油菜茎基溃疡病菌活性检测方法

油菜茎基溃疡病菌活性检测方法

国家标准 GB/T40627一2021 油菜茎基溃疡病菌活性检测方法 nmaculansDesmCes.etDeNot ViabilitytestofLeptosphaeria 2021-10-11发布 2022-05-01实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标涯花管理委员会国家标准
GB/40627一2021 前 言 本文件按照GB/T1.1一2020<标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 本文件的发布机构不承担识别专利的责任 本文件由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口 本文件起草单位;深圳海关,深圳市检验检疫科学研究院 本文件主要起草人:高瑞芳、章桂明、王颖,黄河清、向才玉、李娜
GB/T40627一2021 油菜茎基溃疡病菌活性检测方法 范围 本文件描述了应用普通荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜对油菜茎基溃疡病菌[Letoshaeria macwlan.(Desm.)Ces.etDeNot.]分生抛子进行活性检测的方法 本文件适用于油粟茎基溃杨梢菌相关寄主中携带的油粟茎基溃杨桐分生袍子的活性检测监定 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义 原理 应用荧光染料对油菜茎基溃疡病菌分生抱子进行染色处理,根据碘化丙啖(Propidiumlodide,PI) 能够穿透正在死亡或者已经死亡的细胞膜,不能透过具有活力的细胞膜,使不具活性的抱子发出红色荧 光、具有活性的抱子不发出荧光的特点.运用普通荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜对荧光染料处理 的分生抱子进行检测,分析其活性情况 油菜茎基溃疡病菌基本信息见附录A 仪器和试剂 5 5.1试剂 碘化丙(P)溶液配置方法称取0.01gP粉末,加人10mL无菌水,配制成浓度为1mg/mL的 母液,置于棕色瓶4C避光保存,使用前配制所需浓度 000ml 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA);3200《去皮土豆切成小方块，加人I 自来水，煮沸 四层纱布过滤得到滤液,滤液中加人18其葡萄糖、18g琼脂粉,加热溶解后将溶液定容至 15min， 1000ml分装到三角瓶中,121C高压蒸汽灭菌20min. 5.2设备 激光扫描共聚焦显微镜或普通荧光显微镜、高压灭菌锅、生物安全柜、生化培养箱、冰箱、离心机 活性检测方法 6.1检测样品制备 在超净工作台中,用解剖针将油菜茎基溃疡病菌分生袍子挑到灭菌水中,充分振荡3min,在显微
GB/T40627一202 镜下检测样品浓度,确定稀释比例,配制成终浓度为10个袍子/L100个抱子/L的袍子悬浮液,镜 检,备用 6.2袍子染色 取199L抱子悬浮液,加人1L质量浓度为0.1mg/mL的PI染料,混匀,室温下避光染色 4nmin，染色完成后,16000g离心1min去上清液终止染色,加人灭菌去离子水洗涤一次,重新悬浮 避光放置备用 6.3普通荧光显微镜检测 6.3.1制片 吸取5活性染料处理之后的样品制备玻片,封片,放置于普通荧光显微镜载物台上,低倍镜下找 到抱子,转到100倍油镜下观察,微调至视野内图像清晰 6.3.2检测 至少检测30个袍子,观察染色情况 染色检测;将荧光光路打开,设置荧光通道的激发波长534m,收集荧光信号的发射波长617nm. 收集荧光信号 微调至视野内图像清晰 染色结果参见附录B 为了保证图像能够反映出弛子最真实的荧光染色情况首先需要确认明场通道下所得到抱子符合 油菜茎基溃疡病菌分生袍子形态特征,且图像清晰 6.4激光扫描共聚焦显微镜检测 6.4.1制片 吸取5L活性染料处理之后的样品制备玻片,封片,置于激光扫描共聚焦显微镜载物台上,低倍镜 下找到抱子,转到100倍油镜下观察,微调至视野内图像清晰 6.4.2激光设置 选择相应的激光管(氲离子激光器)激发荧光信号,P检测设置荧光通道的激发波长(534nm),收 集荧光信号的发射波长(617nm),并设置一个明场通道作为对照 6.4.3扫描设置 选择低像素扫描模式扫描(xy:512×512),重复扫描次数Average为1次,扫描速度Speed为9,根 据成像效果调整探测针孔P'inhole,光电倍增管增益Giain和激光扫描强度ScanStr等参数,将图像调整 至质量较好的效果 再用精确扫描方式(对y:2048×2048)根据信噪比调整扫描模式,选择精确像素的 平面扫描方式进行粗略扫描(xy:2048×2048),重复扫描次数Average为2次,扫描速度Speed为6， 获取最终图像 6.4.4检测 扫描至少30个抱子,观察染色结果 为了保证图像能够反映出袍子最真实的荧光染色情况,首先需要确认明场通道下所得到袍子符合 油菜茎基溃疡病菌分生袍子形态特征,且图像清晰 6.5萌发试验 取抱子悬浮液100AL,均匀涂布于PDA培养基上,用封口膜封口,置于25C培养9h以上,观察抱
GB/T40627一2021 子萌发情况,以芽管长度大于袍子本身长度视为萌发 结果判断与表述 结果判断与表述如下: -袍子染色后通过普通荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜随机扫描至少30个袍子,所扫描的 抱子中,所有抱子均无红色荧光,判定油菜茎基溃疡病菌抱子具有活性,参见附录B; 抱子染色后通过普通荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜随机扫描至少30个袍子,所扫描的 袍子中,所有抱子均呈红色荧光,判定油菜茎基溃疡病菌抱子不具活性,参见附录B; 激光扫描共聚焦显微镜或普通荧光显微镜扫描结果,存在少数分生袍子或个别分生袍子具有 很弱的荧光而无法判断袍子活性的,则对未染色的袍子进行萌发实验,根据萌发情况判定,如 萌发则判定具有活性,如不萌发则判定不具有活性 样品与原始数据保存 8.1样品保存 存查样品应在4C条件下妥善保存6个月 如发现具有话性的油菜茎基溃扬病菌抱子的,该样品 应保存1年,以备复验,如涉及贸易纠纷则应保存到纠纷解决完毕 保存期满后,需经灭菌处理 8.2 原始鼓据保存 样品检测结束后,其原始记录单和检验结果或证书应归档,妥善保管,以备复验、谈判和仲裁，
GB/T40627一2021 附 录 A 资料性) 油菜茎基溃疡病菌相关信息 基本信息 A.1 英文名:Crueifersstemcanker,Crueifersblackleg,Phomaleafspot,Crucifersceanker,Crueifers dryrot,Blacklegofcabbage 学名;Lebtosbhaeriamaculans(Desm)Ces.etDeNot 无性态:PhomnalingamTode)Desmm. 分类地位;真菌界(Fungi),子囊菌门Ascomycota),座囊菌纲(Dothideomycetes),格抱腔菌目 Pleosporales),小球腔菌科(Leptosphaeriaceae),小球腔菌属(Leptosphaeria) 传播途径;病菌以子囊壳和菌丝体在病残体中越夏和越冬 菌丝体在土中可存活2年3年,在种 子内可存活3年,子囊壳在残株中可存活5年以上 病菌分生抱子可借风雨做短距离传播,病残体和带 菌种子是远距离传播的主要方式 A.2寄主范围 主要寄主是油菜以及其他十字花科蔬菜，包括芸属Br rassica 的一些种，例如油菜B ampestris),大白菜(B.rasubsp.pekinensis) 、榨菜(B.junceavar.lumida),芜菁甘蓝(B.napusvar. napus)、黑芥(B.nigra、甘蓝B. .olerce 、花椰菜(B. 3.olerraceavar .boryis)、结球甘蓝(B,olerucead var.capitata),芜菁(B.campestris); 野生寄主有葱莽(Aliariapeliolaa,菊科(Aste )、龙胆目(Gentianales)屈曲花属(Iberis) teraceae 香雪球(Lobulan ,紫罗兰属NMathiola)、柳叶菜科(Onagraceae)、萝卜属Raphan4s)野 ri1riti1a 芥(Sin sis)和薪莫(Thlaspiarvense). napisarvUens7 症状 病菌在寄主花期、收获后和生长期侵染植株叶片、根部,茎部和整个植株 幼嫩的组织更易受到侵 染 主要为害症状是叶部损坏、变色,茎部溃疡,严重的整个植株死亡 幼苗的茎、叶上有灰色斑点,成 株的茎基部有凹陷的溃疡斑，上有黑色小点 重病株易折断,根部病斑长条形,易腐朽 病菌子囊袍子 在适宜条件下沉降于叶片表面,侵人定殖,在叶片组织中扩展,导致茎部系统性的潜在侵染,最终发展为 茎溃疡
GB/40627一2021 录 附 B 资料性 油菜茎基溃疡病菌抱子染色结果图 图B.1图B4为P染料对油菜茎基溃疡病菌抱子的不同染色效果图(普通荧光显微镜) 0o O 图B.1P染料对活袍子在明场下的染色效果 图B.2染料对活抱子在荧光通道下的染色效果 图B.3P染料对死袍子在明场下的染色效果 图B.4P染料对死抱子在荧光通道下的染色效果
GB/T40627一2021 参 考文献 randpotential [1]ZhangX，whiteRP,DemirE，etal.Leptosphaeriaspp.，phomastemcanker preadofL. L.maculansonoilseed 2014， 63(3) 598-612. rapecropsinChina[J].PlantPathol logy BrunH，ChevreAM，FittBDL，etal.Quantitativeresistanceincreasesthedurabilityof ualitative resistancetoLe iamaculansinBrassica 2010，185 "pMhun napus[].NewPhytc tologist 1):285-299 [3 dLepe West」S，KharbandaPD，BarbettiMJ，etal.Epidemiologyandmanagement shaeriamaculansphomastemcanker)onoilseedr rapein Australia，CanadaandEurope[].PlantPat .2001，50(1):10-27 hology ，等,进境油菜籽中黑胫病菌和茎基溃拐榈菌的检测C].植物保护学 [[4]周国梁，尚琳琳，于翠， 报，2010(4):289-294. [[5]王振华，杨武，赵晖， ，等,加拿大进境油菜籽茎基溃疡病菌的检测与鉴定[.华中农业大学学 报(自然科学版》 201l，30(1):66-69 [6]陈青，黄峰，廖富荣，等,进境青菜种子携带油菜茎基溃疡病菌的检测和鉴定[],植物检疫 2013，27(4):62-64 2010，24 [7]王振华，赵晖，李金甫，等,湖北口岸首次截获油菜茎基溃疡稍梢菌]植物检疫，" 4):54-54. [8]易建平，周国梁，印丽萍，等,进境澳大利亚油菜籽中茎基溃疡病菌的检测[].植物病理学 报，2010.6:015.

油菜茎基溃疡病菌活性检测方法GB/T40627-2021解读

油菜茎基溃疡病是危害油菜生产的一种重要病害，由黄单胞菌引起。病原菌主要寄生于油菜茎部，严重时可导致植株死亡。为了及时有效地预防和治疗油菜茎基溃疡病，需要对病原菌进行准确的检测和鉴定。

目前，国内外针对油菜茎基溃疡病菌的检测方法较多，但存在着操作繁琐、时间长、灵敏度低等问题。随着科技的不断发展，越来越多的高效、精准、快速的检测方法被研发出来。

其中，GB/T40627-2021《油菜茎基溃疡病菌活性检测方法》是最新的一种标准化方法，该方法可以快速、准确地检测油菜茎基溃疡病菌的活性。下面，我们就来详细了解一下这个方法。

样品处理

首先，需要从油菜茎部取样。在采样前，要彻底清洗工作区域和采样器具，以避免污染。然后，用无菌剪刀将患处组织剪下，并用吸水纸或棉签等物质将其表面湿润，再利用锐器或取样器采集100mg左右的样品，放入试管中备用。

病原体提取

将上述样品加入含粉碎玻璃珠和PBS缓冲液的2ml离心管内，使用颤抖器震荡5min，使细胞完全破碎并释放出病原体。接着，离心10min，将上清液转移到新的离心管中即为提取物，备用。

PCR扩增

制备PCR反应体系，包括模板DNA、引物、Taq酶、dNTPs等。将上述提取物作为模板，进行PCR扩增。通过PCR扩增的产物，可以检测到油菜茎基溃疡病菌的存在并确定其活性。

结果分析

最终结果通过凝胶电泳或者其他检测方法进行分析和判断，判定样品中是否存在油菜茎基溃疡病菌。

总之，GB/T40627-2021《油菜茎基溃疡病菌活性检测方法》是一种高效、精准、快速的检测方法，适用于油菜茎基溃疡病的病原菌活性检测。该方法简单易行、操作性强，可以广泛应用于农业生产和科学研究中。对于油菜茎基溃疡病的预防和治疗具有重要意义。

在未来，随着技术的不断发展，相信会有更加高效、精准、快速的检测方法被开发出来。我们也期待着这些新技术的诞生，为农业生产和科学研究做出更大的贡献。

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