动物源性食品中硝基呋喃类药物代谢物残留量检测方法高效液相色谱/串联质谱法

动物源性食品中硝基呋喃类药物代谢物残留量检测方法高效液相色谱/串联质谱法

国家标准 GB/T21311一2007 动物源性食品中硝基味喃类药物代谢物 残留量检测方法 高效液相色谱/串联质谱法 Determinationofresiduesofnitrofuranetabolitesinfoodstuffsof animalorigin一HPLC-MS/Ms meth0d 2007-10-29发布 2008-04-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管蹬委员会国家标准
GB/T21311一2007 前 言 本标准的附录A、附录B,附录C均为资料性附录 本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口 本标准起草单位:检验检疫科学研究院、山东出人境检验检疫局 本标准主要起草人:彭涛,李晓娟、国伟、孙利、林黎明、于静,邱月明储晓刚、唐英章
GB/T21311一2007 动物源性食品中硝基吠喃类药物代谢物 残留量检测方法 高效液相色谱/串联质谱法 范围 本标准规定了动物源性食品中硝基吠喃类药物代谢物3-氨基-2-恶陛酮(3-amino-2-oxalidinone. A0Z)5-吗咻甲基-3氨基-2-恶陛婉基酮(5-morpholinomethyl3amino-2-oxalidinone，AM0Z)、1-氨 基-乙内酰(1-amino-hydantoin，AHD)和氨基脉senmicarba2zide，SEM)残留量的高效液相色谱/串联 质谱测定方法 本标准适用于肌肉、内脏将鱼、虾、,蛋、奶、蜂蜜和肠衣中硝基吠喃类药物代谢物3-氨基-2-恶陛酮、 5-吗啾甲基-3-氨基-2-恶幽炕基酮、1-氨基-乙内酰脉和氨基脉残留量的定性确证和定量测定 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682一1992，neqIsO3696:1987) 原理 样品经盐酸水解,邻硝基苯甲醛过夜衍生,调pH值7.4后,用乙酸乙酯提取,正己烧净化 分析物 采用高效液相色谱/串联质谱定性检测,采用稳定同位素内标法进行定量测定 试剂和材料 除非另有说明,所有试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水 甲醇;高效液相色谱级 4.2乙睛;高效液相色谱级 43乙酸乙醋;高效液相色谱级 4.4正已炕;高效液相色谱级 45浓盐酸 4.6氢氧化纳 4 甲酸:高效液相色谱级 4.8邻硝基苯甲醛 4.5 三 水磷酸钾 410乙酸绞 4.110.2mol盐酸溶液;准确量取1了mL浓盐酸(4.5),用水定容至1L 4.122.0mol/1氢氧化钠溶液;准确称取80g氢氧化钠(4.6),用水溶解并定容至1I. 4.130.1mol/儿邻硝基苯甲醛溶液:准确称取1.5g邻硝基苯甲醛(4.8),用甲醇溶解并定容至 100mL 4.140.3mol/L磷酸钾溶液:准确称取79.893g三水磷酸钾(4.9),用水溶解并定容至1L
GB/T21311一2007 4.15乙睛饱和的正己炕:量取正己婉80mL于100mL分液漏斗中,加人适量乙晴后,剧烈振摇,待分 配平衡后,弃去乙睛层即得 4.160.1%甲酸水溶液(含0.0005mol/1.乙酸铵);准确量取1ml 甲酸(4.7)和称取0.0386g乙酸 铵(4.10)于1L容量瓶中,用水定容至1L 4.17标准物质:3-氨基-2-恶陛、5-吗啾甲基-3-氨基-2恶哗烧基酮、1-氨基-乙内酰脉、氨基 脉,纯度>99% 4.18内标物质:3-氨基-2-恶陛酮的内标物,D,-A0Z;5-吗咻甲基-3-氨基-2-恶陛婉基酮的内标物 D-AM0Z;1-氨基-乙内酰脉的内标物,CAHD;氨基脉的内标物,CN-SEM,纯度>99% 4.19标准储备液:分别准确称取适量标准品精确至0.0001g),用乙睛溶解,配制成浓度为 100mg/L的标准储备溶液，一18C冷冻避光保存,有效期3个月 4.20混合中间标准溶液:准确移取标准储备液(4.19)各1ml于100ml容量瓶中,用乙睛定容至刻 度,配制成浓度为lmg/I的混合中间标准溶液,4C冷藏避光保存,有效期1个月 4.21混合标准工作溶液:准确移取0.1ml混合中间标准溶液(4.20)于10ml容量瓶中,用乙睛定容 至刻度,配制成浓度为0.01mg/1的混合标准工作溶液,4C冷藏避光保存,有效期1周 4.22内标储备液:准确称取适量内标物质(精确至0.0001g),用乙睛溶解,配制成浓度为100mg/儿L 的标准储备溶液，一18C冷冻避光保存,有效期3个月 4.23中间内标标准溶液;准确移取1ml内标储备液(4.22)于100ml容量瓶中,用乙睛定容至刻度、 mg/几的中间内标标准溶液,4C冷藏避光保存,有效期1个月 配制成浓度为1 4.24 混合内标标准溶液;准确移取中间内标标准溶液(.23)各0.1ml于10mL容量瓶中,用乙腊定 容至刻度,配制成浓度为0.01mg/L的混合内标标准溶液,4C冷藏避光保存,有效期1周 4.25 微孔滤膜.0.30pm,有机相 4.26氮气:纯度>99.999% 4.27缸气:纯度>99.999% 仪器和设备 5.1液相色谱/串联质谱仪;配备电喷雾离子源(Es1). 5.2组织捣碎机 5.3分析天平;感量0.0001g,0.01g 5.4均质器l0000!/min. 振荡器 .6 恒温箱 5.7 pH计:测量精度士0.02pH单位 8 离心机:10000r/nmin. 5 .9氮吹仪 5 .10旋涡混合器 55 .1容量瓶;1Ll0ml.l0r ml 5 2 具塞塑料离心管;50mL 5. 13刻度试管:10mL mL,1 ,100 14移液枪;5” ml 0la 试样制备与保存 6 肌肉、内脏,鱼和虾 从原始样品取出有代表性样品约500g,用组织捣碎机充分捣碎混匀,均分成两份,分别装人洁净容
GB/T21311一2007 器作为试样,密封,并标明标记 将试样置于-18C冷冻避光保存 6.2肠衣 从原始样品取出有代表性样品约100g,用剪刀剪成边长<5mm的方块,混匀后均分成两份,分别 装人洁净容器作为试样,密封,并标明标记 将试样置于一18C冷冻避光保存 6.3蛋 从原始样品取出有代表性样品约500g,去壳后用组织捣碎机搅拌充分混匀,均分成两份,分别装人 洁净容器作为试样,密封,并标明标记 将试样置于4C冷藏避光保存 6.4奶和蜂蜜 从原始样品取出有代表性样品约500g,用组织捣碎机充分混匀,均分成两份,分别装人洁净容器作 为试样,密封,并标明标记 将试样置于4C冷藏避光保存 注;在制样的操作过程中,应防止样品污染或残留物含量发生变化. 样品处理 水解和衍生化 肌肉、内脏、鱼、虾和肠衣 称取约2g试样(精确至0.01g)于50ml塑料离心管中,加人10mL甲醇水混合溶液(I+1,体积 比),振荡10min后.,以4o00r/min离心5min,弃去液体 残留物中加人10ml.0.2mol/儿盐酸,用均 质器以10000!/min均质1min后,再依次加人混合内标标准溶液(4.24)100L,邻硝基苯甲醛溶液 4.13)100AL,涡动混合30s后,再振荡30min,置37C恒温箱中过夜(16h)反应 蛋、奶和蜂蜜 称取约2g试样(精确至0.01g)于50m塑料离心管中,加人10ml一20ml.0.2nmol/I盐酸(以 样品完全浸润为准),用均质器以10000r/min均质1min后,再依次加人混合内标标准溶液(4.24) 00AL邻硝基举甲胜游被(t.13)10,L祸动混合30 后再振荡30mn,置37C恒温箱中过夜 16h)反应 7.2提取和净化 取出样品,冷却至室温,加人1mL2mL.0.3mol/1磷酸钾(1m盐酸溶液加0.1mL磷酸钾溶 液),用2.0mol/1氢氧化钠调pH7.4(士0.2)后,再加人10ml20ml乙酸乙酯(乙酸乙酯加人体积 与盐酸溶液体积一致),振荡提取10min后,以10000r/min离心10min,收集乙酸乙酯层 残留物用 10nmL一20mL乙酸乙酯再提取一次,合并乙酸乙酯层 收集液在40C下用N，吹干,残渣用1nmL 0.1%甲酸水溶液(4.16)溶解,再用3mL乙睛饱和的正己烧(4.15)分两次液液分配,去除脂肪 下层 水相过0.20xm微孔滤膜后,取10L供仪器测定 混合基质标准溶液的制备 7.3.1肌肉、内脏,鱼、虾和肠衣 称取5份约2g的阴性试样(精确至0.01g)于50m塑料离心管中,加人10ml 甲醇-水混合溶液 1十1，体积比,振荡10min后,以4000r/min离心5min,弃去液体 残留物中加人10mL 0.2mol/L盐酸,用均质器以10000r/min均质1min后,按照最终定容浓度1、5、,10,50,100ng/mL 分别加人混合中间标准溶液(4.20)或混合标准工作溶液(4.21),再加人混合内标标准溶液(4.24) 100L,余下操作同7.1.1和7.2 7.3.2蛋、奶和蜂蜜 称取5份约2g的阴性试样精确至0.,01g)于50ml塑料离心管中,加人10ml20ml 0.2mol/儿盐酸(以样品完全浸润为准),用均质器以l0000r/min均质1min后,按照最终定容浓度: 1、5、10,50,100ng/ml,分别加人混合中间标准溶液(4.20)或混合标准工作溶液(4.21),再加人混合内 标标准溶液(4.24)100L,余下操作同7.1.2和7.2.
GB/T21311一2007 测定 液相色谱条件 色谱柱:xXTerraMSC8,150mm×2.1mm内径),3.5m,或相当者; a b)柱温;30C; e)流速:0.2mL/min; d)进样量;10L; 流动相及洗脱条件见表1 e 表1流动相及梯度洗脱条件 时间/minm 流动相A乙晴 流动相B4.16 10% 90% 7.00 90% 10% 10,00 90% 10% 0% 0% 10.01 10% 90% 20.00 8.2 串联质谱条件 参见附录A 8.3液相色谱/串联质谱测定 8.3.1定性测定 按照上述条件测定样品和混合基质标准溶液,如果样品的质量色谱峰保留时间与混合基质标准溶 液一致;定性离子对的相对丰度与浓度相当的混合基质标准溶液的相对丰度一致,相对丰度偏差不超过 表2的规定,则可判断样品中存在相应的被测物 混合基质标准溶液的液相色谱/串联质谱色谱图参见 图B.1 表2定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 >50% >20%50% >l0%~20% S10% 允许的相对偏差 士20% 士25% 土30% 士50% 8.3.2定量测定 按照内标法进行定量计算 8.4平行试验 按照以上步骤对同一试样进行平行试验测定 8.5空白试验 除不称取试样外,均按照以上步骤进行 结果计算 按式(1)进行计算: RXcX X= R×m1 式中: X -试样中分析物的含量,单位为微克每千克4g/kg); R -样液中的分析物与内标物峰面积比值; -混合基质标准溶液中分析物的浓度,单位为纳克每毫升(ng/mL);
GB/T21311一2007 样液最终定容体积,单位为毫升(mL); -混合基质标准溶液中的分析物与内标物峰面积比值 -试样的质量,单位为克(g) n 注:计算结果需将空白值扣除 测定低限(LQQ) l 本方法的测定低限(L0Q):A0Z.AM0Z,SEM、AHD,均为0.5ug/kg 1 回收率和精密度 参见表C.1
GB/T21311一2007 附 录A 资料性附录 串联质谱条件 毛细管电压:3.5kV; 离子源温度:120C; 去溶剂温度:350C; 锥孔气流;氮气,流速100L/h; 去溶剂气流;氮气流速600L/h; 碰撞气:叙气,碰撞气压2.60×10-Pa; 扫描方式;正离子扫描; 检测方式:多反应监测(MRM),监测条件见表A.1 表A.1多反应监测(MRM)的条件 母离子 子离子 驻留时间/s 化合物 锥孔电压/V 碰撞能量/eV m/2) mm/z 262 0.1 60 AMOZ 335 291" 60 D-AMOZ. 0.1 340 296 60 166 50 0.l SEM 209 192 0.1 50 ClN-SEM 212 168 0.l 50 104 0.l 80 AHD 249 0.1 80 10 134 CAHD 252 134 8o 0.1 10 77 104 14 0.1 A0Z 236 77 134 10 0.l 77 D-A0Z 240 134 0.1 10 用于定量 1 所列参数是在watersQuatroUltinmauPT质谱仪上完成的,此处列出试验用仪器型号仅是为了提供参考,并 不涉及商业目的,鼓励标准使用者尝试采用不同厂家或型号的仪器
GB/T21311一2007 B 附 录 资料性附录 标准样品质量色谱图 340>296 100 6.01 % 335>291 100 335>262 106 6.08 212>168 100 209>192 209>166 100 7.06 252>134 100 % 7.0必 249>134 100 249>104 1 240>134 236>134 236>104 100 min C-AHD; D,-AMOZ; AHID. -AMOZ -D-A0Z lclN-SEM A0Z. SEM: 注在选定条件下,AM0Z.SEM.AHD,A0Z的保留时间分别为6.03,6.96、7.06和7.39min. 图B.1硝基味喃代谢物HPLC-Ms/MS质量色谱图
GB/T21311一2007 附 录c 资料性附录 添加回收率 表C.18种动物源性食品中硝基肤喃代谢物的添加回收率(n=10) 添加浓度 平均测定值 回收率范围/ 相对标准偏差！ 食品名称 化合物 G4g/kg ug/kg 0.5 0.51 97.0107.9 3.9 A0Z 1.0 0.98 95.8一100.0 2.1 10 9.92 96.8102.8 5 0,5o 94.3~102.6 0. 3.4 AM0Z 1.0 1.00 96,9~102.4 10 10,27 100,41053 2.2 鸡肉 0.5 0.48 88.799.9 AHD 1.0 0.98 92.1~103.9 4.9 10 10.09 97.2一105.3 3.3 -107.4 .51 5.3 0.5 0. 94.l一 SEM 1.01 98.6~104.o 6.7 10 10.10 98.7~105.7 6.9 s 0.5 0.49 96.8~101.2 5.9 98.4~103.1 A0Z 1.0 1.01 6.8 10 9.96 95.4~103.9 3.l 7.9 0.5 0.51 99.8~105.2 AM0Z 99 96.0101.7 0. 10 10.02 96,8~105,1 6.8 猪肝 0.5 o 47 89.3~98.7 9.0 AHD 1.0 0.98 94.5~101.9 6.1 10 10.11 96.0~105.3 8.4 0.5 0.49 96.6~100.7 3.7 SEM 1.0 1.03 02.6103.7 10 9.96 97.1104.7 7.2 5 0.52 95,9107.7" 0. A0Z 1.0 0.98 94.7101.7 3.4 10 9.98 95.3~105,4 4.3 肠衣 0.5 0.50 94.8~105.0 4.3 0.98 96.0~102.6 AM0Z 1.0 2.7 10 9.79 96.2~100.6 2.0
GB/T21311一2007 表C.1续) 平均测定值 回收率范围 浴加浓度 相对标准偏差 食品名称 化合物 4g/kg ug/kg 0.5 89.5~101.9 0.49 AHD 1.0 0.97 92.3~104 6 5.l 10 10.10 97.5105,1 3,4 肠衣 0.5 0.52 96.2~108.7 5.4 SEM 1.0 0.99 97.2~100.7 6.7 10 10.06 97.9~106.2 5,4 4.3 0.5 0.50 95.2105,4 A(OZ 0.99 94.5一102.4 10 10.11 96.7~105.7 4.0 0.5 0.49 94.2~101.6 3,3 AMOZ 1.0 1.00 96.8~102.1 2.1 10 10.14 98.3~105.8 3.4 虾 0.5 0.48 88.9~101.9 5.6 AHD 0,97 93.0~104.5 10.19 97.2104.4 10 2.6 5 0.52 100.4~107.7 0. 8.9 SEM 1.0 1.00 97.7~103.8 5.3 10 10.17 97.8~105.4 0.5 0.52 98.8107.4 3.6 A0Z 1.0 1.00 97.0103.9 3.2 10 95.3~106.8 10.26 4.6 0.5 0.5o 94，4103.8 3.4 AM0Z 1.00 96.6~103,1 1.0 2.4 10 10.22 00.0~103.4 o. 0.5 48 88.5~101.6 5.0 0.97 92.6~103.5 AHD 1.0 4.4 10 10.09 97.3~103.8 4.7 0.51 97.2~106,7 0.5 4.0 sEM 97 l.00 .5一l03.9 10 97.6~103.5 9.99 5,2 0.5 0.50 95.5~107.9 8.9 A0Z 1.0 0.99 95.9~102.3 鸡蛋 5.9 10 10.36 99.9106.4 4.4
GB/T21311一2007 表C.1续) 添加浓度 平均测定值 回收率范围 相对标准偏差 食品名称 化合物 4g/kg 4g/kg 0.5 0.50 96.4105.6 3.7 AM0Z 0.99 96.4101.7 10 9.98 96.6~104.4 2.8 0.47 91.9~97.3 12.1 0.5 鸡蛋 AHD 1.0 0.97 92.6~104.5 10,5 10 9.8o 95.1102.1 0.5 0.50 94.6~109.4 10.l SEM 1.0 0.99 98.0~102.5 10,9 8.7 10 10.20 98.2~105.3 5 0.52 103.0~l06.5 3.5 0. A0Z 1.0 1.00 96.6~103.6 2.8 10 10.34 100,1106.2 2,9 0.5 94.5~103.6 4.4 0.50 AM0Zz. 1.0 1.00 97.5~103.3 2,4 10 9.93 96.5~102.3 2.2 蜂蜜 89.795.0 0.46 AHD 0.98 94.4~102.o 3.2 10 10.05 94.1~105.2 4.0 0.5 0.52 97.2~108.9 5." SEM 1.0 1.01 99.4104.8 10 10.19 98.3106.0 3.0 0.5 0.50 94.1105.6 12,6 A(02 1.00 1.0 97.2~102.7 7.1 10.17 99.2~106.7 10 9.9 5 0,51 100.6~l05.6 12,2 0， AMOZ 1.0 0.98 96.8~101.0 11.5 10 10.07 97.2~105.7 12.l 奶粉 0.5 0.46 88.396.7 l1.5 0.98 93.9100.7 AHD 1.0 12.7 10 10.18 95.7105.7 9.5 5 0.52 12.3 0 96.2l08.6 SEM 1.02 99.7~104.5 12.2 1.0 10 11.3 10.49 103.3~106.4 10