-0.01mol/L乙酸铵溶液溶解,过0.2m滤膜后,样品溶液 供液相色谱-串联质谱仪测定,内标法定量 试剂和材料 水:GB/T6682,一级 4.2甲醉;色谱纯 4.3乙睛:色谱纯 4.4三羚甲基氨基甲炕(Tris);优级纯 4.5氯化钙(CaCl2H,O);优级纯 4.6乙酸铵;优级纯 OasilsHLB固相萃取柱是waters公司产品的商品名称.给出这一信息是为了方便本标准的使用者,并不是表 1 示对该产品的认可 如果其他等效产品具有相同的效果,则可使用这些等效产品
GB/T22941一2008 4.7盐酸;优级纯 4.8淋洗液;甲醇溶液(2十3) 量取40ml甲醇(4.2)与60ml水混合 4.90.01mol/几乙酸铵溶液:称取0.77g乙酸铵(4.6)溶于1000nml.水中 4.100.2mol/L三胫甲基氨基甲烧(Tris)缓冲溶液:称取12.0g三胫甲基氨基甲烧(4.4)和7.35g 氯化钙(4.5),放人1000mL烧杯中,加人800mL水溶解,用盐酸(4.7)调至pH值为9.0,再用水定容 至1000mL 定容液:乙睛-0.01mol/L乙酸铵溶液(3+17) 量取15mL乙睛(4.3)和85mL乙酸铵溶液 4.9)混合均匀 4.12标准物质;林可霉素(CAs;7179-49-9)、红霉素(CAS;59319-72-1l),螺旋霉素(CAS;8025-81-8)、 替米考星(CAs;108050-54-0),泰乐菌素(cAs;74610-55-2),交沙霉素(cAs;16846-24-5)、吉他霉素 CAs;1392-21-8)、竹桃霉素(CAS:7060-74-4),纯度>99% 4.13 0.1mg/mL标准储备溶液;准确称取适量的各标准物质(4.12),用甲醉分别配成0.1mg/mL的 标准储备溶液 该溶液在4C保存 1.0ug/ml混合标准工作溶液;吸取各标准储备溶液(4.13)0.1mL.移至10mL容量瓶中,用甲 醇稀释至刻度 该溶液在4C保存 4.15内标物质;罗红霉素(CAS;80214-83-1),克林霉素(CAs;21462-39-5),纯度>99% 160.1mg/ml.罗红霉素、克林霉素内标储备溶液;准确称取适量的罗红霉素,克林霉素标准物质 4.15),用甲醇配成0.1mg/ /ml的内标储备溶液 该溶液在4C保存 4.171.04g/ml混合内标工作溶液;分别吸取罗红霉素和克林霉素内标储备溶液(4.16)0.1ml移 到 10mL容量瓶中,用甲醇稀释至刻度 该溶液在4C保存 基质标准工作溶液;吸取不同体积混合标准工作溶液(4.14)和20L混合内标工作溶液(4.17). 4.18 用空白样品提取液配成2.0ng/ /ml.5.0ng/ml10.0ng/ml,20.0ng/ml,50.0ng/ml不同浓度的基 质标准工作溶液 当天配制 4.19OasisHLB固相萃取柱或相当者:200mg,6ml 使用前依次用5mL 甲醇(4.2)和10ml.水活 化保持柱体湿润 4.20滤膜:0.24m.a 仪器 5.1液相色谱-串联质谱仪;配有电喷雾离子源 5.2分析天平;感量0.lm道和0.0 g 5.3氮气浓缩仪 5.4液体混匀器 5.5贮液器;50mL .6 真空泵;最大负压80kPa 5.7固相苯取装置 5.8吹干管;10ml 试样的制备与保存 6.1试样的制备 对无结晶的实验室样品,将其搅拌均匀 对有结晶的样品,在密闭情况下,置于不超过60C的水浴 中温热,振荡,待样品全部融化后搅匀,冷却至室温 分出0.5kg作为试样 制备好的试样置于样品瓶
GB/T22941一2008 中,密封,并做上标记 6.2试样保存 将试样于常温下保存 测定步骤 提取 称取2区试样,精确至0.01g 置于150ml三角瓶中,加人20混合内标工作溶液(4.17),加人 25mlTris缓冲溶液(4.10),于液体混匀器(5.4)上快速混匀1lmin,使试样完全溶解 7.2净化 将塞有玻璃棉的玻璃贮液器(5,5)连到OasisHLB固相萃取柱(4.19)上,把样液倒人玻璃贮液器 中,调节流迷小于了ml/min,待样液完全流出后,依次用5ml水和5mL淋洗液(.8)洗柱,弃去全部 流出液 减压抽干20min,然后用5ml甲醇(4.2)洗脱,收集洗脱液于10ml吹干管(5.8)中 用氮气 浓缩仪(5.3)于50C吹干 准确加人1.0m定容液(4.11)溶解残渣,过0.2m滤膜后,供液相色谱 串联质谱仪测定 按上述操作步骤,制备用于配制系列基质标准工作溶液的样品空白提取液 7.3测定条件 7.3.1液相色谱参考条件 色谱柱:AtlantisC8，3Am，150mmm×2.1mm(内径)或相当者; a) D 流速:0.2mL/min; e柱温30C 进样量:20l; d 流动相.A;乙脯,B.0.1%甲酸溶液,C甲醉 梯度洗脱条件见表1 表1梯度洗脱条件 % B/% 时间/min c/% A 0.00 90.0 5.o 5.0 5.0 5.00 90.0 5.0 5.0 9.00 90.0 5.0 9,10 90.0 5.0 5.0 17.0 90.0 5.0 5.0 质谱参考条件 7.3.2 离子源;电喷雾离子源; a D) 扫描方式;正离子扫描; 检测方式:多反应监测; dD 电喷雾电压:5500V; 雾化气压力:0.069MPa; 气帘气压力:0.069MPas 辅助气流速;7L/min; g 离子鄙温鹰450 h) ; 定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压见表2
GB/T22941一2008 表2定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压 定性离子对 定量离子对 碰撞气能量 去簇电压 化合物中文名称 化合物英文名称 m/2 m/:) 50 407126 37 407/126 林可霉素 lincomycin 407/359 24 50 688/158 42 30 688/158 红霉素 erythromycin 23 688/544 30 734/158 42 50 734/158 螺旋霉素 spiramyein 50 734/576 28 90 869/174 62 869/174 替米考星 tilmicosin 90 869/132 70 80 916/174 54 916/174 泰乐菌素 tvosin 80 916/145 55 45 58 425/126 425/126 交沙霉素 iosamycin 25 425/377 53 48 60 843/142 843/142 吉他霉素 kitasamycin 843/174 50 60 772/215 42 70 772/215 竹桃霉素 oleandomyein 772/109 70 70 7.4液相色谱-串联质谱测定 7.4.1定性测定 被测组分选择1个母离子,2个以上子离子,在相同的试验条件下,样品中待测物质的保留时间与 标准溶液中对应的保留时间偏差在士2.5%之内;且样品中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的标 准溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较,若偏差不超过表3规定的范围,则可判定样品中存在对 应的待测物 表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 以%表示 相对离子丰度K K>50 20GB/T22941一2008 表4(续 保留时间/min 化合物名称 螺霉素 8.91 替米考星 9.56 10.04 泰乐菌素 交沙霉素 l1.33 吉他霉素 10,62 9.72 竹桃霉素 7.5平行试验 按以上步骤,对同一试样进行平行试验测定 7.6空白试验 除不称取试样外,均按上述步骤进行 结果计算 蜂蜜中林可霉素、红霉素、螺旋霉素、替米考星、泰乐菌素、交沙霉素、吉他霉素、竹桃霉素残留量的 测定结果按式(1)计算 X=c.× 会xxxxI一 式中: -试样中被测物残留量,单位为微克每千克(4g/kg); 基质标准工作溶液中被测物的浓度,单位为纳克每毫升(ng/ml); 试样溶液中被测物的色谐峰面积; 基质标准工作溶液中被测物的色谱峰面积; -试样游液中内标物的浓度,单位为纳克每毫升(eg/mL) 基质标准工作溶液中内标物的浓度,单位为纳克每毫升(ng/mL); 基质标准工作溶液中内标物的色谱峰面积; -试样溶液中内标物的色谱峰面积; -样液最终定容体积,单位为毫升(mL) 试样溶液所代表试样的质量,单位为克(g) m7 计算结果应扣除空白值 精密度 一般规定 本标准的精密度数据是按照GB/T6379.1和GB/T6379.2规定确定的,其重复性和再现性的值 是以95%的可信度来计算 9.2重复性 在重复性试验条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r,蜂蜜中林可霉素、 红霉素、螺旋霉素、替米考星、泰乐菌素、交沙霉素、吉他霉素、竹桃霉素添加浓度范围及重复性方程见 表5
GB/T22941一2008 表5添加浓度范围及重复性和再现性方程 单位为微克每千克 化合物名称 添加浓度范围 重复性限r 再现性限R 林可霉素 gR 2.0~50.0 lgr=1.0510lgm一1.2650 =0.8656lgm一0,6520 2.0一50,o 红霉素 r=1.0335gm一1.2251 gR=1.I108lgm一0.9901 g管0.8702g历-.1014 2.0~50,0 螺旋霉素 gR=1.1028Ig"一1.o16o 替米考星 2.050,0 lgr=1.0934lgm-1.3491 lgR=0,9621lgm一0.8070 泰乐菌素 2.0~50.0 lgr=0.9707lgm一1.1463 lgR=0.8157lgm-0,6801 交沙霉素 2.050,0 lgr=0.9379lgm-l.1770 lgR=0.8571lgm-0.7565 吉他霉素 gR=0.9598lgm-0.9004 2.0一50.0 lgr=l.0208lgm一1.3386 竹桃霉素 2.050.0 g"=0.9757 lgm-1.2742 gR=0.8863gm-0.5849 注，m为两次测定值的算术平均值 如果差值超过重复性限r,应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定 9.3再现性 在再现性试验条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R,蜂瘙中林可霉素 红霉素、螺旋霉素、替米考星、泰乐菌素,交沙霉素、吉他霉素、竹桃霉素的添加浓度范围及再现性方程见 表5
GB/T22941?2008 ?A ?? ????(MRN)?? ?ù?ù?ù?????,?ù?ù?ù????? (MRM)???A.1 7.61 9.96 .10e5 1.6e5 1.00e5 1.4e5 ?9.00e4 ? ?8.00e4 ?1.2e5 ?ù ù 7.00e4 1.0e5 6.0e4 8.0e4 5.00e4 4.00e4 6.0e4 3.0oet 4.0e4 .00e4 2. 2.ae4 1.00e4 0.00 0.0 i024I6/mim 1012 16//min 9,,56 8,91 2.0e4 2.5e4 1.8e4 ? 1.6e4 ?2.0e4 ?1.4e ? .2e4 ? ù 1.5e4 1.0e4 8000.0 1.0e4 6000.0 4000.0 5000.0 11.97 2000.0 0.0 01214I6/mim 02I/min 10,0M4 ll,33 5.0e4 8.0e4 4.5e4 7.0e4 4.0e4 ? ? 3.5e4 6.0e4 ? ?3 3.0e4 5,Oe4 ?? ?ù 2.5e4 4.0e4 2.0e4 3.0e4 1.5e4 2.0e4 1.0e4 1.0e4 5000.0 10.70 0.0 0.0 10121416/min 10121416/min 10,62 9,72 1.4e4 1.8e5 1.Be5 1.2c4 ? ? 1.4e5 ? 1.0e4 ? 1.2e5 8000.0 1.0e5 ù ù 8.0e4 6000.0 6.0e4 4000.0 4.0e4 -9,91 2000.0 2.0e4 9.42 0.0 2 4 12 14 16/ 10 I/minm 10 /mim ?A.1????(MIRNM)??
GB/T22941?2008 ?B ?? ?ù?ù?ù??????,?ù?ù,ù? ????B.1 B.1?ù?ù,ù??,??,?ù?ù?ù ???? ?/% ?/g/kg 100.0 2.0 99.4 5.0 ?ù 10.0 95,7 50.0 94.9 2.0 85.7 5.0 86.2 ù 10.0 87.7 50.0 90.8 83.9 2.0 5.0 83.7 ù 10.0 82.8 50.0 87.7 2.0 84.9 87.6 5.0 ? 10.0 90.4 50.0 89.3 86.4 2.0 5.0 84.4 ?? 10.0 86.7 50.0 88.8 2.0 80,6 5.0 86.0 ?ù 77.7 10.0 50.0 84.0 2.0 79.3 5.0 83.4 ù 10.0 79.3 50.0 83.0
GB/T22941一2008 表B.1续 平均回收率/% 化合物名称 添加浓度/4g/kg 83.0 2.0 5,0 83.8 竹桃霉素 10.0 84.6 50.0 83.0