国家标准 GB/T29585一2013 剪股颖粒线虫检疫鉴定方法 Deteetonandidemtifieation.ofAnguinaagrostis(steinbueth)ripjer 2013-07-19发布 2013-12-06实施国家质量监督检监检疫总局发布国家标准花管理委员会国家标准
GB/T29585一2013 前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口本标准起草单位;天津出人境检验检疫局、青岛出人境检验检疫局本标准主要起草人;王金成、杨秀丽、崔铁军、张治宇、刘鹏、廖芳、张裕君、牛春敬
GB/T29585一2013 剪股颖粒线虫检疫鉴定方法范围本标准规定了剪股额粒线虫的检疫和鉴定方法本标准适用于草籽及其他植物材料中剪股颖粒线虫的检疫及其鉴定规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 sN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样剪股颖粒线虫基本信息中文名称:剪股颖粒线虫 nematode 英文名称bentgrass" 学名;A" rosti、Steinbuch,1799Filipjev,1936. 2uina4gr E 分类地位;线虫门(Nematoda),侧尾腺纲(Secernentea),垫刃目(TylenchidaThorne，1949),粒线虫科[AnguinidaeNicoll，1935(1926]粒线虫属(AnguimScopoli.1777). 带虫种子,虫樱、植物病残组织是剪股颖粒线虫传插的主要载体剪股颖粒线虫的其他信息参见附录A. 方法原理现场检测获取样本,通过显微镜观察和分子生物学方法获取形态和核酸信息整定特征,进行整定仪器、用具 5.1仪器:显微镜(100x一1000×,具有目镜测微尺或绘图仪、图像捕获装置、测量软件)体视显微镜 (0×一80×,具透射光源),冰箱、,PCR仪,电泳仪、,凝胶成像系统、低速离心机(1000r/nmin一5000r/min),纯水仪 5.2用具:线虫挑针、载玻片、盖玻片、酒精灯、移液器(1000AL、100AL、10AL、2.5AL)、钟面皿 7cm、9cm),培养皿(7cm、p9cm)浅盘、套筛(400目500目,改进的贝尔曼漏斗、,加热板、打孔器、解剖刀试剂除非另有说明,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂或双蒸水 6 玻片封固剂、4%甲醛溶液、石蜡
GB/T29585一2013 6.210×XPCR缓冲液(一20C保存),25mnmol/L氯化镁(一20C保存),2.5mmol/LdNTP's(一20C保存),5U/aLTaq酶(一20C保存)、TAE或TBE电泳缓冲液、琼脂糖、溴酚蓝载样缓冲液(6×TAE缓冲液,.60%甘油.0.3%澳前蓝,4C保存),澳化乙绽(EB,避光保存),DNAladler marker -20C保存). 6.3剪股颖粒线虫rDNA-ITs质粒克隆(一20C保存). 现场检测 7.1抽样按照SN/T2122抽取进出境的草籽,植物样品 7.2外观症状的检查和取样剪股颖粒线虫主要侵染植物的花序,被寄生的小花的颖片、外秤和内秤显著伸长,其内的子房变成雪茄状的虫!;虫开始形成时为绿色,后变为褐色收集上述可疑的草籽,植物材料带回实验室检验实验室检验 8.1线虫分离浅盘和漏斗法;直接分离待检样品,室温(25C左右)条件下分离12h一24h,可获得线虫人工筛检虫瘦,对于草籽,除浅盘和漏斗法直接分离样品外,可根据剪股颖粒线虫危害寄主引起 8.1.2 的症状特点人工挑拣虫壑,获得虫瘦后,在清水中浸泡1h一2h,体视显微镜下挑针轻压,也可获得线虫 8.2显微观察,摄影和测量在体视显微镜下挑取线虫若干条制成临时玻片在显微镜下镜检,观察线虫的形态结构同时对线虫进行拍照,测量当虫量足够时,拍摄测量的雌虫、雄虫或幼虫数目应在15条以上 8.3分子生物学检测对形态学观察可疑的线虫幼虫应进行分子生物学检测鉴定与检测形态学鉴定 9.1.1粒线虫属形态鉴定特征成熟雌虫肥大,体型中等到大,长1mm一2.7mm,呈螺旋形中食道球有瓣;后食道腺膨大,与狄部之间连续或缢缩,通常覆盖肠,偶尔不覆盖肠雌虫卵巢前部转折,卵母细胞围绕一中轴多行排列,子宫柱状部由多行不规则细胞排列构成雄虫精原细胞多行排列;有引带;交合伞亚端生,长但不伸到尾端一般在寄主植物地上部形成虫楼 9.1.2剪股颖粒线虫形态鉴定特征雕虫;虫体粗壮,经热杀死后向腹面卷曲成螺旋形,角质膜表面环纹细,在成虫的虫体上难于 9.1.2.1 观察到侧带区唇区低平,缢缩垫刃型食道,食道前体部圆柱形,中部略膨大,与中食道球连接处稍缢
GB/T29585一2013 缩;狭部短而窄;后食道腺发达,梨形,不呈明显耳叶状,不覆盖肠的前端或稍覆盖前生殖腺发达,卵巢常折叠2次,卵母细胞围绕一中柱轴状多行排列,受精囊长梨形,与输卵管连接处稍缢缩分开,子宫内常有多个卵同时存在后阴子宫囊的长度为肛阴距的一半,内充满精子尾锥形,尾端锐尖 9.1.2.2雄虫;虫体比雌虫短而细,经热杀死后一般呈弓形精巢常回折1次,精母细胞多行排列交合刺比小麦粒线虫A.1 /rn ti ici的纤细,近端部向腹面折或不折,引带细线形交合伞亚端生尾端锐尖 9.1.2.32龄幼虫除生殖系统未发育及虫体较小外,其余形态结构与成虫相似 g.1.2.4近似种;小麦粒线虫A.tritici 两者的区别是:小麦粒线虫尾端钝圆,交合刺中部明显增粗基端头状突腹折,引带槽状,寄生小麦和燕麦;而剪股颖粒线虫则是尾端尖,交合刺中部仅略增粗,基端头状突不腹折或略腹折,引带细线状,寄生牧草 9.1.3剪股颖粒线虫形态特征图参见附录B 9.1.4剪股颖粒线虫测计值见表1 表1剪股颖粒线虫形态测量数据剪股颖分离物早熟禾和假梯草分离物测量项目和参数雕虫雄虫 2龄幼虫雌虫雄虫 2龄幼虫 1.392.60 0.550,82 2.524.14 1.54一2.31 0.811.25 L/mm 1.05l.45 13.8~25.4 23.830.0 7.265.0 21.8~30." 21.634.4 3.5~71.0 12.6一28." 6.5一8.9 3,2~4.5 10.3一26.5 6.8~l1.6 4.0~6.1 25.243.0 21.528.4 11，720.0 28.848.9 20.432.7 12.115.4 87一92 90一92 口针/um1 1012 1012 10 1012 1012 10 交合刺/um" 2532 3037 引带/um 1013 1315 注L;线虫体长;a;体长/最大体宽;b体长/虫体前端至食道腺与肠连接处的距离e;体长/尾长; V;虫体前端至阴门的距离×100/体长 9.2分子生物学检测见附录C 结果判定 1 符合9.1形态特征的粒线虫成虫,可判定为剪股颖粒线虫;符合9.1形态特征的粒线虫幼虫,经9.2特异引物扩增获得的CR产物约为500bp,同时阳性对照的CR产物约为500bp,空白对照无CR产物时,也可判定待检线虫为剪股颖粒线虫
GB/T29585一2013 11样品保存 11.1如果鉴定结果为剪股颖粒线虫,则将剩余的线虫杀死,置于4%甲醛固定液中或制成永久玻片长期保存对已经鉴定出带有勇股颖粒线虫的植物材料,保存在低温干燥、,防鼠防虫处,并注明样品编号、截 1.2 获日期、截获人,寄主名称,运输工具、输出国名等样品保存期为1年,有特殊需求保存期可适当延长，以备复验、谈判和仲裁保存期满,经灭活后妥善处理
GB/T29585一2013 附录A 资料性附录剪股颖粒线虫的其他信息 A.1地理分布 (内蒙古局部),爱沙尼亚、德国,俄罗斯、法国,芬兰、格鲁吉亚、荷兰、瑞典、乌克兰,英国、南非、澳大利亚,新西兰,加拿大,美国(太平洋沿岸) A.2寄主植物 A.2.1剪股颖属草类;细弱剪股颖Agrostistenuis、小糠草A.alba、绒毛剪股颖A.canina、糙叶剪股颖 A.erarata,佃匈剪股颖A.alustris,旬茎剪股颖A..stoloniera等 A.2.2其他禾本科牧草和杂草:Aperaspicaoenti、Arcalagrostislatifolid、野牛草Buchlon dactyoides、加拿大拂子茅Calua densis,兰斯多夫拂子茅C.langsdorfii、Digraphi amagrostiscnad inasea,羊茅Fe 紫羊茅F.rubru,芒麦草H0 wrdeumjuatum,Koeleriaglauca、黑麦草 arndli 'stucaoUinau Loliberee、 ,假梯牧草Phleumphleoide、、 ,高原早熟禾Palpina、早熟禾P.annua、六月禾海滨脸草Puccinellia、maritlima、Sporobolusbrockmani、黄三毛草Trisetum ratesis、等 flaUesce1s A.3危害症状剪股颖粒线虫主要侵染植物的花序,被寄生的小花的颖片、外秤和内秤显著伸长,其内的子房变成雪虫樱开始形成时为绿包,后期变为紫褐色,长约4 茄状的虫 mm5mm,而正常的颖果长约1mm 被线虫寄生的花的浆片,花柱以及花的其他部分发育均受到抑制 A.4生物学剪股颖粒线虫每年发生1代,完成1代大约需要3周一4周 2龄幼虫只有侵人正在发育的花序才能在子房内发育成成虫每条雌虫可产卵1000余粒在干燥的虫内,该线虫以休眼2龄幼虫虫态可存活10年
GB/T29585?2013 B ? ?? ???? ????B.1 200 AB O 00 D,EP 50 T ?: - A B ?; c ? D -?β; ?β E,F ?? G ?:?B,1T.Goodey1930 ?B.1??Anguimaagrostis
GB/T29585一2013 附录 c 规范性附录分子生物学检测流程 C.1DA提取剪股颖粒线虫DNA的提取方法如下也可以使用实验室成熟稳定的DNA提取方法或市售DNA 提取试剂盒提取 C.1.1洗涤线虫用挑针挑取活体粒线虫(Anguina)幼虫若干条,放人去离子水中洗涤3次,备用 C.1.2切割线虫在洁净的载玻片上加10ML去离子水,挑人35条经过洗涤的线虫,用解剖刀将每条线虫切成 2段3段,连同8AL去离子水吸人到200AL的离心管中 C.1.3DNA提取在上述管中加人1.0L.10xrR缓冲液、1.0A蛋白酶K(1000g/ml)后放冰箱中低温(一20c) 将冷冻后的线虫取出,迅速放人CR仪中,65笔条件下保温1h一2h,.95笔条件下保温冷冻至少30min 10min,即获得线虫的DNA模板 C.2常规PCR检测 c.2.1引物上游引物AgrF;5'-CATTcTTACAGcCAATAGTcTG3" 下游引物AgrR:5’-TGACTcTAGCGGAGTATcG-3’ c.2.2PCR扩增 c.2.2.1根据表C.1将线虫的DNA模板及相关试剂加人200AL的PCR管中表c.1常规PCR反应体系(50L 溶液用量终浓度 10×CR-缓冲液 1×CR-缓冲液 5Al 25mmol 2.0mmolL叙化镁飘化铁 4Al 0.1mmoNTP 2L2.5mmolLdNP 2nl10pmol/alAgrF 0.44mol/1AgrF 2l.10pmol/lAgrR 0.4Amol/LAgrR 0.4L5U/ALTaq-酶 2UTag-酶 8LDNA模板去离子水26,6L
GB/T29585一2013 C.2.2.2按照如下PCR反应程序进行扩增:94C,4min;94C,40s,58C,40s72C,90s,40个循环;72C,5min;4保存以剪股颖粒线虫rDNA-ITS质粒克隆作为阳性对照,以灭菌的去离子水作空白对照 c.3电泳制作1.5%的琼脂糖胶,取PCR反应产物5AlL.,加人1L澳酚蓝载样缓冲液(6×TAE缓冲液， 60%甘油,0.3%溴酚蓝;4C保存),充分混匀后移人胶孔样品的两侧分别加人100bpDNAladder Marker,100V电压下电泳(10V/e cm C.4 凝胶成像将电冰后的凝股小心地转移到1g/mLEB莽液中染色30min,再将胶块小心地转移到凝胶成像系统中,观察是否有500p的目标片段,拍照保存

剪股颖粒线虫检疫鉴定方法GB/T29585-2013

剪股颖粒线虫是一种常见的植物寄生线虫，可以引起多种作物的大面积死亡和经济损失。为了保护我国的农业生产和贸易利益，我们需要对进出口产品中的剪股颖粒线虫进行检测和鉴定。

剪股颖粒线虫的危害

剪股颖粒线虫侵染植物后，会在其内部吸取养分，使植株生长发育受到严重影响。叶片黄化、萎缩，枝条变脆、干枯，最终导致植株死亡。此外，剪股颖粒线虫还会在植物体内繁殖，并通过土壤、水源等途径传播，对农业生产造成巨大危害。

检测流程

剪股颖粒线虫的检测流程主要包括样品采集、处理、PCR扩增和结果解析几个环节。

样品采集需要注意避免污染，一般采用无菌操作或带手套的操作。采集的样品要求新鲜完整，不受损伤。

处理过程主要是将样品中的剪股颖粒线虫分离出来，常用的方法包括筛选法、酚氯仿提取法等。这个过程需要专业的实验室设备和技术支持，可以请相关机构或企业来完成。

PCR扩增过程是将样品中的DNA提取出来，并使用特异性引物进行扩增。最终通过电泳等方式对 PCR 产物进行检测和结果解析。

标准要求

GB/T29585-2013《植物寄生性线虫检疫鉴定技术通则》规定了剪股颖粒线虫检测的技术要求和标准要求。

其中，样品的采集要求新鲜、完整，不受损伤。提取方法需要可靠，并且不能对目标基因进行破坏。PCR扩增条件需要精确可靠，结果应该准确。此外，标准还规定了检测过程中的控制要求，如阴性对照、阳性对照等，以确保检测结果的正确性和可靠性。

结论

剪股颖粒线虫检疫鉴定是保障我国农业生产和贸易安全的重要手段之一，GB/T29585-2013指导下，我们可以通过科学合理的检测流程和标准要求来对剪股颖粒线虫进行检测，提高进出口产品的安全性和市场竞争力。