燕麦花叶病毒检疫鉴定方法

国家标准 GB/T36778一2018 燕麦花叶病毒检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofOatmosaicvirus 2018-09-17发布 2019-04-01实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/36778一2018 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/Tc271)提出并归口 本标准起草单位:宁波出人境检验检疫局,浙江省农业科学院、北 京出人境检验检疫局、内蒙古出人境检验检疫局 本标准主要起草人:郭立新、段维军,梁新苗、杨永生、孙丽英、吴薇、荣德福
GB/36778一2018 燕麦花叶病毒检疫鉴定方法 范围 本标准规定了燕麦花叶病毒的血清学、分子生物学及免疫电镜检测与鉴定方法 本标准适用于燕麦属(Avea)植株,种子及种子中夹杂的土壤上的燕麦花叶病毒的检疫和鉴定 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 SN/T1840植物病毒免疫电镜检测方法 SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样方法 燕麦花叶病毒基本信息 学名:Oat 1oSicUr4s oatmosaicvirus 异名;Soilborne 缩写:OMV 分类地位，马铃薯Y病毒科(Piw/ywuiridae),大麦黄花叶病毒属(Bywoviruws). 燕麦花叶病毒的其他信息参见附录A 方法原理 双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAs-ELIsA)、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)及免疫电镜 IEM)检测是本标准制定的主要依据 仪器设备和主要试剂 5 5.1仪器设备 电子天平(感量0.001g)、普通天平(感量0.1g)、高速冷冻离心机、小型离心机、超低温冰箱 (一80C),制冰机,旋涡振荡器、磁力搅拌器、高压灭菌锅、pH计、超净工作台、PCR仪、电泳仪、电泳 槽、凝胶分析成像系统、酶标仪、洗板机、透射电子显微镜 5.2主要试剂 所有试剂均为分析纯,实验用水应符合GB/T6682中相关规定 DAS-ELIsA检测试剂见附录B RT-PCR检测试剂见附录C;IEM检测试剂见SN/T1840
GB/T36778一2018 6 检测样品制备 6.1种子 抽样按照SN/T2122的规定执行 挑取至少1000粒种子样品,将其分成若干份,每份25粒100粒 用灭菌蒸馏水浸泡种子,待种 子泡软后(约12h一24h)进行试验 6.2植株 抽样按照SN/T2122的规定执行 对于有症状的植株样品编号单独检测,检测时选取全部表现症状的叶片 未表现症状的植株样品 分组(10株为1组)并编号检测,检测时选取幼嫩叶片进行试验 检测与鉴定 7.1DAS-ELISA方法 DASELISA检测时,将使用的点样孔安排在酶联板内部,避免使用酶联板周围一圈的点样孔,防 止边际效应的发生,影响检验结果的准确性 在一次血清学检测试验中,一般设置2个阳性对照孔、2 个阴性对照孔、2个空白对照孔作为质量控制,并根据送检样品数量设置待检样品孔数量,要求每个待 检样品设置两次重复 具体检测方法见附录B 7.2 一步RT-PCR方法 RT-PCR检测时,每个样品设置两个平行反应 检测时以感染燕麦花叶病毒的植物组织作为阳性 对照,以健康植物组织作为阴性对照,以双蒸水代替模板作为空白对照 具体检测方法见附录c 7.3IEM检测方法 利用燕麦花叶病毒抗血清富集植物材料中的病毒,在透视电子显微镜下观察病毒颗粒的形态特征 具体检测方法见SN/T1840 如观察到长600nm一750nm,宽12nm~14nm弯曲线状的病毒粒子 即可判定IEM检测结果阳性 8 结果判定 若样品经酶联免疫检测结果为阳性,且RT-PCR检测为阳性或IEM检测为阳性,则判定为检出燕 麦花叶病毒 若样品经RT-PCR检测为阳性,且序列测定结果与已知燕麦花叶病毒核昔酸序列一致性不低于 80%,则判定为检出燕麦花叶病毒
GB/36778一2018 样品、结果记录与资料保存 g.1样品保存与处理 经检验确定携带燕麦花叶病毒的样品经登记人和经手人签字后妥善保存1年,以备复核,种子保存 在干燥条件下或4冰箱内,病叶冷冻干燥后保存于一20C或-80C冰箱内 保存期满后应经高压 蒸汽灭菌后方可处理 9.2结果记录与资料保存 完整的实验记录包括样品的来源、种类,时间,实验的时间,、地点,方法和结果等,并要有实验人员 和审核人员签字 酶联免疫方法需有酶联反应的原始数据,RT-PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片 及序列测定结果,IEM检测需有电镜照片
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GB/36778一2018 注1黑色粗线表示100" nm 注2:引自TomioU 图A.2燕麦花叶病毒粒体形态 A.5传播方式 主要通过土壤中的禾谷多黏菌(PolymyaagraminisL.)进行传播;也可通过汁液摩擦接种传播， 但较困难;不能通过种子传播,但种子能带毒,带毒的种子在含禾谷多黏菌的土壤中能传播燕麦花叶 病毒 A.6抗原特性 具有中等免疫原性,与其他燕麦属作物病毒无血清学关系 A.7基因组 二分体基因组由2条线形正义核糖核酸RNA)组成，即;RNA1和RNA2 RRNA1全长为 7550nt,编码产生1个分子质量为262.8k的多聚蛋白,随后切割成一些功能产物,外壳蛋白(CP)在 C端,分子量为28.8ku;RNA2长约3500m,长期摩擦接种可导致其基园缺失突变
GB/T36778?2018 ? B 淶??) DAs-EL.ISA B.1 ?? B.1.1 ??塣 B.1.2?? ???塣 B.1.3 (pNPP) B.1.4??(PBST)??? ?(NaCI 8.0g (KH.PO, 0.2g (NNaHPO 1.15g (KCI 0.2g -20(Tween-20 0.5ml ?,pH?7.4,?1L,4C?档 B.1.5? ?(Na.CO 1.59g ?(NaHcO. 2.93" (NaN, 0.2g ?,pH?9.6,?1L,4C?档 B.1.6??? 1PBST 1.0I (Na,sO. 1.3g 20.0g ??(PVP)(Mw24000~Mw40000 0.2 (NaN) 8 20.0mL -20(Tween-20) pH?7.4,4C?档 B.1.7????? 1PBST 1.0 PVP(MW24000Mw40000) 20.0g
GB/36778一2018 2.0 牛血清白蛋白(IBSA) g 叠氮化钠(NaN, 0.2g" 调pH值至7.4,4C冰箱保存 B.1.8底物(pNPP)缓冲液 二乙醇胶 97.0ml 0.1 氯化镁(MgCl) g 0.2 叠氮化钠(NaN. g 溶于燕僧水,调pH值至9.8,蒸水定容至1L,4C冰箱保存 B.1.9反应终止液 氢氧化钠(NaOH 12.0g 蒸水定容到100mL B.2试验步骤 包被抗体 B.2.1 用包被缓冲液将包被抗体按说明稀释,加人酶联板孔中,100L/孔,加盖,37C孵育2h或4C冰 箱孵育过夜,清空孔中溶液,PEST洗涤4次,每次3min B.2.2样品制备 待测样品按1:10(质量:体积)加人抽提缓冲液,用研钵研磨成浆.2000尽离心10mim,上清即为 制备好的检测样品 对阴性对照,阳性对照作相应的处理或按照说明书进行 B.2.3加样 加人制备好的检测样品、阴性对照、阳性对照,100ALl/孔,加盖,37C孵育2h或4C冰箱孵育过 夜,PBST洗涤4次,每次3min. B.2.4加酶标抗体 根据说明书用酶标抗体稀释缓冲液将酶标抗体稀释至工作浓度,加人到酶联板中,100AL/孔,加 盖,37C孵育2h,PBST洗涤4次,每次3min B.2.5加底物 将底物pNPP加人到底物缓冲液中,终浓度为1mg/mL(现配现用),按每孔加人100aL,室温避光 孵育30min 必要时每孔加人50AL3mol/I氢氧化钠溶液终止反应 B.2.6读数 30min后用酶标仪在405nm处读oD值 B.3结果判断 对照孔的oD值(缓冲液孔,、阴性对照及阳性对照孔),应该在质量控制范围内,即 B.3.1
GB/T36778一2018 缓冲液孔和阴性对照孔的OD值均<0.15,当阴性对照孔的OD值<0.05时,按0.05计算;阳性 对照OD值/阴性对照OD值>5~10;同一样品的重复性基本一致 B.3.2在满足了B3.1质量要求后,结果可判断如下 样品OD值/阴性对照OD值明显>2,判为阳性;样品OD值/阴性对照OD值在阀值附近 判为可疑样品,需重新进行试验,或用其他方法加以验证;样品OD值/阴性对照OD值明显<2,判 为阴性 B.3.3若满足不了B.3.1质量要求,则不能进行结果判断 B.3.4若采用商品化试剂盒,按照试剂盒说明操作并判定结果
GB/36778一2018 附录 C 规范性附录) -步RI-CR检测方法 C.1 主要试剂 C.1.150xTAE缓冲液 三胫甲基氨基甲婉(Tris)碱 242g 57.1mL 冰乙酸 100ml 乙二胺四乙酸(EDTA)(0.5mol/LpH8.0 双蒸水定容到1L C.1.26×Loading缓冲液 0.25%质量:体积 澳酚蓝 二甲苯青F 0.25%质量:体积 蔗糖水溶液 40%质量:体积 贮存于4C c.2引物序列 正向引物OMVvCPF:5’-GACAATGGAACAGGATCAATG-3’;反向引物oligo-d(T)Notl primmer:5'-CAATTcGCGGcCGc(T)-3';扩增区域在外壳蛋白基因和Poly(A)上,扩增片段大小 为758bp. c.3试验步骤 c.3.1植物总NA的提取 C3.1.1取0.1只样品,加液氮研磨成粉末状,将研磨物迅速移人1.5mL离心管中,加人1ml Trizol Reagent,颠倒混匀,2C8C,12000K,离心10min C.3.1.2取上清,15C 30C,放置5nmin;加人0.2mL三氧甲婉.用手剧烈震荡(勿涡旋振荡),约 15s,15 C一30C,放置2min~3min;2" C,12o00,离心15min C.3.1.3小心吸取约为600L的上层水相,勿扰动中间相和下层相 加500L异丙醇混合上清液 -30C,放置10min 15 ,12000g,离心10mmin c.3.1.4去除上清液,沉淀中加人1nmL75%乙醇,洗涤;2C一8C,7500尽,离心5min C.3.1.5去除上清液,沉淀自然干燥后,将其溶于30L50l无RNase的双蒸水中 注植物总RNA的提取也可使用相应市售RNA提取试剂盒提取 土壤中RNA的提取可使用相应市售RNA提 取试剂盒提取 C.3.2RT-PCR 在25L反应体系中加人2.5l.10×RT-PCR缓冲液,5ALMgCL,(25mmol/L),2.5ALdNTP
GB/T36778一2018 Mixture 各10mmol/L),0.5AL RNaselnhibitor(40U/L),0.54LAMVRTaseXL(5U/L) 05AL.AMvOpinmiteelTu4(sU/L).0.L引物oNvcPF(20wmol/L)0.5l引物oligeod(T) Not 20 ol/L),lALRNA,RNaseFreeddH.O补至25L 反应条件为:5030min primer Mmmo 94C2min;然后94C30s,58C30s,72C60s,共35个循环;72C5” min 注:反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整 也可采用其他商业RT-PCR试 剂盒 C.3.3CR产物的琼脂糖凝胶电泳 灌制1.5%琼脂糖凝胶板,室温凝胶30min,取5pLPCR产物与6×Ioading缓冲液混匀后点样,用 DNAMarker作分子量标记,在1×TAE中以5V/e的电压电泳30 溴化乙锭溶液 mln 4g/mL)染色10min,用凝胶成像仪照相 0.5 注，可用澳化乙锭替代产品染色 C.4 结果判断 阴性对照和空白对照在758bp处未出现扩增条带,待测样品与阳性对照在758bp处出现扩增条 带,判定结果为阳性 阴性对照和空白对照在758bp处未出现扩增条带,阳性对照在758p处出现扩增条带,且样品无 特异性扩增,判定结果为阴性 0
GB/36778一2018 参 考文献 [1]陈剑平 应用免疫电镜技术快速检测菜豆黄花叶病毒、马铃薯M病毒和燕麦花叶病毒[]. 病毒学杂志，1991，61):53-58. [2]郑滔.大麦和性花叶病毒(BaMMV)和燕麦花叶病毒(OMV)的分子生物学研究[D] 杭州: 浙江大学，2002. isolatesofoatmnosaic [[3]CloverGRG，RattiC，AutonellCR，etal.DeteetionofEur rropean" Urru [] EuropeanJournaloPlantPathology，2002，10887-91. =145[OL]. dpvno= [4]http://www.dpwweb.net/dpv/showdpv.php? [5]King Adams CarstensEB，etal.Virustaxonomy:ninthreportoftheinter nationalcommitteeonthetaxonomyofviruses SanDiego:ElsevierAcademicPress，2012. Monger W G Molecularidentificationofoatmosaiczuir4sasa" Clover Foster bymoirus EuropeanJournalofPlantPathology，2001，107:661-585. Sirlova VackeJ，JokesM.Characteristicsofapotyirusassociatedwithamosaic-like diseaseofyellowoat-grass PlantProtectionScience，2004，402):37-41. K [8 Thommas Soilbornevirusesaffecetingcereals-knownforlongbutstillathreat[] Virus Research，2009，14l:174-183. L9 TomioU，YasuoS.Purificationandsomepropertiesofoamosaicuir4sJ].Annalsofthe PhytopathologicialSocietyofJapan，1981 4" 581-585. 10] WalkerSl，leathS，MurphyJP，etal.Selectionforresistanceandtolerancetooamo saicvirusandoagoldenstriezirusinhexaploidoatsC] PlantDisease，1998，82(4):423-427. ZhengT，ChenJ，Chen」P，etal Thecompletesequenceofoatmosaicvirusand [11] evidencefordeletionandduplicationinRNA2[].ArchivesofVirology，2002，147:635-642

燕麦花叶病毒检疫鉴定方法GB/T36778-2018

引言

燕麦是一种重要的粮食作物，但其生产过程中常常受到各种病毒感染的威胁。其中，燕麦花叶病毒是一种常见的病毒，能够严重影响燕麦的产量和品质。因此，对于燕麦花叶病毒的检测与鉴定具有极其重要的意义。

GB/T36778-2018标准介绍

GB/T36778-2018是我国针对燕麦花叶病毒制定的检疫鉴定方法标准。该标准主要包括以下几个方面：

• 样品采集和处理
• RNA提取和纯化
• RT-PCR扩增和检测
• 检测结果的判定

检测流程

燕麦花叶病毒的检测流程主要包括以下几个步骤：

1. 样品采集：从疑似感染的燕麦植株中取样，注意避免样品受到污染。
2. RNA提取和纯化：使用专门的RNA提取试剂盒将样品中的RNA提取出来，并进行纯化处理。
3. RT-PCR扩增和检测：根据GB/T36778-2018标准中的扩增方案进行RT-PCR扩增和检测。
4. 检测结果的判定：根据扩增产物的大小和浓度等情况，结合实验室内对照组的数据，判断样品是否为燕麦花叶病毒阳性。

应用范围

GB/T36778-2018标准适用于燕麦种子、苗和叶片等材料的燕麦花叶病毒检测。该方法具有检测灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，已经被广泛应用于燕麦花叶病毒的检测与鉴定。

结论

GB/T36778-2018标准为燕麦花叶病毒的检测和鉴定提供了具有可行性和科学性的方法，其检测流程简单方便、检测结果准确可靠，适用范围广泛。在未来，我们相信该方法将在燕麦生产中发挥越来越重要的作用。

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2022/8/11 22:23:13 现行