马病毒性动脉炎诊断技术

马病毒性动脉炎诊断技术

国家标准 GB/T27980一2011 马病毒性动脉炎诊断技术 Diagnosticteehniquesforequineviralarteritis 2011-12-30发布 2012-06-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T27980一2011 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由农业部提出 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/Tc181)归口 本标准起草单位:农业部热带亚热带动物病毒学重点开放实验室 本标淮主要起草人;张念祖、杨什标,宋建领、杜健、王金,朱建波、李华春
GB/T27980一2011 马病毒性动脉炎诊断技术 范围 本标准规定了马病毒性动脉炎诊断技术 本标准适用于马病毒性动脉炎的诊断和检疫 其中病毒分离、琼脂糖凝胶免疫扩散试验、反转录聚 合酶链式反应试验适用于马病毒性动脉炎的病原诊断,中和试验和酶联免疫吸附试验适用于马病毒性 动脉炎的抗体检测 临床诊断 流行病学 马病毒性动脉炎是由马动脉炎病毒所引起的一种马的散发性呼吸系统和繁殖系统的接触性传染 病,该病只感染马属动物,主要是通过生殖系统和呼吸系统而感染传播 公马带毒后无明显临床症状 流产马的 却是危险的传染源 长期带毒的种公马可通过自然交配或人工授精的方式把病毒传给母马 胎盘、胎液、胎儿亦可传播本病 患病马在急性期通过呼吸道分泌物将病毒传给同群马或与其相接触的 马 通过用具、饲料和饲养人员的接触也能将病毒传给易感马 该病呈世界性分布,血清学试验证实， 我国也存在该病 2.2临床症状 患马可表现为临诊症状和亚临诊症状,大多数自然感染的马表现为亚临诊症状 试验感染潜伏期 为ld一6d,野外感染普遍为3d一4d 本病的典型症状是发热，一般感染后3d~14d体温升高达 41，并可持续5d~9d 表现厌食、精神沉郁,四肢严重水肿,步伐僵直,眼、鼻分泌物增加,后期为脓 性粘液,发生鼻炎和结膜炎 面部,颈部、臀部形成皮肤疹块 公马的阴囊和包皮水肿,马狗和虚弱的马 可引起死亡 怀孕母马流产,其流产率可达90%以上 流产发生在感染后的10d30d,通常出现在临 诊发病期或恢复早期 胎儿常在流产前就死亡,流产胎儿水肿,呼吸道粘膜和脾被膜上有出血点 母马 痊愈后很少带毒,而大多数公马恢复后则成为病毒的长期携带者 这些症状并不是在同一马群中同时 出现 马驹、老龄雌马和营养状况差的马,临床症状较重,孕马比空怀母马明显 除极少数患马发生死 亡外，一般为轻度临床症状 2.3病理变化 死亡病例最主要的剖检变化是全身较小动脉管内肌层细胞的坏死,内膜上皮的病变导致特征性的 出血和水肿以及血栓形成和梗死 常见大叶性肺炎和胸膜渗出物,发生全身性动脉炎的结果,所有浆膜 和粘膜以及肺和中肠等都有点状出血 肾上腺上也有出血,在心,牌、肺、肾、怀孕母马的子宫,眼结膜、 眼脸、膝关节或蹋关节以下的皮下组织以及阴囊和睾丸内,均能发现出血及水肿变化 恢复期病马的慢 性损害包括广泛性全身性动脉炎和严重的肾小球性肾炎 实验感染后观察到的损伤可分成3个型,即 发展(渐进)型,终末(端)型及慢性活动型 从感染后4d~6d观察发展(渐进)型损伤,发现胸腹水过 多,淋巴结充血肿大,结肠到盲肠脉管水肿,大肠粘膜下淋巴结肿大,还可见粘膜上皮温和坏死 终未 端)型损伤被认为是发展(渐进)型损伤的延伸,表现为皮下水肿,胸腔大量积液,全身所有淋巴结肿胀 到不同程度的出血,盲肠和结肠有梗死 粘膜下严重水肿和出血,有时可见肾上腺皮质出血 病毒接种
GB/T27980一2011 后第12天,可见慢性损伤,包括温和性淋巴结肿胀及胸腔内积液过多 实验感染后观察到的损伤的严 重性很少与自然感染的损伤一样 4 2. 诊断 依据上述流行病学特点临床症状和病理剖检变化特征等可作出初步诊断,确诊后应该通过实验室 病原学和血清学诊断 病毒分离 器材和设备 pl 单道微量加样器(0.5L10l,5AlL10Al、40l一200l、200 ~1000AL)及滴头 -80冰箱,二氧化碳培养箱 组织研磨器、超声波振荡器、低速离心机、倒置显微镜 3.2试剂与材料 血(采自血管);细胞:兔肾细胞(RK-13);细胞培养液(见附录A) 病毒分离 3.3.1样品的采集 急性病例采取脱纤全血或沉淀白细胞层,鼻分泌物、结膜拭子或流产胎儿的体液及脾脏,被检种马 的精液;尸体剖检时采取肺、脾和淋巴结,将病料置于含1000IU/ml青霉素和1o004g/mL链霉素的 0.01mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)里 这些病料应立即用冰冷却,若不立即接种,应将病 料迅速冻存于-80C冰箱 精液的采集;使用一次射精时精子数量最多的部分精液 3.3.2样品的处理 组织样品用含1000IU/ml青霉素和1000g/ml链霉素的细胞培养液按1:10的比例,置于研 磨器中剪碎并研磨 将已研磨好的待检病料,4C1000r/min离心5min,取上清液;分泌物和排泄物 样品的处理,将棉拭子充分捻动、拧干后弃去拭子,41000r/min离心5min.取上清液;精液冻融3次 或超声波裂解处理(100A、1 min一2min),用细胞培养液作1:10的稀释，4C1000r/min离心 5min， 取上清液 将处理好的样品上清液用0.22Am滤器过滤除菌,待用 3.3.3接种细胞 将样品悬液接种于RK-13细胞,每份样品接种5瓶,每瓶(生长面积25cm')接1mL,37吸附 1h，再加5ml维持液 将接种细胞置于37C,5%二氧化碳条件下培养12d,每2d3d换维持液 -次 3.3.4观察与传代 接种后用倒置显微镜逐日观察细胞是否出现细胞病变(CPE),出现者收获,无CPE者再盲传3代， 仍无细胞病变者弃之 3.3.5病毒增殖、分装与保存 RK-13细胞上出现CPE的病毒悬液用1mL无菌小管分装,作为原始毒置于一80C冰箱或液氮罐
GB/T27980一2011 中保存 将原始毒接种RK-13细胞,37、5%二氧化碳条件下培养并逐日观察细胞病变,70%以上细胞出 现病变时收集细胞病毒液,按1ml 每小管进行无菌分装,置一80冰箱保存备用 病毒鉴定按本标准琼脂糖凝胶免疫扩散试验AGID)和反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法 进行 琼脂糖凝胶免疫扩散试验(AGD) 材料和器械 器械:直径6cm平皿、外径4mm打孔器、加样器 4.1.2阳性血清、标准马病毒性动脉炎高免血清 4.1.3阴性血清;无马病毒性动脉炎抗体和细胞毒性的健马血清 标准抗原;纯化浓缩的马病毒性动脉炎病毒 4.1.5待检抗原;抗原应无污染,取少量样品加最少量的无菌生理盐水磨碎后作为待检抗原;病毒分离 物浓缩(用聚乙二醇8000做100倍浓缩)后亦可作为待检抗原 4.2试验方法 4.2.1琼脂平皿的制作(所用试剂均为常规分析纯试剂):见附录B 42.2打孔用直径4mm金属打孔器在已凝固的琼脂糖凝胶平皿上打孔,孔距为3mm,打孔后用针 挑出切下的孔内琼脂块 4.2.3加样;用微量加样器或毛细吸管,吸取抗原或血清加于孔内,中央孔滴加标准阳性血清,周围的 第1孔、第3孔、第5孔滴加对照阳性抗原,第4孔滴加阴性抗原,第2孔,第6孔滴加样品(待检抗原). 加样量以加满不溢出为度 加样后静置10min,放人湿盒内37C进行反应 24h后观察并记录结果 结果判定 结果判定时将琼脂平皿置暗背景或侧强光照射下观察,若对照阳性抗原与标准阳性血清孔之间出 现一条清晰,明显的白色沉淀线,而对照阴性抗原与标准阳性血清孔之间无沉淀线则认为试验可以成 立,如果沉淀线没有或不明显则本试验不能成立,应该重做 结果判定标准如下 阳性:待检抗原孔与阳性血清孔之间出现明显清晰白色沉淀线,并与标准阳性孔的沉淀线相 融合 阴性;待检抗原孔与阳性血清孔之间无沉淀线,标准阳性孔抗原的沉淀线直伸被检样品的孔 b 边,判为阴性 限制性说明 本方法仅用于马病毒性动脉炎(EVA)病原的普查,可能会出现非特异性反应 建议对AGID阳性 样品进行进一步的病原或者核酸诊断 反转录聚合酶链式反应(Rr-CR 5.1仪器和设备 PCR(聚合酶链式反应)扩增仪、台式低温离心机、电泳仪、电泳槽、冰箱、紫外灯、紫外凝胶成像仪、
GB/T27980一2011 单道微量加样器(0.5L10AL、,5A10AL、40AL200L、200L1000L)及滴头,PCR仪和离 心管 5.2试剂与材料 5.2.1材料;细胞病毒液或病料组织、外周血液或鼻分泌物 试剂柱离心式小量病毒RNA&.DNA抽提试剂盒,核糖核酸聚合酶链式反应试剂盒(逆转录 5.2.2 RNAPCRKit),上样缓冲液(1%SDS,50%甘油和0.05%嗅酚蓝,嗅化乙锭(EB)储存液(104g/ml)、 琼脂糖,DNA分子质量标准,异丙醇等均为常规分析纯试剂,电泳缓冲液(配制方法见附录C) 5.2.3引物:在马病毒性动脉炎病毒ORF1b的9282bp9466bp片段设计引物 CI:5-CcTGAGACACTGAGTcGcGT-3 DI:5-CCTGATGCCACATGGAATCA-3 扩增目的片段为184bp 55 3 操作程序 5.3.1样品的采集和处理 样品的采集和处理参见3.3.1和3.3.2 5.3.2病毒RNA的提取 按照相关病毒RNA提取试剂盒操作即可 5.3.3RT-PCR扩增 将下列各成分按要求量加人PCR反应管中;RNaseFreedH.0(24AL);10×OneStepRNAPCR Buffer(5L.);25mmol/几的MgCl.(10L);10mmol/1的dNTPMixture(5L.);RNaseInhibitor 1al，AMvRtmee.xLlaAMvopimiadTanlal.上游引物cc(e20ma/)1,Al，下游引物" 204mol/L)lAL;模板RNAll;同时设定阳性和阴性对照 将加有样品和对照RNA的PCR反应管放人PCR仪中,按下列程序和条件进行扩增:50C 30min,94C2min,然后按照(95C15s,42C15s,68C45s)反应35个循环,最后再68C7min. 反应产物可直接电泳检测,亦可于4C或一20C保存待检测 5.4电泳 取PCR扩增产物8L与2L6倍上样缓冲液混合点样于2%琼脂糖凝胶孔中,5V/cm电压进 行电泳,30min后,于紫外凝胶成像仪或紫外分析仪上观察结果 5.5结果判定 在对照成立的前提下,即阳性对照出现相应大小扩增带(184bp),阴性对照无此带出现的情况下判 定结果 样品若出现和阳性对照分子质量相同的特异性扩增带,即判定为阳性,否则为阴性 酶联免疫吸附试验(ELISA) 器械和设备 96孔高吸附力酶标板(平底,简称96孔酶标板),单道微量加样器(0.5L10L、5L10 0Al、
GB/T27980一2011 40AL200L、200Al1000L)及滴头,多道微量加样器(5L50L、50L100L)及滴头 8道微量连续加样器(50l,100l、,150Al,200AL)及滴头 稀释试剂用灭菌瓶 4C、一20C冰箱， 普通恒温培养箱 酶标读板仪、微型振荡器及磁力搅拌器 6.2试剂与材料 包被液.0.1molL碳酸盐缓冲液(pH9.6).4C保存 6.2.1 6.2. 2 酶标记羊抗马二抗(抗马lgG辣根过氧化物酶结合物);4C保存 6. .2.3OPD邻苯二胺)储存液;0.05%吐温-20磷酸盐缓冲液(PBST);优质脱脂奶粉;30%过氧化氢 2mol/I 硫酸(所用试剂均为常规分析纯试剂,配制方法见附录D) 6.3操作程序 6.3.1将包被抗原(一20C冰箱保存)用碳酿盐缓冲液按合适浓度稀释,每孔100l加人96孔酶标 板,置密闭湿盒中,4C过夜 .3. 甩干包被液,用0.02mol/儿LpH7.2的PBST洗各孔,甩净 6. .2 6.3.3重复洗3次 6.3.4封阻,5%脱脂奶粉的0.02nmol/LpH7.2PBST(PBSTsM),每孔50L,37C振荡温育 60min 被检血清;将每份被检血请用含1%脱脂奶粉的0.02molLpH7.2PBST(PBsTsM)按15 稀释,每份样品加一排,每孔50L,分别用阳性血清和健康马血清作阳性和阴性对照,最后一排作空白 对照 6.3.637C振荡温育60min 加酶标二抗;沫根过氧化物彤标二抗用PsTsM按1t100稀释,每孔加.50L 6.3.7 6.3.837笔振荡温育60n min 6.3.g用1倍PBST洗板3次,甩干 6.3.10加底物OPD;使用时按每毫升使用液加8L30%过氧化氢混匀而用,每孔加50AL 6.3.11避光反应15min,用2mol/几的硫酸终止反应 在醇标读板仪上读取490mm波长的吸光度值(oDm),当阳性(oDw>0.60)和阴性 OD ,<0.10)对照成立的前提下,样品孔光吸收值为阴性对照孔两倍或两倍以上时判为阳性,否则 490nmm 判为阴性 限制性说明 6. 本方法仅用于马病毒性动脉炎(EVA)抗体的普查,可能会出现非特异性反应 建议对阳性样品进 行病毒中和试验验证,以排除非特异性的阳性样品 病毒中和试验(国际贸易指定试验 器材和设备 96孔组织培养板(平底,简称96孔板),单道微量加样器(0.5L10AL5l10Al、40l200l 200AL1000aL)及滴头,多道微量加样器(5L一50aL、50L一100AL)及滴头 4C、一80C冰箱 二氧化碳培养箱
GB/T27980一2011 7.2试剂与材料 7.2.1病毒 7.2.2阳性血清;标准马病毒性动脉炎高免血清 7.2.3阴性血请;无马病毒性动脉炎抗体和细胞毒性的健马血清 7.2.4细胞;兔肾细胞(RK-13)使用浓度3.0X10个/ml 7.2.5细胞生长液MEM十10%接牛血请十青霉素、链霉素(终浓度为10U或100g/ml.. 保存). 7.2.6细胞维持液;MEM十2%犊牛血清十青霉素、,链霉素(终浓度为100IU或1004g/mL,4 C 保存). 7.2.7待检血清;应无污染,4C保存不超过30d,试验前56C灭活30min. 7.3试验准备 7.3.1病毒繁殖;应用静止培养法,在大瓶RK-13细胞形成单层后,移弃细胞培养液,接种马动脉炎病 毒于单层细胞,置37C,5%cO 培养箱中孵育1h,加新鲜细胞维持液,重置37、5%cO培养箱中 培养;逐日观察,待CPE达到75%以上时收毒,在一80笔和4C间反复冻融3次,无菌离心(2000r/min) 20min，取上清分装于1mL.小管,4C保存备用 7.3.2毒价滴定;用含10%胎牛血清、,10%新鲜豚鼠补体和抗生索(1000U/ml青霉素和10004g/ml 链霉素)的稀释液将马动脉炎病毒作10-1至10-"稀释,然后接种96孔微量板,每个稀释度接种8孔,每 孔25lL,每孔再补加25l 细胞生长液 每孔加人RK-13细胞悬液使用浓度3.0×10个/mL 0L 同时设置8孔细胞对照,即用50L细胞生长液十50LRK-13细胞悬液 于37C,5%cO条件下培养细胞观察7d,在细胞对照成立的前提下,记录结果,按细胞半数感染 量方法计算病毒的每25AL中所含半数组织细胞感染量(TCIDa 7.3.3待检血清、阳性血清和阴性血清经56C30min灭话后,自112倍比稀释至1:32. 7.3.4病毒工作液的配制;将待检病毒用细胞生长液稀释为每25aL含100个1000个TCID,作 为病毒工作液 中和试验程序 7.4 7.4.1病毒和血清等体积混合后置37C孵育1h或4C过夜 7.4.2接种96孔微量板,每组接种8孔,每孔50L病毒和血清混合液,立即补加50LRK-13细胞 悬液(使用浓度3.0×10个/mL). 7.4.3置于37、5%cO条件下培养细胞观察7d 对照步骤如下所示 a病毒对照;取病毒工作液,用细胞生长液作10-1、10-2、10-、10-'四个稀释度,每个稀释度 8孔，每孔25L加50L细胞悬液,补生长液25L达到总量100L b)细胞对照;设8孔,每孔加50L细胞悬液,补生长液50L达到总量100aL 阴性对照;设8孔,每孔加人1:2或1:10稀释的阴性血清和病毒混合液50AL.,立即补加 c 50l，RK-13细胞悬液(使用浓度3.0×10个/mL),置于37C、5%cO条件下同样培养细 胞观察7d 7.5结果判定 7.5.1判定条件 7.5.1.1细胞对照组应不出现细胞病变(CPE)
GB/T27980一2011 7.5.1.2病毒对照,应保证在1000个TCI.的病毒液10-和10-"稀释度的各个孔均出现CPE,10- 有1个3个孔出现CPE,10-'8孔全无CPE 7.5.1.3阴性血清对照应全部出现CPE 7.5.2判定标准 在以上对照成立的情况下,哪组阳性血清抗体滴度大于等于1:4,即判为阳性 说明 在以上的检测方法中,当检测结果不一致时,病毒中和试验为最终的判定方法
GB/27980一2011 附 录A 规范性附录 细胞培养液的制备 A.1MEM营养液的配制 MEM干粉 9,6g 去离子水 1000ml 充分溶解后经0.22um孔径微孔滤膜滤过除菌 细胞培养生长液是在滤过除菌营养液的基础上,按10%加人灭活犊牛血清和1000IU/mL青霉素 和链霉素,然后用7.5%NaHCO溶液调整pH至7.2左右 细胞培养维持液是在滤过除菌营养液的基础上,按2%加人灭活犊牛血清和1000IU/mL青霉素 和链霉素,然后用7.5%NaHCO溶液调整pH至7.2左右 A.2胰酶消化液配制 NaCl 8g KCIl 0.4 4g 0.4 KH,PO 4g 0.08 NaHPO12H.O g NaHCO 0 35g NaEDTA 0.2g Trypsinm 2.5g 用去离子水定容至1000ml,静置4h,用0.22m孔径微孔滤膜滤过除菌 分装一20C保存
GB/T27980一2011 附 录 B 规范性附录 琼脂平板制备 琼脂糖 1.0g 生理盐水 100mL 调整pH7.4一7.6,高压消毒20min,融化的琼脂待冷至45C50C时,以无菌状态倒人直径6cm 平皿中,每平皿约7mL,厚度约为4mm,待凝固后置4C保存备用
GB/27980?2011 ? c 淶?? PCR?? C.150TAE?? Tris 242g NaEDTA2H,O 37.2g 57.1mL ?? 100ml C.21xTAE 201 50TAE mL 1000ml ?? C.3? 1.5g" ??? 100mL 1TAE?? ???,?60C,EB????0.54g/ml,?? 10o
GB/T27980?2011 ? D 淶?? ??? D.110PBST 80 ?(NaCD) g ?(KCD 2g (Na,HPO) 22.9g (KHPO 2g -20 5ml ? 1000ml ?,·?á D.2PST?? 10PBST 100ml 900ml ? D.3PBST-SM 100mL PEBST??( ?? 1g D.40.05mol/L?λ?(pH9.6 ?(NaCO. 1.59 6 ?(NaHcO. 2.93g 0.10g" ? 1000ml ?4C汸 D.5OPD? OPD?)??(30mg/?)?75mL??,??,?5mL/?-20C ??档 D.62mol/L 160mL ?? ? 20ml

马病毒性动脉炎诊断技术GB/T27980-2011

马病毒性动脉炎（Equine viral arteritis，简称EVA）是一种由马病毒性动脉炎病毒引起的急性呼吸道疾病。该病毒主要通过空气传播和接触传播等途径传播，感染后会导致流感样症状、发热、咳嗽、鼻出血等症状。

为了及时诊断和控制EVA的传播，GB/T27980-2011标准规定了多种诊断技术。其中，最常用的方法是利用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清中的特异性抗体。这种方法可以快速、准确地检测马是否感染了EVA病毒。在ELISA检测中，可以使用组合抗原、亲和素-标记物等不同试剂来提高检测的准确性。

此外，还可以通过PCR技术检测马的血液、鼻液、精液等样本中是否存在EVA病毒的RNA。这种技术具有高度的灵敏度和特异性，但需要在实验室环境下进行，且需要相应的设备和技术支持。

另外，还可以采用中和试验、免疫荧光试验等方法对EVA病毒进行检测和分离。这些方法在EVA的诊断和研究中也具有重要的作用。

总之，在EVA的诊断和控制中，选择适当的诊断方法是非常重要的。我们应该根据实际情况和需要选择合适的诊断技术，并采取科学合理的防控措施来保障马的健康和安全。

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