蚕豆染色病毒检疫鉴定方法

蚕豆染色病毒检疫鉴定方法

国家标准 GB/T28064一2011 蚕豆染色病毒检疫鉴定方法 Deteetionandidentificationofbroadbeanstainvirus 2011-12-30发布 2012-06-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T28064一2011 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口 本标准起草单位;厦门出人境检验检疫局、检验检疫科学研究院、中华人民共 和国深圳出人境检验检疫局 本标准主要起草人:陈红运、陈青、林石明、郑耘,赵文军、李一农、廖富荣,余芳平,朱水芳、陈枝楠
GB/T28064一2011 蚕豆染色病毒检疫鉴定方法 范围 本标准规定了蚕豆染色病毒的血清学和分子检测方法 本标准适用于蚕豆Vieiaaba、小扁豆Lensculinaris、豌豆Pisumsaivwn和菜豆Phaseolus ulgari种子携带蚕豆染色病毒的检疫鉴定 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样 蚕豆染色病毒基本信息 中文名;蚕豆染色病毒 学名:broadbeanstainvirus 缩写:BBSV 属豇豆花叶病毒科Comoviridae;豇豆花叶病毒属Comovirus 病株花粉可通过授粉将病毒传至健株种子;远距离通过种子传播,种传寄主有蚕豆(种传率4%一 16%)、豌豆(20%)和小扁豆(0.2%32.4%) BBSV易机械接种传播,并可通过甲虫传毒,豆长喙象 是最主要的传毒介体 甲Apion Uor`.T 蚕豆染色病毒的其他信息参见附录A 方法原理 主要根据BBSV的血清学特性和基因组特征进行鉴定,生物学测定为辅助鉴定手段 仪器设施及试剂 51仪器与设施 酶联检测仪、电子天平(感量0.0001g),定性PCR仪、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪,恒温水浴、低 温冰箱,普通冰箱,离心机等;微量移液器(2.5AL.10AL.20AL.100L..,200L,1000AL);酶联板.研 钵等;防虫温室 5.2试剂 酶联免疫吸附测定试剂见附录B)RT-PCR检测试剂(见附录C).
GB/28064一2011 检测与鉴定 抽样 按照SN/T2122的规定执行 制样 选取种皮呈BBsV为害症状的可疑病粒,无可疑病粒时随机选取 用无菌水浸种16h,磁盘中放 人两层吸满水的滤纸,将充分吸水的种子摆放在滤纸上,20笔催芽,芽长2cm一4em时取芽进行检测 检测方法见6.3 注:资源性引种时.每份资源选10粒一14粒种子播种于防虫温室或网室内,待长出4片一6片叶时挑选有病毒症 状植株的叶片进行检测 6.3检测 6.3.1酶联免疫吸附测定 双抗体夹心法见附录B 6.3.2Rr-CR检测 称取0.1只植物组织提取总RNA沉淀充分干燥后溶于30ALDEPC处理的去离子水中 RT-PCR检测方法见附录c 6.3.3生物学测定 生物学测定参见附录D. 结果判定与记录 7.1结果判定 酶联测定为阳性后,RT-PCR检测结果呈阴性或者鉴别寄主反应与附录D描述不符合,判定未检 出蚕豆染色病毒 酶联测定为阳性后,RT-PCR检测结果呈阳性或者鉴别寄主反应与附录D描述相符合,判定检出 蚕豆染色病毒 直接对样品进行RT-PCR检测时,检测结果呈阳性即可判定检出蚕豆染色病毒 7.2结果记录 记录包括;样品来源、种类、取样人员、原始记录和检测结果等 酶联测定应有酶联板反应的原始数 据,RT-PCR检测应有电泳结果图片,生物学测定应有鉴别寄主的症状照片 样品保存 经检验确定携带蚕豆染色病毒的样品应在合适的条件下保存,种子保存在4C,病株在一20或 者一80C冰箱中保存,做好标记和登记工作
GB/T28064一2011 附 录A 资料性附录 蚕豆染色病毒寄主、分布及危害症状 A.1寄主范围 BBSV侵染7种豆科植物;美丽猪屎豆(Crolalariaseelabilis),毛羽扇豆(L.ubin4shirsuus)、白花 草木犀(Melilotsalba),菜豆、豌豆、绛车轴草(Trifoliwincarnatum)和蚕豆 A.2病害症状 A.2.1蚕豆 蚕豆感染BBSV后,症状分为花叶型和坏死型 花叶型表现为接种叶片上有或无局部斑,新叶均 呈褪绿条纹状,环状和块状花叶片上出现褪绿斑驳和花叶症状;坏死型表现为接种叶片有或无黄化或局 部斑,叶脉和茎出现坏死条纹,最后茎坏死、顶枯,全株萎藕 种子表皮出现褐色坏死色斑 A， .2.2豌豆 豌豆感染BBsV后,症状分为花叶型、顶枯型和花叶、顶枯混合型 花叶型先在新叶出现系统褪绿 点,后发展为花叶、畸形;顶枯型在茎上出现系统褐色或坏死条纹,后顶梢枯死 A.2.3菜豆 豌豆感染BBsV后,症状分为局部斑和系统斑 局部斑是在接种叶上产生局部坏死斑或先为局部 褪绿斑而后病斑中心坏死,系统斑不但在接种叶上有坏死斑,新生叶还出现系统枯斑 A.2.4小扁豆 小扁豆感染BBSV后,症状不明显或很长时间才有症状反应,有些品种出现死株,有些品种接种后 25d才见新叶上出现不明显花叶 因此小届豆不适合作繁殖寄主或鉴别寄主 A.3分布地区 英国法国、德国、瑞典、捷克、奥地利波兰、匈牙利、意大利、叙利亚、黎巴嫩、苏丹,摩洛哥、埃及和 突尼斯等欧洲,西亚和北非国家
GB/28064?2011 ? B 淶?? ??? B.1? B.1.1?塣 B.1.2:?????塣 B.1.3??;??????塣 B.1.4;(pNPP). B.1.5PBST?(???pH7.4) NaCI 8.0g Na,HPO 1.15g KHPO 0.2g Kcl 0.2g Tween-20 0. .5mL ?1L B.1.6???(pH7.4 NaS(O. 1.3g PVP(Mw24000~40000) 20.0g NaN 0.2 g PBST1L,4C档 B.1.7?(pHH9.6 NagCO 1.59g 2.93 NaHCO g NaNa 0.2g ?1L,4C档 ????(H7.) B.1.8 BSA(???)?? 2.0g PVPMW2400040000 20.0s g NaN 0.2g PBST1L4档 B.1.9(oNPP)?(pHH9.8) MgC 0.1g NaN 0.2g ? 97mL 800ml?,HClpH?9.8,?1L4C档 B.2 B.2.1 ??尴??,??,100l/,37C2h,?? PBST?3
GB/T28064一2011 B.2.2样品制备 待测样品按1;10(质量;体积)加人抽提缓冲液,用研钵研磨成浆,7500！离心10min,上清液即 为制备好的检测样品 阴性对照,阳性对照作相应的处理或按照说明书进行;空白对照为样品抽提缓 冲液 B.2.3加样 根据检测需要设计96孔(或48孔)酶联板,包括2个阴性对照孔、2个阳性对照孔、2个空白对照孔 和多个待测样品孔 加样量为100pL/孔,每个样品设1个重复 4C冰箱孵育过夜,酶联板用PBsT 洗涤3次 B.2.4加酶标抗体 用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度,并加人到酶联板中,l00丛l/孔,37C 孵育4h,PBST洗涤3次 B.2.5加底物 将底物pNPp加人到底物缓冲液中使终浓度为1mg/ml.(现配现用)按10,l/孔,加人到彤联板 中,室温避光孵育 B.2.6读数 用酶标仪在30min、1和2h于405nm处读OD值 注;实际检测时,PBsT洗涤次数和显色读数时间需按照检测抗体或试剂盒中说明书的规定执行 B.3结果判断 B.3.1对照孔的OD值(缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔),应该在质量控制范围内,即 缓冲液孔和阴性对照孔的OD值<0.15; 阳性对照OD值/阴性对照OD值>2; 同一样品的OD值应基本一致 B.3.2在满足了B.3.1质量要求后,结果原则上可判断如下 样品OD值/阴性对照OD值>2,判为阳性; 样品OD值/阴性对照OD值接近阙值,判为可疑样品,需重做一次或用其他方法验证; 样品OD值/阴性对照OD值<2,判为阴性 若满足不了B.3.1质量要求,则不能进行结果判断 B.3.3 注，质量控制标准和结果判定需按照检测抗体或试剂盒中说明书的规定执行
GB/28064一2011 附 录 c 规范性附录 Rr-CR检测 c.1试剂 C.1.1TrizoL裂解液 c.1.2三氯甲婉 C.1.3异丙醇 c.1.475%乙醇 C.1.5去离子水(DEPC处理) C.1.650×TAE Tris 242 g 冰醋酸 52.1ml NaEDTA2H.O 37.2g 加去离子水定容至1L 用时加水稀释至1×TAE c.1.76×加样缓冲液 0.25%澳酚蓝 40%(质量浓度)蔗糖水溶液 C.2实验步骤 c.2.1总RNA提取 称取0.1只植物组织加液氮研磨成粉末状,迅速将其移人灭菌的1.5mL离心管中,加人1mL的 TrizoL试剂,剧烈振荡摇匀后室温保持5min;4,12000g离心10min,取上清液;加人0.2mL三氧 甲婉并剧烈振荡混匀;4C,12000离心10min,取上清液;加0.6倍体积的异丙醇,颠倒混匀,室温保 持5min;4,12000尽离心10min,弃上清液;加75%的乙醇洗涤沉淀,4C,7500片离心2min,弃乙 醇;沉淀于室温下充分干燥后,溶于30AL去离子水(DEPC处理)中,一20C保存备用 也可采用等效 的试剂盒提取总RNA c.2.2RT-CR反应 RT-PCR检测引物见表C.1 eDNA的合成;在0.2mL反应管中,加人总RNA6AL,lL下游引 物(20mol/L),去离子水4L,l0mmol/儿LdNTPs1AL,65C水浴5min,取出后立即放在冰上,加人 5XFirstStrandBuffer4Al,40U/LRNaseBloekRibonucleaseInhibitor1AlL,0.1nmol/ITT2Al 42C水浴2min,然后再加人200U/alReverseTranscriptase1AL,混匀后42C水浴50min,70C水 浴15min,合成cDNA FirstStrandBuffer和ReverseTranseriptase的用量需要依据反转录酶的品牌 进行调整 也可采用一步法RT-PCR试剂盒进行扩增
GB/T28064一2011 表C.1R-PCR检测的引物 检测基因 引物序列(5'3' 上游引物 TggcAAgTcACAgTTCcgC 小外壳蛋白(SCP CEccTcTTTTTTc 下游引物 ACg PCR反应体系见表C.2 反应参数:94C5min;94C30s,54C45s,72C45s,35个循环 72C7min 表C.2PCR反应体系 10×PCR Bufler(MgClplus) 2.5 0.5 上游引物(20Amol/L 下游引物(20umol/L 0.5 Taq酶(5U/l 0.2 cDNA模板 2.0 去离子水 补足反应总体积为25Al. c.2.3电泳 c.2.3.1制备凝胶 配制1.5%(质量:浓度)的琼脂糖凝胶 溴化乙锭可直接加人琼脂糖凝胶中(浓度为0.54g/ml). 也可在电泳完成后使用澳化乙锭染色 C.2.3.2电泳 用1l.6×加样缓冲液与5AL样品混合,然后将其和适合的DNA相对分子质量标准物分别加人 到样品孔中 电泳结束后将琼脂糖凝胶置于紫外透射仪上观察,拍照并保留结果 C.3结果判断 C.3.1阳性对照在499p处有扩增片段,阴性对照和空白对照无特异性扩增,待测样品出现与阳性对 照一致的扩增条带,可判定为阳性 C.3.2阳性对照、阴性对照和空白对照结果正确,且样品在499bp处无扩增条带,判定结果为阴性
GB/T28064一2011 附 录 D 资料性附录 生物学测定 D.1接种 病叶加1:1(质量:体积)的磷酸盐缓冲液(0.01nmol/L,pH7.2)于研钵中充分研碎,在待接种植 物叶片表面均匀洒上硅藻土,用手指蘸取研磨好的汁液轻轻涂抹于叶片表面 D.2寄主症状 D.2.1鉴别寄主(diagnostiespeeies) 菜豆;品种Tendergreen和Canaadianwonder表现褪绿局部斑和系统褪绿花叶 品种Prince仅为 局部侵染,BBSV不能侵染品种P'ntoldahoRefugee,BlueLake和Tendererop 豌豆;BBSV可侵染所有品种,产生系统褪绿斑驳症状,在冷凉气候下茎和叶片出现坏死 蚕豆:BBSV侵染品种“成胡10号”后表现花叶型,即接种叶片上有或无局部斑,新叶均呈褪绿条纹 状、环状和块状花叶片上出现褪绿斑驳和花叶症状 BBSV不能侵染苑色藜 Chenopodiumamaranticolor),千日红Gomphrenaglobosa,普通烟 (Nicotianatabacm cleelandli n)和克利夫兰烟(N.G D.2.2繁殖寄主(propagatiospeeies 豌豆品种omward.,菜豆品种Tendergreen和蚕豆品种“成胡10号" D.2.3试验寄主(assayspeeies) BBsV在菜豆品种Tendergreen上引起局部斑,在蚕豆上表现系统侵染

蚕豆染色病毒检疫鉴定方法GB/T28064-2011

蚕豆作为我国重要的粮食作物之一，其种植面积日益扩大。然而，由于蚕豆染色病毒的侵害，蚕豆产量和质量受到了很大影响。因此，蚕豆染色病毒的检测和鉴定显得尤为重要。

《蚕豆染色病毒检疫鉴定方法GB/T28064-2011》规定了蚕豆染色病毒检测的基本原则、方法、技术要求和注意事项。该标准明确了分离、鉴定、确认蚕豆染色病毒的方法和步骤，包括田间样品采集、实验室检测、结果分析和报告撰写等内容。

该标准要求采用一些特定的试剂和设备，如酶联免疫吸附试验（ELISA）、聚合酶链式反应（PCR）等技术，对蚕豆样品进行检测。根据检测结果，可以确定蚕豆是否感染了染色病毒，并且判断其病毒类型及侵染程度。

此外，《蚕豆染色病毒检疫鉴定方法GB/T28064-2011》还规定了检测时的质量控制要求。在检测过程中，必须使用正、负对照，以确保结果的准确性和可靠性。

总之，蚕豆染色病毒检疫鉴定方法是保障我国农产品贸易安全的重要环节。通过遵循该标准规定的检测步骤和方法，可以有效地防止蚕豆染色病毒的传播和侵害，促进我国蚕豆产业的健康发展。

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