GB/T29397-2012
香蕉枯萎病菌4号小种检疫检测与鉴定
DetectionandidentificationforFusariumoxysporumf.sp.Cubense(E.F.Smith)Snyder&HansenRace4
- 中国标准分类号（CCS）B16
- 国际标准分类号（ICS）65.020.01
- 实施日期2013-06-01
- 文件格式PDF
- 文本页数9页
- 文件大小854.56KB
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香蕉枯萎病菌4号小种检疫检测与鉴定
国家标准 GB/T29397一2012 香蕉枯萎病菌4号小种检疫检测与鉴定 DetectionandidentifieationofFsariumoxysporum" f.sp.CubenseE.F.Smith)Syder&HansenRace4 2012-12-31发布 2013-06-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T29397一2012 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草
本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口
本标准起草单位;全国农业技术推广服务中心、广东省植物检疫站、华南农业大学
本标准主要起草人:王玉玺、王琳、吴立峰、姜子德、李敏慧、任小平、李小妮、吴仕豪
GB/T29397一2012 香蕉枯萎病菌4号小种检疫检测与鉴定 范围 本标准规定了香蕉枯萎病菌4号小种[Fus f.sp.Cubense(E.F.Smith)Snyder&. usariumo.rysporumnt.sp.6 HansenRace4]的现场检验和实验室检测鉴定以香蕉枯萎病菌4号小种的为害症状,病原菌形态,致病 性测定结果、Komada改良培养基上的菌落性状和寄主范围为依据,明确了现场查验、实验室鉴定、菌种 保存的方法
本标准适用于香蕉(包括香蕉,大蕉、粉蕉等香蕉枯萎病菌4号小种易感品种)生长期间的香蕉枯萎 病菌4号小种的检测
原理 根据香蕉枯萎病菌4号小种的为害症状,取病健部交界组织分离培养病原菌,根据病原菌形态,致 病性测定结果、疑似病菌在Komada改良培养基上的菌落性状进行判定 仪器、用具及药品 3.1仪器、用具 仪器;超净工作台、培养箱、光学显微镜、高压灭菌、照相机等
用具;铲,枝剪,砍刀,纸袋,油性笔,记录本、标签纸、小刀片,培养皿,载玻片、盖玻片、铅子,挑针,酒 精灯等 3.2药品 0.1%升汞、70%乙醉,无水乙醉,灭菌水,去离子水、40%甘油、磷酸氢二钾,氯化钾、7水硫酸镁、乙 二胺四乙酸铁钠,L-天门冬酷胺、半乳糖、琼脂粉、75%五氯硝苯可湿性粉剂、牛胆粉、碉砂,硫酸链霉素、 10%磷酸等
现场查验 4.1现场调查 调查范围 香蕉种植地及香蕉试管苗二级苗生产和销售场地
4.1.2调查方法 对香蕉枯萎病菌4号小种的寄主植物进行踏查,观察其生长状况;向香蕉种植者和管理人员询问 确定疑似香蕉枯萎病菌4号小种为害的田块,对疑似田块进行现场检验
4.1.3症状识别 对地上部表现症状的植株,剖开其根部和假茎部维管束组织,观察是否发生颜色变化
GB/T29397一2012 对地上部无明显症状的植株,随机抽取部分植株,观察其根部及假茎部位维管束组织是否发生颜色 变化 症状表现参见附录A
4.2样本的采集 采样前需对取样现场及病害症状拍照
疑似病株的取样应选取症状典型、中等发病程度的植株,取样部位包括焦头病健部交界组织 (8cmX8cnm)、根、假茎(长20em),叶柄;对二级苗应取整个植株,所有样品采用坚韧纸质材料包裹,切 勿采用塑料薄膜包裹
样品应附上采集时间、地点、品种的记录和田间照片
采样后填写附录B 实验室检测鉴定 5.1病原菌的分离与培养 取病健部交界组织,切成小块(2mm×3mm),将小块组织先放于70%乙醇溶液中浸5s、再转人 0.1%升汞溶液中浸泡1min一2min进行消毒处理,然后用灭菌水漂洗3次;将消毒处理和漂洗后的小 块组织置于PDA或PsA平板上恒温(25C)培养,菌落白色絮状,基质淡紫或淡紫红色;培养5d7d 可产生大量小型分生抱子,培养10d~15d可产生少量大型分生抱子,培养30d后有厚垣抱子形成
结果符合附录A形态描述的,可继续按5.2的方法进行病原菌致病性测定
病原菌致病性测定 采用伤根浸菌接种法
将4一5叶期健康组培香蕉苗巴西蕉或广东香蕉2号)自沙床中拔出,然后 用缓慢流出的自来水冲洗根部以去除附在其根上的沙子,再分别浸在配制好的各分离菌株抱子悬浮液 中(抱子浓度不低于1×10个/mL),以清水做对照,30min后移栽到盛有灭菌细沙的营养杯,置于温室 (2532C),15d~20d后观察结果
罹病蕉苗如表现出附录A的症状
对病株进行组织分离,应 得到与原接种菌相同培养性状和形态特征的病原菌
按照柯赫氏法则,可初步确定该病原菌为尖抱镰 刀菌古巴专化型4号小种
5.3在Komada改良培养基上的菌落性状 5.3.1Komada改良培养基的配制 融化900mL基本培养基[磷酸氢二钾,1g;氯化钾,0.5g;硫酸镁,0.5g;乙二胺四乙酸铁钠， g;L天门冬酰胶2起;半乳糖.10g;琼脂粉.16迟;去离子水定容至900mL高压灭菌]在无菌操 0.01 作下与100mL的盐溶液(5%五叙硝辈可湿性粉剂,0.9g;牛胆粉,0.45g;砌砂,0.5g;碗酸链霉素 3g;用10%磷酸调pH值到3.8士0.2)混合,倒平板
0.3 5.3.2Komada改良培养基上菌落特征 将经5
1测定的疑似病菌的单袍分离菌株接于Komada改良培养基平板上,25C,40w普通日光 灯相距约30cm照射下培养10d后观察菌落性状,4号小种的菌落边缘为裂齿状,而1号小种及其他的
GB/T29397一2012 镰刀菌的菌落边缘则平滑,如图1
图11号和4号小种在Komada改良培养基上的菌落形态(左图为4号小种,右图为1号小种
) 结果判定 根据病原菌的形态学,致病性测定,及疑似病菌在Komada改良培养基上菌落边缘出现齿状的特 征,按照柯赫氏法则可确定该病原菌为尖抱镰刀菌古巴专化型4号小种
将实验室检测鉴定结果填人《植物有害生物样本鉴定报告>(见附录C)
菌种的保存 对判定为香蕉枯萎病菌4号小种的菌株进行标注,包括菌株来源,寄主的品系、采集时间、采集人和 鉴定人,并将菌株移至40%甘油管保存在一80C冰箱;或将菌株培养在试管斜面上,长满后存于4 冰箱
GB/T29397一2012 附 录A 资料性附录 香蕉枯萎病菌基本信息 A.1分类 & 香蕉枯萎病菌Fusariwmorysorunf.sp.Cuense(E.F.Smith)Snyder Hansen隶属半知菌门 Deuteromycotina,丝抱纲Hyphomycetes,瘤座菌目Tubereulariales,镰刀菌属Fusarium,尖抱镰刀菌 古巴专化型Fusariumorysoriwmf.sp.Cubense
至今共发现有4个生理小种,其中4号小种是1967 年首先在我国台湾省报道的一个小种,能侵染“大蜜啥”,矮香蕉DwarlCavendish(AAA,台湾拉屯旦 人" TaiwanLatundan(AAB)、PisangLilinAA、棱香蕉和野蕉(BB),尤其能侵染较抗病的香牙蕉 Cavendish(AAA),毁灭性最大
A.2为害症状 A.2.1外部症状 该病菌侵染香蕉根系和球茎,堵塞输导组织,使罹病植株表现黄叶症状
植株感病早期无明显外部 症状,染病一段时间后,病害先从下部较老的叶片开始发生,发病初期叶片边缘变黄并逐渐扩展至主脉
病叶叶柄在靠近叶鞘处容易折曲、下垂,后期病叶凋萎后倒挂在假茎旁,直至全株枯死;有时假茎基部开 裂
若是假植的组培苗染病,其叶片褪绿,无光泽,呈黄绿色或局部甚至整叶黄化;严重时整个假茎全部 变为褐色,部分根变褐腐烂
A.2.2内部症状 横切罹病香蕉植株的球茎部,可见维管束组织变成红褐色或暗褐色
纵剖病株球茎,可看到红褐色 至暗褐色病变的维管束成线条状,近茎基部颜色深,病变一直延伸到球茎部,根系变黑褐色而干枯
若 为假植组培苗,纵剖摧病小苗的假茎则可见褐色至红褐色的坏死斑点
A.3病原菌形态引自NelsonP.E，elal，1983 香蕉枯萎病菌可产生3种形态的无性分生抱子 -大抱子,小袍子,厚垣袍子
大抱子镰刀形或纺 锤形,具3一5个隔膜，顶端细胞呈尖刀状或钩状，脚细胞明显，壁淋,22um36 m)× (4m一5m);小抱子生于瓶梗状的产抱细胞上圆形或椭圆形至肾形,具0一1个隔膜，壁薄 (5m一74m)x(2.54m一3m).在人工培养基上很容易见到
厚垣袍子圆形,壁厚,间生或顶生于 菌丝上,多单生,9um×7am,可在土壤中存活达3年一5年(见图A.1)
至今未发现有性态
GB/T29397?2012 ?A.1?????(PoetzRC2005a)
GB/T29397一2012 附 录 B 规范性附录 香蕉枯萎病菌4号小种调查取样记录表 表B.1香蕉枯萎病菌4号小种调查取样记录表 编号: 生产/经营者 地址及邮编 联系/负责人 联系电话 调查日期 抽样地点 样品 品种 调查代表株数或面积 植物名称(中文名和学名) 植物生育期 植物来源 编号 名称 症状描述 发生与防控情况及原因 抽样方法,部位和抽样比例 备注 抽样单位盖章). 生产/经营者 抽样人(签名 现场负责人 年 日 年 月 月 注:本表一式两份,抽样单位和受检单位各一份
GB/T29397一2012 附 录 c 规范性附录 植物有害生物样本鉴定报告 表c.1植物有害生物样本鉴定报告 编号: 植物名称 品种名称 样品数量 取样部位 植物生育期 样品来源 送检日期 送检人 送检单位 联系电话 检测鉴定方法 检测鉴定结果: 备注: 鉴定人签名): 审核人签名): 鉴定单位盖章 年 月 注:本单一式三份,检测单位、受检单位和检疫机构各一份
香蕉枯萎病菌4号小种检疫检测与鉴定GB/T29397-2012
香蕉是全球重要的水果作物之一。然而，香蕉枯萎病菌是一种常见的植物病原体，能够对香蕉产生严重危害。其中，4号小种被认为是最为致命的小种之一。
因此，为了防止香蕉枯萎病菌4号小种的传播，国家制定了GB/T29397-2012标准，要求对香蕉进行检疫检测和鉴定，以确保香蕉的安全性。
检疫检测
检疫检测是指通过对进口或出口的香蕉进行检验，验证其是否受到香蕉枯萎病菌4号小种的污染。
GB/T29397-2012标准规定，应使用PCR等分子生物学方法对样品进行检测。具体操作流程如下：
- 取香蕉表皮或叶片等组织样本。
- 提取样本DNA。
- 使用PCR引物扩增特异性基因序列。
- 通过电泳等方法检测扩增产物。
如果扩增出目标基因序列，则说明该香蕉样品受到了香蕉枯萎病菌4号小种的污染。
鉴定
鉴定是指对从香蕉样品中分离出的病原体进行鉴定，确定其是否为香蕉枯萎病菌4号小种。
GB/T29397-2012标准规定，应使用鉴定标准菌株、生理生化试验以及分子生物学方法等手段对分离出的病原体进行鉴定。具体操作流程如下：
- 将分离出的病原体接种到鉴定标准菌株上，观察是否能够感染和致病。
- 进行生理生化试验，测定病原体的各项生物学特性。
- 使用PCR等分子生物学方法对病原体进行鉴定。
如果鉴定结果表明病原体为香蕉枯萎病菌4号小种，则说明该样品受到了严重污染。
结论
在GB/T29397-2012标准的指导下，我们可以有效地检测和鉴定香蕉中的枯萎病菌4号小种。这有助于保护香蕉产业以及消费者的健康安全。
