国家标准 GB/T16551一2020 代替GB/T165512008 瘟诊断技术 Diugostietechniquesforcasiealswimefever 2020-12-14发布 2020-12-14实施国家市场监督管理总局发布国家标涯花管理委员会国家标准
GB/T16551一2020 目次前言引言范围 2 规范性引用文件缩略语临床症状与病理变化 4.1临床症状 4.2病理变化 4.3结果判定 5 样本的采集、保存,运输和处理器材 5,l 5.2试剂 5.3样品采集 5.！保存与运输 5.5样本处理实验室病原学诊断方法 6.1免疫荧光抗体试验(FAT) 6.2免疫过氧化物酶试验(IPT) 6.3猪瘟病毒分离与鉴定 6.4猪瘟病毒RT-nPCR检测方法 6.5猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法实验室抗体检测方法 7.1猪瘟病毒中和试验 7.2猪痛病毒阻断ELISA抗体检测方法 7.3猪瘟抗体间接ELISA检测方法 7.4猪痛病毒化学发光抗体检测方法综合判定附录A规范性附录试剂配制附录B(规范性附录猪瘟病毒TCID.测定 14 15 附录C规范性附录校准品的制备
GB/T16551一2020 前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准代替GB/T16551一2008《猪瘟诊断技术》与GB16551一2008相比,主要技术变化如下 -修改了“范围”(见第1章,2008年版的第1章); -增加了“规范性引用文件”见第2章); -增加了“缩略语”(见第3章); 修改了“临床及病理学诊断”部分,并更名为“临床症状与病理变化”见第4章,2008年版的第2章); -增加了“样本的采集、保存、运输和处理”部分(见第5章); 修改了“病原学诊断”部分,并更名为“实验室病原学诊断方法”(见第6章,2008年版的第3章) 删除了“兔体交互免疫试验"部分(见2008年版的3.1); 修改了“免疫酶染色试验”和“直接免疫荧光抗体试验”部分 ,更名为“免疫荧光抗体试验 FAT)”和“免疫过氧化物酶试验(IPT)”见6.1、6.2,2008年版的3.23.4); 修改了“病毒分离与鉴定试验”部分,更名为“猪痛病毒分离与鉴定”见6,3,2008年版的3.3); 别除了"猪继病毒反转录聚合刚链式反应(RTPR)"见28年版的3.5)7 增加了“猪瘟病毒RT-nPCR检测方法”和“猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法”见6.4、6.5) 修改了“血清学诊断”部分,并更名为“实验室抗体检测方法”(见第7章,2008年版的第4章); 修改了“荧光抗体病毒中和试验”部分,并更名为“猪瘟病毒中和试验”(见7.1,2008年版的 4.1); 删除了“猪瘟单抗酶联免疫吸附试验”(见2008年版的4.2); 增加了“猪瘟病毒阻断ELIsA抗体检测方法”“猪瘟抗体间接ELIsA检测方法”和“猪痛病毒化学发光抗体检测方法”(见7.2、7.3、7.4) 本标准由农业农村部提出本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAc/Tc181)归口本标准起草单位;兽医药品监察所本标准主要起草人:;王琴、赵启祖、徐璐、王在时、张乾义、夏应菊、范学政,邹兴启,朱元源,李翠、丘惠深、赵耘,徐源本标准所代替标准的历次版本发布情况为: GB/T16551一2008.
GB/T16551一2020 引言猪痛(Classiealswinefever,CSF)是由猪瘟病毒(Classiealswinefevervirus,CSFV感染猪引起的 -种高度接触性致死性传染性疾病,可造成巨大的经济损失和社会影响被世界动物卫生组织(oIE) 列为必须报告的疫病,我国规定CSF为一类动物疫病 ,发病猪和带毒猪是本病的传染源,不同年龄.,性别,品种的猪均猪包精野猪是本稍唯" 一的自然宿主，易感，一年四季均可发生感染猪在发病前能通过分泌物和排泄物排毒,并持续整个病程与感染猪直接接触是本病传播的主要方式,病毒也可通过精液、胚胎,猪肉和钳水等方式间接传播,人、其他动物如鼠类和昆虫、器具等均可成为重要传播媒介 CSFV是黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)的成员之一,只有1个血清型,3个基因型 10个基因亚型,不同基因型间有很好的抗原交叉反应近年来,由于临床上出现了CSFV持续性感染所致的无典型临床症状和病理变化的慢性和隐性感染形式.以及多种疫病混合感染的现象.CSF的临床诊断和病理学诊断只能作为初步诊断的依据,对CSF病原的实验室检测是确定病毒感染的主要方法,要求诊断技术和标准更加特异和敏感由于诊断的需求和诊断技术的发展,GB/T16551一2008已经不适应要求针对CSF感染普遍存在病毒载量低,病毒血症时间短等特点,最适用于活体动物的检测样本首先是扁桃体,其次为抗凝全血;若为病死动物,可采集扁桃体、脾脏、肾脏、胰脏、回肠、回盲瓣、肠系膜淋巴结和颌下淋巴结等含毒量较高的脏器进行检测采用CSFV抗原免疫检测法[免疫荧光抗体试验(Fluorescentantibodytest,FAT)/免疫过氧化物酶试验lmmunoperoxidasetest,IPT)]可检测感染组织和细胞中的病毒抗原,用于确诊;如果结果可疑或者样本不足,可以通过核酸检测技术确认如果样本量大,可采用猪瘟病毒实时荧光RTPCR检测方法进行初筛,阳性者采用猪瘟病毒RT-nPCR 检测方法和序列测定进行确诊和基因分型;上述都不能确诊的样本,采用经典的CSFV分离技术确诊，分离的病毒可用于进一步研究上述三类方法均为OIE推荐的方法目前,实施CSF疫苗全面免疫是我国防控CSF的重要手段,CSFV抗体检测主要用于CSF疫苗的免疫效果评价,而对于一些不实施免疫CSF疫苗的国家和地区来说,CSF抗体检测可以作为未免疫猪瘟疫苗猪群感染CSF的诊断依据而在我国,ELISA方法已成为监测免疫后CSFV抗体保护水平、评价猪群免疫效果的最主要手段,根据检测目的不同,可选择不同的方法对于我国CSF疫苗采取的全面免疫后而开展的大规模普查,间接ELISA抗体检测方法能够更加真实地反映中和抗体水平,为免疫程序制定和抗体水平监测提供可靠的数据支持;阻断ELISA抗体检测方法因其特异性强,可用于引种的种猪检测;化学发光抗体检测方法是近年来发展起来的一种新的酶联免疫检测方法,利用化学发光底物提高检测的灵敏度,同时增加检测的线性范围本标准中的CSFV化学发光抗体检测方法中采用了 CSFV抗体的校准品,并在检测中绘制校准曲线,可以使抗体检测结果相对定量另外,采用该方法进行检测,能够大大缩短检测时间,适应于田间推广使用最终的抗体确认可采用“金标准”方法病毒中和试验(Virut rusneutralizationtest,VNT) ELISA方法和VNT两类方法均为OIE推荐的方法,也是国际贸易指定试验本标准中涉及了5种CSF病原和4种CSFV抗体的实验室检测方法,均可用于CSF病原和抗体的定性检测使用者可根据自身的实验条件,能力水平以及待检样本的实际情况选择合适的方法本文件的发布机构提请注意,声明符合本文件时,可能涉及7.2和7.3与CSFVE2蛋白表达及纯化相关的专利的使用本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场该专利持有人已向本文件的发布机构保证,他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下， IN
GB/T16551一2020 就专利授权许可进行谈判该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案相关信息可以通过以下联系方式获得专利持有人姓名:兽医药品监察所地址:北京中关村南大街8号请注意除上述专利外,本文件的某些内容仍可能涉及专利本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任
GB/T16551一2020 猪瘟诊断技术范围本标准规定了猪瘟的临床症状与病理变化,样本的采集、保存、运输和处理,实验室病原学诊断方法以及实验室抗体检测方法等本标准适用于猪(家猪、野猪)的猪瘟诊断规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注明日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB19489实验室生物安全通用要求 GB/T27540猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法 GB/T34729一2017猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测方法 GB/T35906猪瘟抗体间接ELISA检测方法 GB/T36875猪瘟病毒RT-nPCR检测方法 NY/T541兽医诊断样本采集、保存与运输技术规范缩略语下列缩略语适用于本文件 swinefever CSF:猪瘟(Classical assicalswinefevervirus) CSFV;猪瘟病毒(Cla EDTA:乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraaceticacid) ELISA;酶联免疫吸附试验(Enzymelinkedimmunosorbentassay FAT;免疫荧光抗体试验(Fluorescentantibodytest) FITC:异硫氢酸荧光素(Fluoresceinisothiocyanate) HRP辣根过氧化物酶(Horseradishperoxidase) PT;免疫过氧化物酶试验 Immunoperoxidasetest MEM:基础Eagle培养基(Minimmum medium NCU;国家临床单位(National clinical NIF:免疫荧光中和试验(Neutralization mmunofluorescence NPLA;过氧化物酶联中和试验 antibody Neutralizationperoxidase-linked PBS;磷酸盐缓冲溶液( Phosphatebufferedsaline) PK-15;猪肾传代细胞系(Pigkidney-15celline) RT-nPCR;巢式PCR技术(Reversetranscriptionnestpolymerasechainreaetion) RT-PCR:反转录聚合酶链式反应(Reversetranseriptionpolymerasechainreaction) suecultureinfectivedose) TCID0;组织半数感染剂量(50%tis
GB/T16551一2020 临床症状与病理变化 4.1临床症状猪群中被检猪出现下列临床症状时,可作为综合诊断定性的依据之一发病急、病死率高; a b 体温>40.5C或间歇性发热 c 精神萎靡畏寒,厌食甚至废食,呕吐、步态不稳或跛行; d 先便秘后腹泻,或便秘和腹泻交替出现腹部皮下、鼻镜、耳尖、四肢内侧均可出现紫色出血斑点,指压不褪色，结膜炎; e 怀孕母猪有流产、死胎、“木乃伊”胎或所产仔猪有衰弱、震颤、痉挛、发育不良等现象 4.2病理变化对临床检出的可疑患猪可进行病理学诊断,下述肉眼可见的病理变化可作为综合诊断定性的依据淋巴结水肿、出血,呈现红白相间“大理石样变” a b 肾脏呈土黄色,表面可见出血点,部分病例可见雀斑肾; 全身浆膜、黏膜和心脏、,膀胱、胆囊、扁桃体均可见出血点和出血斑; c 脾脏不肿大,表面有点状出血或边缘出现突起的楔状梗死区 d 慢性CSF在回肠末端、盲肠和结肠常见“纽扣状”溃疡 4.3结果判定易感猪出现4.1或4.2的情况,可判定为疑似csF 确诊应采集有临床症状或病理变化的猪的扁桃体、,啤脏、肾脏、,胰脏、回肠、回盲瓣、肠系膜淋巴结和领下淋巴结等组织(若无法采集组织,也可采集抗凝全血,但会大大降低检测的敏感性)按实验室病原学诊断方法进行确诊 5 样本的采集、保存、运输和处理 5.1器材扁桃体活体采样箱(包括鼻捻子、,开口器和采样枪). 5.1.1 5.1.2无菌剪刀 5.1.3无菌镀子 5.1.4无菌离心管 5.1.5无菌注射器 5.1.6医用EDTA抗凝采血管 5.17 -次性密封袋 5.1.8组织匀浆器或研磨器 5.1.9冷冻离心机 5.2试剂 5.2.1MEM培养液
GB/T16551一2020 5.2.2 双抗储液,见A.1 5.2.375%酒精,见A.2 5.3样品采集 5.3.1活体动物扁桃体的采集采集活体猪扁桃体时,用鼻捻子固定猪上唇,用开口器打开口腔,用采样枪采集扁桃体样本,放人离心管中并编号 5.3.2活体动物抗凝全血的采集采用75%酒精对待采血动物颈部前腔静脉表面皮肤进行擦拭消毒用无菌注射器于前腔静脉采血,立即注人医用EDTA抗凝采血管,充分混匀后编号备用 5.3.3组织样品采集病死猪可采集扁桃体、淋巴结、胰脏、脾脏、回肠、肝脏和肾脏等含毒量较高的组织脏器若组织或脏器出现了典型的病理变化,宜采集病健交界处的组织,不宜采集病变严重且出现继发感染如细菌污染)的组织采样时用无菌的剪刀和锻子剪切至少1g,装人一次性自封袋或离心管,编号 5.4保存与运输采集的样本应放人主容器密封后,采用保温容器加冰袋或干冰密封,应在8h之内运送到实验室样本相关生物安全标识和运送流程应按照NY/T541的相关规定执行样本到达实验室后,在2C8C条件下保存应<24h 若需长期保存,应放置于超低温冰箱 -70),避免反复冻融 5.5样本处理 5.5.1生物安全措施样本处理的生物安全措施按GB19489规定的相关操作进行 5.5.2组织样本的处理将病料用无菌眼科剪和眼科锻进行修剪(病灶与健康组织的交界处),处理不同组织病料应更换手套并消毒操作器械取1g大小的病料组织,置于无菌离心管中,再向其中加人无菌MEM培养液(含 2%双抗)1ml 在2C一8C温度下置于匀浆机中匀浆,将匀浆液于4C温度下8000r/min离心 5min,取上清,置于另一个无菌离心管中,待检 5.5.3抗凝全血的处理将抗凝全血样本直接分装于无菌离心管中,在4C下8000r/min离心5min,取上清,置于另一个无菌离心管中,待检实验室病原学诊断方法 6.1免疫荧光抗体试验(FAr) 6.1.1概述本方法快速、特异,可用于检测扁桃体、淋巴结、啤脏、胰脏、肾脏和回肠远端等组织样品的冰冻切片
GB/T16551一2020 或触片以及细胞培养物中的病毒抗原样本需在无防腐剂的冷藏条件下运送,但样本不能冻结根据 FITC标记的抗体不同,可分为直接法和间接法 6.1.2器材 6.1.2.1倒置荧光显微镜 6.1.2.2恒温培养箱 6.1.2.3湿盒(带盖子的长方形容器,底部铺一层湿纱布) 6.1.2.4盖玻片 6.1.2.5微量移液器(200AL、1000AL) 6.1.3试剂 PES缓冲液,见A.3. 6.1.3.1 6.1.3.2丙酮,一20C预冷 6.1.3.3固定液,见A.9 6.1.3.4缓冲甘油,见A.4 6.1.3.5抗体;直接法采用FITC标记的抗CSFV的单克隆或多克隆抗体;间接法采用抗CSFV的单克隆或多克隆抗体及相应的FITC标记二抗 6.1.4操作步骤 6.1.4.1将待检的组织样本制成冰冻切片或触片,将液体吸干后用预冷的丙酮固定5min10min 自然干燥;细胞培养物弃去孔中液体,用PBS缓冲液漂洗3次后,自然干燥,每孔加人适量固定液固定 30min 每个样本应做3个重复切片或触片固定后用PBS缓冲液漂洗3次,自然干燥同时采用阳性组织和阴性组织进行相同处理,分别作为阳性对照和阴性对照 6.1.4.2染色方法,以下两种可任选其直接法:滴加工作浓度的FITC标记的抗cSFV的单克隆或多克隆抗体,覆盖于样本表面,置 a 37 C湿盒避光作用30min一40min,用PBS缓冲液洗涤3次 b)间接法:滴加工作浓度的抗CSFV的单克隆或多克隆抗体,覆盖于样本表面,置37C湿盒作用 lh后,用PBSs缓冲液洗涤3次,再加人工作浓度的FITc标记二抗,置37C湿盒避光作用 30min一40nmin,用PBS缓冲液洗涤3次 6.1.4.3将组织切片放置室温干燥5min,于组织样本表面滴加适量缓冲甘油,用盖玻片覆盖样本;细胞培养物表面滴加适量PBS缓冲液将样本直接置于倒置荧光显微镜下观察结果 6.1.4.4实验成立条件和结果判定:当细胞胞浆中出现亮绿色荧光着染时,判为染色阳性;细胞胞浆无着染,判为染色阴性当阳性对照为染色阳性,阴性对照为染色阴性时,实验结果成立待检样本的 3个重复切片或触片中至少一个出现染色阳性时,即判该样本为csFV阳性;否则,判为阴性 6.2免疫过氧化物酶试验(IPT) 6.2.1概述本方法原理与FAT相似,但抗体标记物为HRP,根据标记的抗体不同,可分为直接法和间接法在普通光学显微镜下可观察结果，且细胞板或组织切片能长期保存、反复观察 6.2.2器材器材包括倒置光学显微镜和其他器材(按6.1.2.26.1.2.5执行).
GB/T16551一2020 6.2.3试剂抗体直接法采用HRP标记的抗CSFV的单克隆或多克隆抗体,间接法采用抗CSFV的单克隆或多克隆抗体及相应的HRP标记二抗底物显色液见A.5 其他试剂按照6.1.3.1一6.1.3.4执行 6.2.4操作步骤 6.2.4.1操作步骤按照6.1.4.1执行 6.2.4.2染色方法,以下两种可任选其一直接法;滴加工作浓度的HRP标记的抗CSFV的单克隆或多克隆抗体,覆盖于样本表面,置 a 37C湿盒避光作用30min一40min,用PES缓冲液洗涤3次间接法;滴加工作浓度的抗cSFV的单克隆或多克隆抗体,覆盖于样本表面,置37C湿盒作用 b lh后,用PBs缓冲液洗涤3次,再加人工作浓度的HRP标记二抗,置37C湿盒避光作用 30min40min,用PBS缓冲液洗涤3次 6.2.4.3组织样本表面滴加适量底物显色液,室温反应,待出现红褐色显色时,弃去底物显色液,用蒸憎水漂洗,终止显色反应 6.2.4.4将组织切片放置室温干燥5min,于组织样本表面滴加适量缓冲甘油,用盖玻片覆盖样本;细胞培养物表面滴加适量PBS缓冲液样本直接置于普通光学显微镜下观察 6.2.4.5实验成立条件和结果判定:当细胞浆中出现红褐色着染时,判为染色阳性;细胞胞浆无着染,判为染色阴性当阳性对照为染色阳性,阴性对照为染色阴性时,实验结果成立待检样本的3个重复中至少个出现染色阳性时,即判该样本为CSFV阳性;否则,判为阴性 6.3猪瘟病毒分离与鉴定 6.3.1 器材 6.3.1.125cm'细胞培养瓶 6.3.1.224孔细胞培养板 6.3.1.3细胞计数器 6.3.1.4微量移液器(200L.1000L) 6.3.1.5一次性针式滤器(0.45m,0,224m) 6.3.1.6二氧化碳温箱 6.3.1.7倒置荧光显微镜(FAT染色)或普通光学显微镜(IPT染色) 6.3.2试剂胰酶,见A.6 6.3.2.1 6.3.2.2PBS缓冲液,见A..3 6.3.2.3MEM培养液 6.3.2.4双抗储液(100倍),见A.1 6.3.2.5细胞生长液,见A.7 6.3.2.6病毒维持液,见A.8 6.3.2.7 固定液,见A.9 6.3.2.8抗体稀释液,见A.10.
GB/T16551一2020 6.3.29阳性对照猪瘟兔化弱毒疫苗C株细胞毒,病毒滴度为10“TCID/0.1ml 6.3.2.10阴性对照;PK-15细胞培养上清 PK-15细胞,或对病毒敏感性不低于PK-15细胞的猪肾和猪睾丸传代细胞系 6.3.2.11 6.3.2.122%NaOH消毒液,见A.11 6.3.3操作步骤 6.3.3.1细胞的制备:分离病毒前24h36h制备细胞用胰酶消化处于对数生长期的PK-15细胞单层,将所得细胞悬液以1500r/min离心5min,并用细胞生长液将细胞重悬，细胞计数器计数,调整细胞浓度至2×10个/mL,备用;也可取适量细胞悬液加人细胞培养瓶或24孔细胞培养板制备细胞单层,待细胞长至60%一70%铺满孔底时备用 6.3.3.2待检样本的准备:取5.5.2和5.5.3中制备的组织悬液或全血,用0.45m一次性针式滤器过滤,收集滤出液备用 6.3.3.3病毒接种和培养以下2种接种方式可选其同步接种;取9份细胞悬液(见6.3.3.1)和1份待检样本(见6.3.3.2)进行混合,取5mL混合液 a 加人细胞培养瓶中,同时接种24孔细胞培养板2孔,每孔0.5mL;24孔细胞培养板上同时接种猪痛兔化弱毒疫苗C株细胞毒作为阳性对照(9份细胞悬液和1份细胞毒)2孔和阴性对照 (9份细胞悬液和1份PK-15细胞培养上清)2孔,每孔0.5mL 操作时一定要避免交叉污染 .氧化碳温箱中培养72h 当接种完背检样本后,做好标记,置于37C含5% b 单层细胞接种待6.3 3.3.1中的细胞长至 60 70%细胞单层后,弃去细胞培养上清,按细胞培养液1/10体积加人处理后的待检样本(见于细胞培养瓶和24孔细胞培养板中 24孔细胞培养板中同时接种0.2mL 置于37C含5%二氧化碳温箱中吸附1h,期间每隔15min晃动一次细胞瓶/板,使液体全部浸润细胞,防止细胞过分干燥死亡吸出孔中液体,弃于2%NaOH溶液中进行灭活,用无l 清MEM培养液漂洗瓶/板中细胞3次加人适量细胞维持液于细胞培养瓶或细胞培养板中例如;25cm细胞培养瓶加人5mL维持液,24孔细胞培养板加人维持液0.5mL1lmL);37C含5%二氧化碳温箱中放置72h 6.3.3.4检测和结果判定病毒接种后72h,取出细胞培养板,吸出孔中液体于2%NaOH溶液中灭活用PBS漂洗3次,置通风橱下干燥5min,用一20C预冷的固定液固定30min以上弃去孔中固定液,Ps缓冲液漂洗3次可采用6.1或6.2的方法进行检验和结果判定 6.3.3.5病毒传代及扩大培养如需对病毒阳性样本进行扩大培养,取出接种样本的细胞瓶反复冻融 3次后收集瓶中液体,5000g离心5min,收集上清,即为F1代病毒细胞培养物;重复6.3.3.3~6.3.3.5 共2次,进行扩大培养,获得第3代阳性培养物,冻存备用根据需要对获得的阳性培养物进行病毒滴度测定(见附录B)或基因分型等研究如对检测结果有疑问可按上述方法盲传2代并进行检测 6.4猪瘟病毒T-nCR检测方法猪瘟病毒RT-nPCR检测方法按照GB/T36875执行 6.5猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法猪瘟病毒实时荧光RTPCR检测方法按照GB/T27540执行实验室抗体检测方法 7.1猪瘟病毒中和试验根据抗体标记物的不同,猪瘟病毒中和实验可分为NIF和NPLA
GB/T16551一2020 7.1.1免疫荧光中和试验(NIF) 7.1.1.1 器材 7.1.1.1.1单道微量移液器(20AL,200AL) 多道移液器(200AL). 96孔细胞培养板无菌移液器吸头(200AL) 无菌离心管生物安全柜水浴锅 7.1.1.1.8二氧化碳温箱 7.1.1.1.9倒置荧光显微镜 7.1.1.2试剂 7.1.1.2.1MEM培养液 7.1.1.2.2病毒维持液,见A.8 CSFV抗体阳性血清 CSFV抗体阴性血清 PK-15细胞 7.1.1.2.6猪癌兔化弱毒疫苗C株细胞毒 7.1.1.2.7固定液,见A.9 7.1.1.2.8PBS缓冲液,见A.3 7.1.1.2.9抗体稀释液,见A.10 7.1.1.2.10抗体,见6.1.3.5 7.1.1.3检验步骤 7.1.1.3.1细胞的准备:用96孔细胞培养板培养PK-15细胞,待细胞铺满孔底60%一70%时,备用 7.1.1.3.2血清的灭活;用移液器吸取100L待检血清,CSFV抗体阳性和阴性对照血清,分装于无菌离心管中,一份血清换一个移液器吸头将分装后的待检血清和对照血清置于56C水浴锅中灭活 30 min 7.1.1.3.3病毒的稀释;在血清灭活期间,取适量已知毒价的猪瘟兔化弱毒疫苗细胞毒猪瘟病毒 TCI测定见附录B),用含1%双抗的无血清MEM培养液将病毒稀释至200TCID.n/0.1mL 7.1.1.3.4血清与病毒的中和取1块96孔细胞培养板(记为板I,每孔加人含1%双抗的无血清 MEM培养液8Ol 将7.1.l.3.2灭话后的得检血清和对照血清按顺序加人上述培养液巾,每孔 20AL,每份血清做2个重复此时,待检/对照血清均被稀释5倍血清稀释后,向板I中每孔加人 00L7.1.1.3.3中的病毒液,此时血清的最终稀释倍数为10倍将板I置于37C含5%二氧化碳温箱中孵育1h 孵育结束后,将7.1.1.3.1中制备的PK-15细胞板(记为板),用多道移液器吸净上清,然后 7.1.1.3.5 迅速加人板I中对应孔中的血清-病毒混合液,每孔100L 注，进行此步骤操作时,以两列为单位进行操作,例如;先用多道移液器吸净板l中l列2列细胞培养液,然后迅速从板I中吸取1列、2列孔中液体加人板I的对应孔中 7.1.1.3.6将板I置于37C含5%二氧化碳温箱中孵育1h 7.1.1.3.7取出板I,每孔加人维持液100L,37C含5%二氧化碳温箱中孵育72h
GB/T16551一2020 7.1.1.3.8取出板I,弃去孔中液体,用PEBS缓冲液漂洗三次,在吸水滤纸上轻拍后,置于通风橱下干燥 5min 每孔加人-20C预冷的固定液100AL,-20C放置30min以上 7.1.1.3.9细胞染色弃去孔中固定液,PBS缓冲液漂洗3次可采用直接法或间接法进行细胞染色: 直接法;用抗体稀释液将FITC标记的CSFV单克隆/多克隆抗体稀释至工作浓度,每孔加人 a 50AL,37避光反应1h,直接进人7.1.1.3.10. 间接法;将CSFV多克隆/单克隆抗体用稀释液稀释至工作浓度向板I中加人稀释后的抗 b 体,每孔加人50AL,37C反应1h 取出板I,弃去孔中液体用PBS缓冲液漂洗3次将 FITC标记的二抗用抗体稀释液稀释至工作浓度,加人到板各孔中,每孔50aL.37C避光反应30min一45min 7.1.1.3.10取出板I,弃去孔中液体用PEBS缓冲液漂洗3次 7.1.1.3.11将板】置于荧光倒置显微镜下观察 7.1.1.4实验成立条件和结果判定当细胞胞浆中出现亮绿色荧光时,判为染色阳性;细胞胞浆无着染,判为染色阴性 CsSFV抗体阳性对照血清均为染色阴性,阴性对照血清均为染色阳性时,实验成立血清的2个重复孔中,2孔均为染色阳性,则该血清判为csFV抗体阴性;若2孔均为染包阴性,则该血清判为CSFV抗体阳性;若2孔中1孔为染色阳性、1孔为染色阴性,则该血清判为可疑,应重复检测,若仍为疑似结果,则判为CSFV抗体阴性 7.1.2过氧化物酶联中和试验(NPLA 7.1.2.1器材器材包括倒置光学显微镜、其他器材其他器材按照7.1.1.1.17.1.1.1.8执行 7.1.2.2试剂抗体按6.2.3执行底物显色液,见A.5 其他试剂按照7.1.1.2.1一7.1.1.2.9执行 7.1.2.3检验步骤 7.1.2.3.1检验步骤按7.1.1.3.1一7.1.1.3.8执行 7.1.2.3.2细胞染色可采用直接法或间接法进行细胞染色直接法;用抗体稀释液将HRP标记的cSFV单克隆/多克隆抗体稀释至工作浓度,每孔加人 a 50l,37避光反应1h 间接法;将csFV多克隆/单克隆抗体用稀释液稀释至工作浓度向板I中加人稀释后的抗 b 取出板I,弃去孔中液体用PBs缓冲液漂洗3次体,每孔加人50AL,37C反应1h 将 HRP标记的二抗用抗体稀释液稀释至工作浓度,加人到板各孔中,每孔50L,37丫避光反应30min45min 7.1.2.3.3取出板I,弃去孔中液体用PBS缓冲液漂洗3次 7.1.2.3.4向各孔中滴加底物显色液50AL,待阴性血清对照孔细胞出现红褐色显色时,弃去孔中液体加人蒸僧水漂洗两次,终止反应 7.1.2.3.5将板I置于倒置光学显微镜下观察
GB/T16551一2020 7.1.2.4实验成立条件及结果判定当细胞胞浆中出现红褐色着染时,判为染色阳性;细胞胞浆无着染,判为染色阴性 CSFV抗体阳性对照血清均为染色阴性,抗体阴性对照血清均为染色阳性时,实验成立血清的2个重复孔中,2孔均为染色阳性,则该血清判为CSFV抗体阴性;若2孔均为染色阴性,则该血清判为CSFV抗体阳性;若2孔中1孔为染色阳性、1孔为染色阴性,则该血清判为可疑,应重复检测,若仍为疑似结果,则判为CSFV抗体阴性 7.2猪瘟病毒阻断:LISA抗体检测方法猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测方法按照GB/T34729一2017执行 7.3猪瘟抗体间接ELISA检测方法猪瘟抗体间接LIsA检测方法按照GB/T35906执行 7.4猪瘟病毒化学发光抗体检测方法 7.4.1 器材和设备 7.4.1.137C温箱 7.4.1.2化学发光仪 7.4.1.3微量移液器(200"l、1000ML). 7.4.1.4多道移液器(200AL). 7.4.1.5移液器吸头 7.4.1.6化学发光板 7.4.1.7血清稀释板 7.4.2试剂 7.4.2.1CSFVE2蛋白:见GB/T34729-2017中附录A,或采用等效抗原 7.4.2.2酶结合物;见GB/34729一2017的附录B 7.4.2.3校准品;见附录C 7.4.2.4包被液;见A.12 7.4.2.5封闭液;见A.13 7.4.2.6洗涤液;见A.14 7.4.2.7发光底物A;见A.15 7.4.2.8发光底物B;见A.16 7.4.2.9商品化试剂盒;可选择商品化试剂盒 7.4.3检测步骤 7.4.3.1 包被;将CSFVE2蛋白用包被液稀释至0.14g/ml,按100l每孔加人到化学发光板中 37C包被3h 包被结束后,弃去孔中液体,每孔加人洗涤液300AL.洗涤2次 7.4.3.2封闭:每孔加人新鲜配制的封闭液300"L,37C封闭2h 封闭结束后,弃去孔中液体,37C 湿度<40%环境下干燥3h 放人干燥剂,密封包装,置2C8C保存 7.4.3.3样本稀释和加样;每次实验需设置系列校准品6孔首先在血清稀释板上依次加人校准品1校样品6(见附录C)各60AL,其余各孔依次加人待检样本各60L,再向以上各孔均加人60AL酶结合
GB/T16551一2020 物,震荡混匀;每孔吸取100AL转移至包被E2蛋白的化学发光板对应孔内 37C温箱中反应301 min 吸取不同血清时需要更换吸头 7.4.3.4洗涤:弃去孔中液体,每孔加人300AL洗涤液,室温放置3min,洗涤5次,甩干洗涤液或用自动洗板机洗板5次 7.4.3.5加底物和显色;每孔加人50AL.化学发光底物A和50lL的化学发光底物B,振荡混匀也可将化学发光底物A,B等比例混匀后取100L加人到各孔在18C26C条件下避光静置5 min 7.4.3.6化学发光仪读取发光值 7.4.3.7绘制校准曲线;以校准品发光值为纵坐标,对应的NCU为横坐标,绘制校准品的四参数拟合曲线,将样本的发光值代人校准曲线计算,即可得出样本中CSFV抗体的含量(NCU/mL) 7.4.3.8结果判定:如果样本中抗体含量<20NCU/ml,样本应判定为阴性;如果样本中抗体含量> 20NCU/mL,则判定为阳性综合判定 8 8.1 临床症状与病理变化判定为典型的疑似猪病料按6.】或6.忽检测为csrV抗原阳性,或按6.3分离出csFV,或按6.4和6.5检测出csFV核酸,同时与流行病学史相符合,均可判定为csF阳性 8.2临床症状与病理变化无明显特征的疑似猪的病料,按6.1或6.2检测为CSFv抗原阳性,或按 6.3分离出CsFV(一般需盲传培养),或按6.4和6.5检测出CsFV核酸,同时与流行病学史相符合,均可判定为CSF阳性 8.3若临床症状与病理变化的诊断结果与6.1或6.2,或与6.4和6.5不符合,按6.3分离出csFv,可判定为cSF阳性 8.4从未暴发过CSF的场(地区),临床症状与病理变化判定为典型的疑似猪的病料,至少需要6.1一6.3 中两种方法诊断为阳性,或6.4或6.5诊断为阳性,才可判定为CSF阳性 8.5若待检病料按第6章检测为CSFV抗原阳性,需判断是否为csFV野毒感染或疫苗免疫所致如待检病料采自50d内未免疫过猪瘟疫苗的动物,可判定为野毒感染;若50d内免疫过猪瘟疫苗,应采用 6.4方法对阳性病料进行核酸扩增,并对目的片段进行测序,与猪瘟病毒免化弱毒疫苗株进行序列比对,确定基因亚型,最终鉴别诊断 8.6临床症状与病理变化无明显特征的未免疫且无母源猪瘟抗体的动物,按7.1、7.2、7.3或7.4任一项检测出cSF抗体的,可判定该动物曾经或正在感染CsFV 8.7进行免疫效果评估时,可在免疫后约21d进行抗体检测可采用7.1、7.2、7.3或7.4任一项进行 CSF抗体检测,检测结果为阳性的,判定为疫苗免疫合格 0
GB/T16551一2020 附录 A 规范性附录) 试剂配制 A.1双抗储液(100倍 10”IU 青霉素链霉索 1g 100mL 无菌蒸僧水无菌定量分装,于一20C保存 A.275%酒精 75mL 无水乙醉(分析纯无菌蒸水 25mL 室温保存 A.3PBS缓冲液氯化钠 8g 0.2g" 氯化钾磷酸氢二钠 .42g 磷酸二氢钾 0,27 g 加去离子水800ml.,充分溶解后,用浓盐酸将pH值调节至7.4,去离子水定容至1000ml 高压灭菌15min(121C士2C),室温保存 A.4缓冲甘油 0.68 无水碳酸钠碳酸氢钠 3.7g 加100ml蒸馏水或去离子水,充分溶解,调节pH值至9.09.3,与等量甘油(分析纯)充分混合即可 A.5底物显色液 50 3,3-二氨基苯联胺 mg Tris-HCl缓冲液(0.01mol/L,pH值7.6 100ml 充分溶解,加人30%双氧水10aL一30aL,现用现配也可采用等效的商品化显色试剂盒 11
GB/T16551?2020 A.6? 0.25g ???,Trypsin) 100mL ?PBS? ?PEs?,4C????,0.22m???,-20C 档???Ч?? ?? MEM 475mL FBS 25mL ?? 1ml 28C档 A.8?? MEM 490mL FBS 10ml ?? 1mlL 2C?8C档 A.9?? ?() 50mL ?( 50mml -20C档 A.10?? ? 2mL PBS? 98 ml A.112%NaOH NaOH 20g 1000ml. ? ?,±档 A.12? 1.59 ? g 2.3x ? 12
GB/T16551一2020 800mL 蒸水搅拌溶解,调节pH值至9.6,再加燕水定容至1000ml A.13封闭液 10 酪蛋白 g 50 蔗糖 g PROCIIN-300 500AL. 0.5mL 吐温-20 蒸榴水定容至1000ml A.14洗涤液 5.0g 十二水合磷酸氢二钠二水合磷酸二氢钠 70.0g 氯化钠 170.0g 吐温-20 16.0ml 加去离子水至800mL,调pH值至7.4一7.6,定容至100ml 高压灭菌15min(121C士2C) 室温保存使用时.将20×浓缩洗液用蒸水或去离子水按1:19的比例混合即可 A.15发光底物A 过氧化脉 1.0g 碳酸盐缓冲液(o.05mol/L,pH值9.6) 1000mL A.16发光底物B 溶液A: 鲁米诺 0.lg 0.1mol/儿氢氧化钠 10ml 溶液B: 碘苯盼 3.0g 无水乙醇醉 1ml 游液A和溶液B混合用0.05ml几碳酸盐缓冲液稀释至100ml 13
GB/T16551一2020 附录 B 规范性附录) 猪瘟病毒ICD.测定 B.1细胞的准备预先24h一36h制备细胞,分散于96孔细胞培养板中进行培养,待细胞长至60%~70%铺满孔底时,进行下列操作 B.2病毒的稀释待检病毒液的稀释;取8个1.5ml无菌离心管(分别标记为1井8井,对应的稀释度为10-1 10-),向无菌离心管中加人MEM培养液,每管900AL 吸取待测病毒原液100L,加人1井管中,小心地反复吹打混匀,换吸头,从1井管中吸取100L液体,加人2井管中,小心地反复吹打混匀,换吸头、从2井管中吸取100L液体,加到3#管中,依次类推,至8井管阳性对照的稀释;取已知病毒滴度的猪瘟病毒C株细胞毒,取适量体积的病毒原液,用MEM培养液将病毒液稀释至200TCIDm/100MlL B.3病毒的接种将B.2中稀释后的病毒接种到B.1中的细胞板中每个稀释度的病毒液接种8孔细胞取出细胞板,用多道微量移液器吸第1列孔中液体,用200AL微量移液器立即加人1井管中病毒稀释液,每孔 00AL;用多道微量移液器吸净第2列孔中液体,更换吸头,用200L微量移液器立即加人2井管中病毒稀释液,每孔100AL;依次类推,至第8列阳性对照加至第9列,第10列为无病毒的空白对照 37含5%二氧化碳温箱放置1h 取出细胞板,弃去孔中液体,用PBS缓冲液漂洗3次,置通风橱下干燥5min n,用一20C预冷的固定液固定30min以上 B.4结果判定采用FAT(见6.1)或IPT(见6.2)进行染色和判定病毒含量计算 B.5 记录不同稀释度阳性细胞孔数与阴性细胞孔数,按照ReedMueneh氏法计算病毒TCIDa 14
GB/T16551一2020 录附 C 规范性附录校准品的制备 C.1材料标准阳性血清:cSF抗体阳性血清,CSFV中和抗体效价为1:10000. 标准阴性血清:CSF抗体阴性血清,CSF中和抗体效价为阴性校准品稀释液;磷酸氢二钠2.9g,磷酸二氢钾0.2g、氧化钠8g、氧化钾0.2g,加人800mL双蒸水搅拌溶解,再称取牛血清白蛋白10g加人,量取PROCLIN-300500AL吐温-201mL加人,而后加双蒸水定容至1000mL,过滤除菌,2C8C保存 C.2 校准品的制备 C.2.1标准阳性血清采用标准阳性血清,因此将该血清赋值为10000NCcU/mL 1NCU/ml含义是:以建立相应标准品时期的有代表性的国内外特定试剂检测的Cutof均值为1NCU/mL,换句话说就是使用国际上公认的一流公司的试剂盒检出原血清中某物质的最低含量称为1NCU/ml C.2.2校准品的制备校准品1的制备;用校准品稀释液将标准阴性血清按1:20比例进行稀释,无菌定量分装,2笔8C 保存校准品2校准品6的制备;用校准品稀释液将标准阳性血清稀释到10NCU/ml,20NCU/mL 40NCU/ml100NCU/ml和200NCU/ml,分别无菌定量分装,2笔8C保存

猪瘟诊断技术GB/T16551-2020

猪瘟是一种由病毒引起的猪类传染病，它在全球范围内都有发生。为了及时准确地诊断和控制猪瘟，国家标准化管理委员会制定了GB/T16551-2020《猪瘟诊断技术》。

该标准规定了猪瘟诊断的方法、试剂、设备、标准品、质控等方面的内容，并对各种诊断方法的优缺点进行了评估和比较。

猪瘟诊断方法

标准规定了常规诊断方法、分子生物学诊断方法、免疫学诊断方法以及其他诊断方法等多种猪瘟诊断方法。其中，常规诊断方法包括临床诊断、病理学检查、血清学检查等，是猪瘟诊断的基础。分子生物学诊断方法和免疫学诊断方法则是近年来快速、灵敏、特异性高的新技术，在猪瘟诊断中得到了广泛应用。

猪瘟试剂与设备

标准规定了猪瘟诊断所需的试剂和设备，包括常规试剂、分子生物学试剂、免疫学试剂以及其他专用试剂等。这些试剂和设备在猪瘟诊断中具有重要作用，可以提高诊断的准确性和效率。

猪瘟标准品与质控

标准规定了猪瘟标准品和质控体系建立的要求，保证了猪瘟诊断结果的可靠性和可比性。同时，还对猪瘟诊断质量管理进行了详细的说明，为猪瘟诊断实验室提供了指导和参考。

总之，GB/T16551-2020《猪瘟诊断技术》是一项非常重要的标准，对于规范猪瘟诊断工作、保障猪业生产安全具有重要意义，推广和应用该标准将对我国猪业的发展起到积极的促进作用。