GB/T38792-2020
蛋白质致敏性细胞学评价技术规范
Technicalspecificationforcytologicalevaluationofproteinallergenicity
- 中国标准分类号（CCS）A21
- 国际标准分类号（ICS）07.080
- 实施日期2020-11-01
- 文件格式PDF
- 文本页数7页
- 文件大小483.22KB
以图片形式预览蛋白质致敏性细胞学评价技术规范
蛋白质致敏性细胞学评价技术规范
国家标准 GB/T38792一2020 蛋白质致敏性细胞学评价技术规范 Ieehniealspeeifieationforeytologiealevaluationofproteinallergenieity 2020-04-28发布 2020-11-01实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标涯花管理委员会国家标准
GB/38792一2020 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草
本标准由标准化研究院提出并归口 本标准起草单位:标准化研究院、江南大学,北京萨姆伯科技有限公司、石家庄君乐宝乳业有限 公司
本标准主要起草人;马爱进、吴晓玲、行传来、国华、袁爱梦、刘丽强、马伟,徐丽广、王忠兴、郝帅、 柴艳兵、张耀广
GB/38792一2020 蛋白质致敏性细胞学评价技术规范 范围 本标准规定了蛋白质致敏性细胞学评价要求、证实方法
本标准适用于由免疫球蛋白E(IgE)介导的食品蛋白质致敏性的细胞学评价
规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的
凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件
凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件
3.1 蛋白质致敏性protein 1allergenieity 由蛋白质诱发机体发生过敏反应的特性
注:本标准中的蛋白质致敏性特指由嗜碱性粒细胞(RBL--2H3)表面结合的IgE与蛋白质相互作用后导致子-氨基己 糖苷酶释放的程度
要求 4.1按照相关法律法规和标准要求对样品进行接收、保管,交接、配制、回收、退还/销毁处理,并制定相 应的管理制度和程序
4.2实验室应符合生物安全一级要求
细胞实验工作区一般要由准备室、缓冲间,无菌室、细胞保存室 组成
其中,缓冲间面积应不小于3m',并设有更衣柜和紫外灯,紫外灯的强度为不少于1.5w/m 紫外灯源距地面不应超过2.5m,每次照射时间为20min30min
无菌室无菌等级的最低标准应达 到万级
4.3评价使用的仪器与设备种类、数量、性能、量程、精度应能满足评价的需要
评价需要的器皿材料 应经过无菌处理,试验操作过程均为无菌操作
4.4实验用水应满足GB/T6682的要求,所使试剂使用前都需经无菌处理
4.5评价实验结束后,实验材料应进行无害化处理
4.6蛋白质致敏性评价结果以8-氨基已己糖苷酶最大释放率表示
4.7评价结果应表述出评价蛋白的名称、纯度、使用浓度、8氨基己糖苷酶最大释放率
GB/T38792一2020 5 证实方法 5.1p氨基己糖苷酶释放率测定 5.1.1样品前处理 5.1.1.1 固体样品 5.1.1.1.1植物性样品 将待测样品粉碎、450Am微孔滤膜过滤后,准确称取5.00g于聚丙烯离心管中,向离心管中加人 40mL水,充分振荡混匀
将离心管水平置于振荡器中,室温下100次/min,振荡12h,5000r/min离 心l0min,小心吸取上清液于另一个干净的聚丙烯离心管中,真空冷冻干燥,固体蛋白粉末可于2C 8C贮存,时间不超过24h 5.1.1.1.2动物性样品 将待测样品搅碎匀浆后,准确称取5.00g,置于漏斗中,加人50mL石油酥进行连续3次冲洗后,放 人烘箱中烘干
将烘干后的样品置于聚丙烯离心管中,向离心管中加人10ml15%三氯乙酸溶液(体 积分数),充分振荡混匀,静置10min
样品溶液5000!/min离心10mn,小心吸取上清液于另 一个干 净的聚丙烯离心管中,真空冷冻干燥,固体蛋白粉末可于2C8贮存,时间不超过24h 5.11.2液体或半液体样品 将 称取5.00g液体样品,置于漏斗中,加人50mL石油酥酷进行连续3次冲洗后,放人烘箱中烘干
烘干后的样品置于聚丙烯离心管中,加人40mL水,充分振荡混匀匀,将离心管水平置于振荡器中,室 温下100次/min,振荡过夜12h,5000r/min离心10nmin,小心吸取上清液于另一个干净的聚丙烯离 心管中,真空冷冻干燥,固体蛋白粉末可于2C8C贮存,时间不超过24h 5.1.2样品溶液制备 称取上述蛋白样品50.0mg,用PBS缓冲液(参见附录A)溶解并定容至50ml容量瓶中,配制成 质量浓度为1g/mL的储备溶液
试验时用Tyrode's液(参见附录A)稀释成一定浓度的工作液,现 用现配
5.1.3细胞培养 将RBL-2H3细胞参见附录A)置于细胞培养瓶中,加人10ml，的细胞培养液(参见附录A),于 37C,5%二氧化碳细胞培养箱中培养48h72h,倒置显微镜下观察细胞生长情况
当细胞生长至培 养瓶的80%一90%时,进行细胞计数和细胞接种
5.1.4细胞接种 将细胞培养液从细胞培养瓶内吸出,用PBS缓冲液洗细胞一次
向细胞培养瓶内加人2.0mL胰 蛋白酶溶液(参见附录A),于37C消化2min4min
在倒置显微镜下观察细胞消化情况,当细胞变 圆接近脱壁时,将胰蛋白酶溶液倒掉
加人10ml细胞培养液,用吸管吹打,使细胞脱壁制成细胞悬 37C,5% 液
吸取细胞悬液,以200AL/孔加到细胞培养板中,使细胞接种密度为1×10'细胞/m nl 二氧化碳细胞培养箱中培养24h使其贴壁
GB/38792一2020 5.1.5细胞活化 将细胞培养液从细胞培养板内吸出,用PBS缓冲液洗细胞三次
以200L/孔向细胞培养板内加 人含50"g/ml.lgE(参见附录A)的细胞培养液,37C,5%二氧化碳细胞培养箱中继续培养24h
5.1.6细胞与蛋白的激发作用 5.1.6.1样品组 将细胞培养液从细胞培养板内吸出,用PBS缓冲液洗细胞三次
分别以50!L/孔向细胞培养板内 反应结束后,放人冰 加人不同浓度的待测蛋白工作液,37C,5%二氧化碳细胞培养箱中反应45 min
水中终止反应
上述各项均设3个复孔 5.1.6.2全部释放组 将细胞培养液从细胞培养板内吸出,用PBS缓冲液洗细胞三次
以504Ll/孔向细胞培养板内加人 细胞裂解液(参见附录A),轻轻吹打使裂解液和RBL-2H3细胞充分接触4C反应45min后,吸取全 部细胞培养上消1200;/min离心百min.收集细胞上消液
上述设3个复孔
5.1.6.3空自对照组 将细胞培养液从细胞培养板内吸出,用PBS缓冲液洗细胞三次
以50L/孔向细胞培养板内加人 Tyrode's液,37C,5%二氧化碳细胞培养箱中反应45min
反应结束后,放人冰水中终止反应
上述 设3个复孔
5.1.7测定 吸取5.1.6中作用后的反应液,以30L/孔转移至新的细胞培养板中,以50AL/孔向细胞培养板内 加人PNP-NAG溶液(参见附录A),37C反应1h后,以200AL/孔加人碳酸钠终止液(参见附录A)终 止反应,用酶标仪在波长405nm处测各孔吸光度值
样品组的吸光度标记为Ai,空白对照组的吸光 度标记为A,全部释放组标记为Am 5.2队氨基己糖苷酶释放率结果计算 8氨基己糖苷酶释放率按式(1)计算: A1一Ao R ×100% Am一An 式中 8氨基已糖苷酶释放率; R 样品组的吸光度; A 空白对照组的吸光度 A0 全部释放组的吸光度 平行样的平均值为最终释放率值,计算结果保留到小数点后两位
GB/T38792一2020 附 录 A 资料性附录) 溶液配制 A.1 水 GB/T6682规定的二级水
A.20.01mol/L磷酸盐缓冲液(PSs缓冲液 称取7.90只氯化钠、1.44g磷酸氢二钠、1.80磷酸二氢钾,0.20g氯化钾,用980mL水溶解,用盐 酸调节pH至7.2,再加水定容至1000mL,0.22m微孔滤膜滤过除菌,4C保存备用或选用同类商品 化产品
A.30.001mol/L对硝基苯-N-乙酥-队-D氨基葡萄糖苷溶液(PNPNAG溶液 称取34.2mgPNPNAG,加水溶解并定容至100mL,0.22Mm微孔滤膜滤过除菌,4C保存备用
A.40.1mol/L碳酸钠终止液 称取1.06只碳酸钠,加水溶解并定容至100mL.0.22Mm微孔滤膜滤过除菌，4C保存备用
A.5台氏液(Iyrde's液) 称取7.90只氯化钠,0.20只氯化钾,0.26g七水硫酸镁,0.07只二水磷酸二氢钠、1.00只碳酸氢钠、 0.20g氯化钙和1.00g葡苟糖,用980ml水溶解,用盐酸调节pH至7.2,再加水定容至1000ml 0.224m微孔滤膜滤过除菌,4C保存备用或选用同类商品化产品
A.6细胞培养液 Eagle最低必需培养基(Eagle'、MinimalEssentialMedium,MEM),加人小牛血清和青霉素-链霉 素,配制成含体积分数为10%小牛血清、1%青霉素-链霉素的细胞培养液,其中青霉素和链霉素的终浓 度分别是100U/mL和1004g/mL
EMEM培养基可选用各种商品供应的粉末培养基,按生产厂商提 供资料配制并除菌,4C保存备用
细胞裂解液 商品化1%TritionX-100细胞裂解液,主要成分为50mmolTris-Hcl(pH7.2)、150mmol氧化钠 和5mmol乙二胺四乙酸、体积分数为1%曲拉通X-100
0.22"m微孔滤膜过滤除菌,4C保存备用
GB/38792?2020 A.8??? ?2.50g??(1:250),1000mlLPBS?(A.2),,0.22m?? ?,4汸????? ??(RBL-2H3? ?????,ATCCcCRL-2256?? A.10IgE?? ?,>95%,?>504g/ml,?????
蛋白质致敏性细胞学评价技术规范GB/T38792-2020解读
近年来，食品安全问题备受关注，其中蛋白质致敏性引起了广泛关注。而蛋白质致敏性细胞学评价技术，作为一种快速、可靠、经济的检测方法，已成为食品安全领域的热门话题。
为了推动蛋白质致敏性细胞学评价技术在我国的应用和发展，中国国家标准化管理委员会于2020年3月发布了《蛋白质致敏性细胞学评价技术规范GB/T38792-2020》。该规范主要针对蛋白质致敏性细胞学评价技术的实验室操作流程、数据处理和结果评价等方面进行了规范。
具体来说，该规范涉及以下几个方面：
1. 术语和定义
该部分主要对蛋白质致敏性细胞学评价技术中涉及到的相关术语进行了定义。这有助于不同实验室之间的交流和协作。
2. 实验室条件
该部分主要包括实验室场地、设备、试剂、人员培训等各方面的要求。实验室应当有足够的空间和设备，保证实验的可靠性和准确性。
3. 样品的选择和制备
该部分主要介绍如何选择样品并进行制备。样品的选择应当符合实验的要求，并且制备过程应当尽可能地避免对实验结果产生影响。
4. 细胞毒理学评价方法
该部分主要介绍细胞毒理学评价方法，包括细胞株的选用、细胞培养、细胞毒性的检测方法等。在这一部分，规范还指出了一些需要注意的问题，如细胞培养的时间、细胞密度等。
5. 致敏性评价方法
该部分主要介绍致敏性评价方法。在这一部分，规范详细描述了各种实验方法的操作流程和注意事项。同时，规范还提出了对于阳性对照物品和负性对照物品的要求。
6. 数据处理和结果评价
该部分主要介绍数据处理和结果评价的方法。规范指出，在进行数据处理和结果评价时应当考虑到样品的特点和实验的要求。
总之，《蛋白质致敏性细胞学评价技术规范GB/T38792-2020
的发布，为食品安全领域提供了一种快速、可靠、经济的检测方法。该规范的实施，将促进蛋白质致敏性细胞学评价技术在我国的应用和发展，进一步保障人们的食品安全。因此，对于从事食品安全相关工作的专业人士来说，掌握《蛋白质致敏性细胞学评价技术规范GB/T38792-2020》的内容及实施意义是非常必要的。只有不断地更新知识和技能，才能更好地履行自己的职责。
