GB/T28066-2011
丁香假单胞杆菌豌豆致病型检疫鉴定方法
DetectionandidentificationofPseudomonassyringaepv.pisi(Sackett)Youngetal.
- 中国标准分类号（CCS）B16
- 国际标准分类号（ICS）65.020.01
- 实施日期2012-06-01
- 文件格式PDF
- 文本页数11页
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丁香假单胞杆菌豌豆致病型检疫鉴定方法
国家标准 GB/T28066一2011 丁香假单胞杆菌豌豆致病型 检疫鉴定方法 DeteetionandidentificeationofPseudomnassyringae pv.pisiSackettYoungetal. 2011-12-30发布 2012-06-01实施 国家质量监督检监检疫总局 发布 国家标准花管理委员会国家标准
GB/T28066一2011 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草
本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口
本标准起草单位;厦门出人境检验检疫局、上海出人境检验检 疫局
本标准主要起草人:林石明,黄蓬英、易建平、陈青廖富荣、吴媛、陈红运、王宏毅
GB/T28066一2011 丁香假单胞杆菌豌豆致病型 检疫鉴定方法 范围 本标准规定了丁香假单胞杆菌豌豆致病型生物学,血清学及分子生物学的检测鉴定方法
本标准适用于植物种子、苗木等植物及其产品中丁香假单胞杆菌豌豆致病型的检测和鉴定 丁香假单胞杆菌豌豆致病型基本信息 中文名:丁香假单胞杆菌豌豆致病型 中文别名:豌豆(细菌性)枯萎病菌或豌豆细菌性叶斑病菌、豌豆假单胞蔓枯病菌或茎枯病菌等 学名:PedomonassyringaeVanHall,1902pw.pisi(Sackett,1916)Young,Dyeandwilkie,1978. 病害英文名:bactrialblightofpca
异名;Bacteiwmpisi(Sackett)Smith,1920;Ch.lorobacterpisiSackett)Patel&
Klkarni,1951; PseudomonapisiSackett,1916;PseudomoassyringaeVanHall,1902;PyomonaSacket) Bergey,etal.,1923
属原核生物界Procaryotes,变形细菌门Proteobacteria,变形细菌纲Gammaproteobacteria,假单 胞杆菌目Pseudomonadales,假单胞杆菌科Pseudomonadaceae,假单胞杆菌属Pseudomonas 丁香假单胞杆菌豌豆致病型的其他信息参见附录A
方法原理 依据病菌在培养基上生长的菌落形态、碳源的利用情况、基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸 附测定(DAs-ELISA)基于体外DNA扩增技术的聚合酶链式反应(PCR),以及病菌接种后的致病特征 等进行检测鉴定
主要试剂 本标准的检测鉴定方法主要使用以下试剂 硫酸镁、磷酸氢二钾、蔗糖、甘油、碉酸、氯化镁、蛋白陈、生理盐水、三氧甲烧、异戊醇、异丙醇、Tris 盐酸,EDTA,SDs(十二婉基硫酸钠),CTAB(十六烧基三甲基澳化胺,澳化乙锭,头抱氨乍,万古霉素、 头抱吠辛酸,澳酚蓝,放线(菌)酮或制霉菌素和PCR相关试剂
主要仪器 本标准的检测鉴定方法主要使用以下仪器 超净工作台、高压灭菌锅、显微镜,培养箱,电子天平,离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、 BHIOLOG;微生物鉴定系统和酶标仪
GB/r28066一2011 病菌分离 6.1种子样品的制备 检查皱缩种子和其他为害状的种子
每份种子检测样品至少检测2000粒种子
将种子倒人5L 桶内,加.3L无菌水,搅拌,用无菌(新)的塑料袋严密封盖.4C下静置16h一18h或过夜;去掉塑料袋 充分搅拌
取种子浸出液10mL,用15000g离心5min,用蒸僧水分2次(每次1mL)洗下沉淀物,制 成种子浸出液,以备分离培养
种子中病菌的分离培养 取100l的种子浸出液涂布于P3和(或)S4培养基平板上(培养基配制见附录B)
每个样品设 3个~10个重复,无菌水作为空白对照
在25士2下黑暗中培养,3d后开始观察
如果在培养基上产生可疑菌落(菌落特征见表1),则将菌落转移至KB平板上划线培养1d~2d进 行纯化(培养基配制见附录B),纯化3次后进行生化鉴定,DAs-ELIsA或PCR等方法鉴定
表1培养基上的菌落特征 P3培养基 s!培养基 Pspi的菌落扁平状,白色,透明,边缘不规则 Pspi的幽落较大,半球形,白色,边缘整齐 多数菌株有蓝色荧光 植物组织中病菌的分离培养 仔细检查植物叶片、豆荚等组织的症状(参见图A.l),用无菌刀片将可疑的病斑切成细的切块,加 滴无菌水,置于载玻片上,盖上盖玻片后在显微镜下观察
如果观察到细菌的菌脓,则进行分离培养
选择新鲜症状的叶片、豆荚等组织,切取病斑前沿部分2 mm一7mn im的组织,用70%酒精表面消 毒15s,无菌水洗2次一3次,在S！和(或P3培养基平板上划线分离
在25C士2C下黑暗中培养3d后,开始观察
如果在培养基上产生可疑菌落菌落特征见表1),则将菌落转移至KB平板上培养1d一2d进行 纯化,纯化3次后进行生化鉴定、DAS-ELISA或PCR等方法鉴定
病菌鉴定 7.1生化鉴定 采用BHIOLOG微生物鉴定仪对可疑菌落进行生化鉴定
7.2DAS-ELISA方法 将可疑菌落配制成10'CFU/mL悬浮液,取100L悬浮液作为检测样品
每个检测样品重复 -次
用已知菌株作阳性对照,用缓冲液作空白对照
具体操作步骤见附录C
GB/T28066一2011 7.3CR方法 将可疑菌落制备成10'CFU/mL的细菌悬浮液,进行PCR扩增
或者把可疑菌落接种到NB培养 基中(培养基配制见附录B),25C士2C下振荡培养过夜,离心后提取沉淀的DNA,进行PCR扩增
用已知菌株作阳性对照,用无菌水作空白对照
具体操作步骤见附录D. 致病性测试 如果生化鉴定、,DAS-ELISA或PCR方法中一种或一种以上方法的检测结果产生阳性,则进行致病 性测试以确认鉴定结果
将豌豆种子播种于小盆钵中,待长出2片一3片真叶的小苗
取在KB培养基上培养24h一48h 的菌落,用消毒的昆虫针蘸取菌落,在最为幼嫩的秸秤处进行刺伤接种
每个菌落接种5株小苗
5d一7d后,观察是否产生致病性
如果出现扩展型的水遗状病斑,则有致病性;反之,则没有致病性
注;有些Pspi的菌株在接种1d一2d后,就引起小苗倒伏 结果判定与检测报告 8.1结果判定 8. 1.1未分离到可疑菌落 如果经S4或P3培养基分离培养,7d后仍未产生可疑菌落,则未检出Pspi
8.1.2分离到可疑菌落 分离培养后的可疑菌落,应经生化鉴定、,DAs-ELISA或PCR方法检测,并通过致病性测试的确认
-如果生化鉴定、.DAsELISA或PCR检测中一种或一种以上方法的结果产生阳性,致病性测试 也产生典型症状,则判定为检出丁香假单胞杆菌豌豆致病型; -如果生化鉴定,DAS-ELISA检测或PCR的结果为阴性,则判定为未检出丁香假单胞杆菌豌豆 致病型; -如果生化鉴定、DAsELISA或PCR检测中一种或一种以上方法的结果为阳性,而致病性测试 为阴性,则应重新进行致病性测试
致病性重新测试后,如果仍然未产生典型症状,则判定为 未检出丁香假单胞杆菌豌豆致病型
8.2检测报告 检测报告应包含所采用检测方法所产生的数据,包括DAsELIsA检测结果的吸光值数据报告,菌 落形态特征照片,PCcR检测的电泳图片或致病性测试结果的照片等
GB/r28066一2011 附 录A 资料性附录 丁香假单胞杆菌豌豆致病型相关资料 A.1寄主植物 自然寄主:豌豆Pisumsativwm、扁豆(Do/lichoslablab、香豌豆(Lathyrwsodoratus)和野豌豆 Viciasepium,V.benhleosti)等 接种寄主;天蓝首蓓(Medicagoluulina)、豇豆(V.unguiculata)和菜豆(Phaseolusulgaris)等
A.2传播途径 病菌通过种子进行远距离传播
病菌在种子表面或种子内部至少存活10个月,在田间病残体上存 活几个月,在干燥的种子上可以保持活性3年以上
即使只有0.01%的种子带菌率,也会引起病害发 生,产生严重为害 病残体也是侵染源
在大田,病菌通过雨水的飞溅、风和人工或机械传带而扩散
A.3症状特征 豌豆植株所有的地上部分均会产生症状,包括叶柄、复叶、托叶、茎、卷须、花芽和豆荚,其中在茎秆 和托叶上的症状最为明显
发病严重的田块颗粒无收，一般损失在20%以下
在干燥且偶有霜冻的天气条件下,症状通常出现在土表的茎部,其上形成水溃状病斑,后期呈橄榄 色至紫褐色
病斑向上发展,侵染复叶和托叶,使叶脉变成褐色至黑色,周围组织发病形成扇形图案,脉 间组织变成水溃状,并逐渐变黄色至褐色,最后叶片干枯呈纸质状
在多雨的条件,复叶和豆粪上会出现病斑,初期为圆形或卵圆形或不规则的水溃状小斑点,呈暗绿 色;斑点扩大后相互融合成较大的病斑,但是只限于脉间
在病斑表面可能出现乳白色的菌脓,干燥后 有亮光
在叶片和托叶上,最初症状为小的、暗绿色水溃状病斑
病斑经常扩展并融合,但是均会受到叶脉 的限制
在小叶上,病斑发黄,后变褐色,而呈薄纸状
复叶后期变黄,病斑呈褐色纸状
茎秆上的病斑向托叶和小叶扩展,在托叶上产生伞形病斑
受侵染的叶脉变黑褐色,叶片组织变成 黄色至褐色,干枯后变薄纸状结构
茎秆上的病斑可能融合,引起萎缩死亡
在果荚上.病斑凹陷,橄榄褐色;在近土表的茎秆上也会产生病斑,最初病斑呈水渎状,而后变榄绿 色至暗褐色
发病的豆荚成熟后扭曲,病斑下陷,呈暗绿色
豆荚上的病斑只限于缝隙处的一条窄带
发病的种子在种脐周围形成水溃状的斑点,或呈皱缩状,褐黄色
出苗前后可发生痒倒,而后植株死亡
严重者种子变色,但多数种子表面没有明显症状
一般只在潮湿的季节或受霜害之后才发生该病害
在潮湿、雨后或重露水的生长季节,易于侵染， 潮湿季节发病最重
大降雨加上雨水或重露水极其有利于病菌的扩散
受霜冻或大雨损害的植株最容 易发病
Pseudomomassyringaepv.bis和Pseudomoassyringaepv.syringae所产生的症状相似,难 于区别
GB/T28066一2011 图A.1豌豆细菌性枯萎病的症状 地理分布 非洲:马拉维、肯尼亚、摩洛哥、南非、坦桑尼亚、津巴布韦等
美洲;巴西、百慕大,加拿大,墨西哥,美国、阿根廷,乌拉圭等 亚洲,印度尼西亚,以色列,日本、黎巴嫩、尼泊尔,叙利亚,印度等
欧洲,保加利亚,丹麦,英国,法国、德国、希腊,荷兰、匈牙利,意大利、罗马尼亚、,瑞士等
大详洲;澳大利亚,新西兰等
GB/r28066一2011 B 附 录 规范性附录 培养基的配制 B.1KB培养基(改良KB培养基,King,eal.,1954 称取以下试剂3号肮蛋白陈20.0g,磷酸氢二钾(KHPO)1.5g、硫酸镁(MgsO7H.O)1.5g、 甘油15,0mL,琼脂15.0g,倒人适宜的容器内,加1000ml燕水,溶解所有的试剂
在121C下湿 热灭菌15min;冷却至45C一50C后,加人头抱氨节(Cephalexin)50mg(溶解于75%的酒精中,配制 成25×10-"浓度);缓慢地倒人培养皿内每个直径9cm的培养皿20mL),避免产生气泡
培养基在超净工作台凝固后直接使用,或者反扣过来装人塑料袋中,在4C下保存
最长的保存时 间是2周3周,否则抗生素会失效
B.2S4培养基 称取蔗糖50g、棚酸1.5g和琼脂15.0g,溶解于1000mL的燕僧水中,在121C下湿热灭菌 15nmin,冷却至50C加人制霉菌素(Nystatine)或放线菌酮(溶解于30mL70%酒精中配制成母液). B.33培养基 称取甘油10g,棚酸1.5g和PseudomonasF琼脂38g,溶解于1000m的燕僧水中,在121C下 湿热灭菌15 min， 1,冷却至50加人制霉菌素(Nystatine)或放线菌酮溶解于30ml的70%酒精中)
B.4NB(NutrienBroth)培养基 蛋白陈5.0g,牛肉浸膏3.0g,燕懈水1000mL,121C湿热灭菌15min.
GB/T28066一2011 c 附 录 规范性附录 DAs-ELIsA方法 C.1包被 用碳酸钠缓冲液稀释抗体溶液(如1:200),在微孔板中每孔加人100L包被抗体溶液
在室温 下孵育2h4h或4C下包被过夜
C.2捕获抗原 倒去孔中的抗体包被溶液,用PBS-Tween洗4次5次孔(或在洗板机上完成)
加人菌悬液或样 品提取液到酶标板的孔中,每孔100AL.,每个样品2个孔重复1次)
并设置阳性和阴性对照
在室 温下孵育2h或4C下过夜
C.3加入酶标抗体 根据说明用酶标抗体缓冲液稀释相应的酶标抗体(如1;200)
倒去孔中的样品提取液,用PBS Tween洗4次一5次孔(可在洗板机上完成)
每孔加人100L酶标抗体游液
在室温下孵育2h 加底物 用二乙醇胶缓冲液(pH9.8)配制1mg/mL的对硝基苯磷酸酯的底物溶液
倒去酶标抗体溶液,用 PBS-Tween洗4次一5次孔(可在洗板机上完成)
每孔加人100L新鲜配制的底物溶液
室温下避 光放置,直至阳性对照孔明显显色(约30min一60min)
c.5读数 用酶标仪在405nm处读吸光值
C.6结果判定 C.6.1对照孔的OD值(缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔),应该在质量控制范围内,即 缓冲液孔和阴性对照孔的oD值<0.15 阳性对照OD值/阴性对照OD值>2 同一样品的OD值应基本一致
C.6.2在满足了C.6.1质量要求后,结果原则上可判断如下 样品OD值/阴性对照OD值明显>2,判为阳性 样品OD值/阴性对照OD值在囤值附近,判为可疑样品,需重做一次或用其他方法验证; 样品OD值/阴性对照OD值明显<2,判为阴性 C.6.3若满足不了C.6.1质量要求,则不能进行结果判断
GB/r28066一2011 附录D 规范性附录 PCR方法 D.1CR模板的制备 D.1.1菌悬液PCR模板的制备 取3L的10`CFU/mL.(oD=0.1)的菌体悬浮液,转人装有100L无菌双蒸水的1.5L离心 管中,在99C水浴10min,10000离心10min,冷却后,取上清液作为PCR反应模板
D.1.2DA的提取 取1mL在NB培养基中振荡培养过夜的菌液.10000离心2min.提取沉淀的DNA;或者取 只的发病植物组织,研磨后,提取植物总NA
提取步骤根据商用试剂盒说明进行 0.1 D.2引物序列 用于检测Pspi的特异性引物及其序列见表D.1,经合成纯化后,冻干备用
表D.1用于PCR扩增的引物及其序列 引物名称 引物序列 扩增产物 EFEP1 5' -AcGcTGGGATGTTAcTTG-3" 303bp EFEP2 5'-GCCTGTTCAAAACGTGTG-3’ D.3PCR反应 50反应体系中加人:l0×PCR缓冲液(含MgCl.)5.0AL,10mmol/1的d小NTP混合物1.0Al TagDNA聚合酶(5U/AlL)0.5Al,l0mol/儿的上下引物各2.0Al,DNA模板2Al,去离子水补足至 50 0Al0 在PCR仪上完成以下程序95C预变性3min;然后94C变性1min,60C退火lmin,72C延伸 1nmin,共30个循环;最后在72C下保持10min D.4电泳分析 取5L扩增产物与1L的6X×上样缓冲液混合均匀,在0.5×TBE缓冲液配制的1.5%琼脂糖凝 胶中,4V/cm一6V/cm电泳50min,溴化乙锭(EB)染色后在凝胶成像系统中观察,拍照并保存
GB/T28066一2011 D.5结果判定 在阳性对照扩增出预期大小的条带(约303bp),阴性对照和空白对照没有扩增到预期大小条 件下 -如果检测样品扩增到与阳性对照大小相一致的条带,则R检测结果为阳性， -如果检测样品没有扩增到与阳性对照大小相一致的条带,则PCR检测结果为阴性
丁香假单胞杆菌豌豆致病型检疫鉴定方法GB/T28066-2011解析
引言
丁香假单胞杆菌是一种常见的植物病原菌，可以导致多种作物的病害。其中，豌豆叶斑病是丁香假单胞杆菌在豌豆上引起的重要病害之一。为了保障豌豆及其制品的质量安全，需要进行丁香假单胞杆菌豌豆致病型的检疫鉴定。
GB/T28066-2011标准概述
GB/T28066-2011是我国农业部颁布的《植物检疫技术规范 丁香假单胞杆菌检疫鉴定方法》标准，适用于丁香假单胞杆菌的检疫鉴定。
检测样品的处理
按照GB/T28066-2011标准的要求，取豌豆茎叶部位的组织，将其表面用70%乙醇或0.1%次氯酸钠消毒。然后，用无菌水冲洗3遍，放入无菌离心管中，最后进行离心沉淀。
丁香假单胞杆菌的分离与鉴定
将沉淀物接种于普通琼脂培养基上，震荡培养36小时后，从培养皿表面选取丁香假单胞杆菌菌落进行传代培养。待菌落生长至适宜大小时，采用生化法进行鉴定。
结论
GB/T28066-2011标准提供了一种简便、快速、准确的丁香假单胞杆菌豌豆致病型检疫鉴定方法，为保障豌豆及其制品的质量安全提供了有力的技术保障。
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