转基因产品检测核酸提取纯化方法

转基因产品检测核酸提取纯化方法

国家标准 GB/T19495.3一2004 转基因产品检测核酸提取纯化方法 Detectionofgeneticallym0difiedorganis andderivedproducts m 1.s Nucleicacidextraction 2004-04-13发布 2004-04-13实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 中 国国家标准化管委员会国家标准
GB/T19495.3一2004 目 次 前言 范围 规范性引用文件 原则 实验室通用要求 提取步骤 测试报告 附录A规范性附录 盼-三氧甲烧法提取DNA 附录B规范性附录 PVP法提取DNA 附录c(规范性附录)cTAB法提取DNA 13 16 附录D规范性附录 硅土法提取DNA 附录E(规范性附录)呱-三氯甲婉法提取DNA 18 附录F(资料性附录 提取DNA方法应用实例 20 参考文献 22
GB/T19495.3一2004 前 言 GB/T19495(《转基因产品检测》为系列标准: GB/T19495.1一2004转基因产品检测通用要求和定义 2 GB/T19495. 2004转基因产品检测实验室技术要求; GB/T19495.3一2004转基因产品检测核酸提取纯化方法; GB/T19495.42004转基因产品检测核酸定性PCR检测方法; GB/T19495.52004转基因产品检测核酸定量PCR检测方法; GB/T19495.62004转基因产品检测基因芯片检测方法; GB/T19495.7一2004转基因产品检测抽样和制样方法 GB/T19495.82004 转基因产品检测蛋白质检测方法 本部分引用了ENIso/D1s21571中的部分内容 本部分的附录A、附录B附录C.附录D和附录E为规范性附录,附录下F资料性附录 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口 本部分由质量监督检验检疫总局批准发布 本部分起草单位;山东出人境检验检疫局、汕头出人境检验检疫 局、广州出人境检验检疫局、国家质量监督检验检疫总局动植物检疫实验所、农科 院生物技术所、山东农科院植保所 本部分主要起草人高宏伟、相大鹏、翠文、朱水芳、陈长法、蔡颖、许业莉,庄逸林,梁希扬、甄宇江、 金芜军、路兴波 本部分系首次发布的国家标准
GB/T19495.3一2004 转基因产品检测核酸提取纯化方法 范围 GB/T19495的本部分规定了转基因产品中DNA提取纯化方法以及DNA溶液浓度测定的基本要 求 本部分适用于转基因食品等加工产品,也适用于转基因农产品 规范性引用文件 下列文件中的条款通过GB/T19495的本部分的引用而成为本部分的条款 凡是注日期的引用文 件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分,然而,鼓励根据本部分达成 协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本 部分 GB/T19495.1一2004转基因产品检测通用要求和定义 GB/T19495.2一2004转基因产品检测实验室技术要求 GB/T19495.5一2004转基因产品检测核酸定量PCR检测方法 GB/T19495 7 2004转基因产品检测抽样和制样方法 原则 一般性原则 核酸提取的目的是提供合适的用于后续分析的DNA DNA的质量包括提取的DNA分子的平均 长度化学纯度以及DNA序列及双螺旋的完整性,例如,DNA碱基的链内、链间的联系,单链间隙的联 系等 而且,这些情况是序列特异性的,因此在基因组中不是随机分布的 3.2提取 DNA提取的基本原则是释放样品中的DNA,随后纯化DNA去除PCR反应抑制剂 附录A中不 同的DNA提取纯化方法适用于不同的样品 DNA定量有助于后续的PCR分析,可以通过物理方法(测量特定波长下的光吸收),化学-物理方 法(结合可以发荧光的物质),酶法(生物荧光检测)或者定量PCR方法 后者最适用于多组分样品以及 含量低或已降解的DNA 实验室通用要求 随机的DNA污染来源于灰尘及气溶胶 因此,实验室工作区域的组织以及良好的实验操作 GLP)基于 实验操作中每一步骤的系统控制; 样品操作的“单向流动”原则 后者可以保证被分析的DNA以及PCR产生的DNA保持分离 性 具体要求应符合GB/T19495.22004中的规定 提取步骤 5.1测试样品的准备 5.1.1一般性要求 除了处于食物和(或)饲料链起始端的农产品和粗加工材料如粉碎的产品),大多数工业加工的食
GB/T19495.3一2004 品经过了物理、化学及酶的处理 这些处理会降低DNA的含量及纯度 因此,每一方法的适用性及重 复性会随特异样品而异，一种特定的DNA提取方法的性质特征依赖于被研究的食品种类 实验室样 品的代表性应符合GB/T19495.了一2004 本部分附录A至附录E的方法中,测试样品量为250mg200 -300mg)对于DNA丰富的原 mg 材料如种子)是足够的,但对于DNA含量低或有降解的材料而言是不够的 这种情况下,测试样品量 可增加至1g~2g,超出这一上限的测试样品量不在本部分的框架范围内 每个实验室样品应分别从两份测试样品中提取DNA 标准品、实验室样品及测试样品的保存应按照GB/T19495.1一2004的规定执行 5.1.2样品 实验室样品应充分均一再制备为测试样品 所有测试样品的制备操作应按照GB/T19495.22004的规定执行,小心操作确保防止任何的污 染和样品组分的改变 液体含量高的岗体或糊状样品不易被研鹰成理想大小的棚粒,可以通过研膺过程中去除液体,研刷 前冷冻或冷冻干燥等方法处理 对于膏状或粘性样品的研磨,可以采取下列的措施之一用来处理 加热(不超过40C); 置于液体中均质(如置于水中); 冷冻(<一20C). 上述方法处理后的实验室样品可能有稀释或浓缩,应混匀后制备两份测试样品 对于液体样品,摇 晃容器以便产品更均质化 对于诸如原油一类的无法均质化的样品,应确保所有的沉淀已经完全从容 器的内壁脱离 对于不易悬浮的固体样品,应该进行研磨以利于DNA提取 在这种情况下,应该注意到颗粒的大 小 用来进行提取DNA的测试样品应包含GB/T19495.7一2004所规定的最少量的颗粒 任何可能产生灰尘的步骤应与其他分析步骤分离开来 根据附录中的方法,所有可清除的盐、调味 品、粉状糖都应该被考虑到 对于多组分样品,目标样品(比如鱼排中的面包层)可以被分离用来进行DNA提取 所使用的方 法程序在分析报告中应进行描述 5.2DNA提取与纯化 5.2.1一般性要求 为了获得高质量的DNA,宜去除的杂质及采用的方法 用合适的酶(果胶酶、纤维酶、半纤维酶、淀粉酶等)处理去除多糖类物质(果胶、纤维、半纤维、 淀粉,增稠剂)或者用有机试剂提取(如cTAB/三氯甲烧) 用合适的处理方法,比如RNA酶和蛋白酶分别处理NA和(或)者蛋白质; 少量的液体残留可采用酶处理或者有机试剂处理(如正已炕); 可能对下游的分析产生干扰的盐(来自提取液、细胞分裂缓冲液和DNA沉淀等步骤) 对于固体或者干燥的样品，细胞分裂缓冲液或抽提缓冲液的体积应足以保证DNA的溶解 DNA的纯化可以通过酚、三氯甲炕、乙醇,异丙醇等少量溶剂来沉淀,或吸附在固体材料上(阴离子 交换树脂,硅藻土或玻璃胶,膜等) 几种DNA纯化的方法可以结合进行 如果合理搭配的话,DNA 的提取和纯化可以在同样的步骤中进行 为了提高DNA的回收率,可在沉淀步骤中使用共沉淀剂(如糖原、,PEG或t-RNA),这种共沉淀剂 不应含任何核酸酶活性或者PCR抑制剂和(或)竟争剂,也不应包含任何可能在研究和检测中与目标序 列DNA相类似的序列 真空冷冻干燥DNA时,应避免交叉污染
GB/T19495.3一2004 DNA宜重悬在水或缓冲液中以防止DNA降解 5.2.2提取空白对照 为了检查在提取过程中可能存在的污染应设置提取对照(提取空白对照),提取空白对照宜用缓冲 液或者水代替样品 理想情况下提取空白对照也可以作为试剂对照 提取空白对照的试管应置于每个 提取系列中的最后 加人异源核酸或者核酸担体(如;糖原、,PEG)作为共沉淀剂,可能在改善提取过程中的污染有帮助 共沉淀剂可以是不相关的DNA如;鲑鱼或青鱼精子DNA),也可以是非转基因原材料或粗加工品 DNA,非转基因产品测试样品同时提取时还可作为转基因产品检测的阴性对照 当使用核酸担体时， 应注意加人到PCR反应体系中的总DNNA模板量,超量将抑制PCR反应 5.2.3提取回收率对照 在建立一种新的DNA提取方法时,或者在使用附录中的方法提取一种未曾使用该方法提取过的 样品DNA时,应对该方法的提取效率进行评估;加人一定已知含量的示踪DNA(tracerDNA)到测试 样品中,并且设立一个不加示踪DNA的对照测试样品,对这两个样品同时提取DNA 根据示踪DNA 的提取得率,判断该方法提取该样品的DNA得率 设立提取回收率对照可用于判断测试样品中是否含有可提取的DNA或是否含有PCR抑制剂 5.2.4DNA提取液CR抑制物的判断 在建立一种新的DNA提取方法时,应对所提取的DNA溶液中是否含有PCR抑制剂进行判断 加人接近PCR检测下限含量或超过检测下限数倍含量的目标核酸到DNA提取液中,然后进行PCR测 试 如果DNA提取液和加人了目标核酸的DNA提取液均未出现扩增,而单独检测目标核酸时能出现 扩增,则说明DNA提取液中存在PCR抑制物 5.3DNA定量 5.3. 一般性要求 .1 DNA定量可以 比较不同提取方法对同一样品的DNA提取效率; 在PCR反应前校准DNA的量; 监测同一样品不同批次的DNA浓度的变化 5.3.2DNA定量方法 5.3.2.1紫外光谱法 5.3.2.1.1范围 紫外光谱法为溶液中DNA浓度定量的常规方法 5.3.2.1.2原理 溶液中的核酸可以吸收210nm~ 1500nm的紫外线(UV),并且在260nm达到吸收高峰 因为DNA,RNA在260nm都有它们的吸收高峰,因此,核酸溶液中RNA和单核苷酸污染物无法 用UV光谱进行辨别 5.3.2.1.3应用范围 本方法可以用来定量从2g/ml50g/mL的DNA含量 在定量之前,为了与光谱仪(光密度从 0.05~1)的曲线保持一致,应该对需要定量的DNA溶液进行适当的稀释 注:偶然情况下,残留的成分比如来自于CTAB法DNA的提取过程)可能会干扰UV在260nm的探测,因为 cTAB在这个波长也被吸收 5.3.2.2琼脂糖电泳法 5.3.2.2. 范围 琼脂糖电泳法为是溶液中DNA浓度定量的常规方法 琼脂糖电泳法可分析物理影响因素,如DNA降解程度、RNA残留的存在和一些污染物
GB/T19495.3一2004 琼脂糖电泳法适用于在DNA的浓度不足以进行光谱定量、或DNA的纯度不高、或混有某些可吸 收紫外线的杂质的DNA溶液浓度的测定 DNA降解的情况下,不推荐使用凝胶电泳的方法进行DNA定量 5.3.2.2.2原理 当DNA处于分子筛中(比如琼脂糖),在缓冲液存在的情况下,处于电场中,根据DNA本身所携带 的电荷和分子量,可以被电泳分离 澳化乙锭可以镶嵌到DNA分子中,当受到紫外线激发时,散发出橘黄色的荧光 由于嗅化乙锭也 可镶嵌到单链DNA和RNA分子中,对于更精确DNA定量,需要用酶去除RNA 由于荧光的亮度与总DNA量成正比,因此,根据荧光强度,与已知含量的不同浓度的标准DNA进 行对比可获得样品DNA溶液的浓度 标准DNA的分子量应该和待测DNA的分子量相近,因为澳化乙锭的镶嵌,荧光的散发和DNA 片段的长度相关 5.3.2.2.3应用范围 在使用光学成像系统的条件下,本方法可以对浓度从5ng一500ngDNA进行定量 5.3.2.3实时荧光PCR法来对提取的DNA进行定量的方法 当提取DNA含量少的样品时,由于方法灵敏度的因素,上述方法都不可以进行DNA定量,只能采 用实时荧光R法 具体内容见本系列标准GB/T19495.5一2004 5.4提取DNA的稳定性 提取的DNA应保存好,以保证其在后续分析中的稳定性,避免反复冻融 测试报告 每次提取DNA实验的测试报告应包含GB/T19495.1一2004中规定的内容,还应包括 样品来源 客户要求 采样日期及采样方式(若知道) 收样日期 DNA提取前对实验室样品的初步处理， 用于提取DNA的测试样品的大小 DNA提取应用的程序; 测试中的任何异常点; 方法中未提到或可选择但可能对结果有影响的操作 原始实验纪录 实验室日志 分光光度计或其他DNA定量方法的纪录; 具体的PCR方法和DNA提取对照 胶片的负片， 结果的解释 实验者姓名
GB/T19495.3一2004 附 录 A 规范性附录 酚-三氧甲娆法提取DNA 酚-三氮甲婉-1法 A.1 A.1.1范围 本方法适用于从多类样品中提取DNA,适用范围广 当分析富含多元醇,叶片或者绿色物质时比如菊苣叶片,干燥的首藉等),很多PCR抑制剂会和 DNA共沉淀 由此可能在获得PCR扩增产物时会遇到困难 考虑到酚可能产生的腐蚀作用,应建立CTAB和(或)PVP和(或)硅藻土吸附等方法 A.1.2原理 本方法由裂解(在高浓度EDTA和SDs的情况下进行热裂解,酚-三氯甲烧去除杂质(如脂类分 子,多糖和蛋白质)以及包含DNA水相中的核酸酶,最终用乙醇沉淀DNA并除去盐及残留的三氯甲熔 几个步骤组成 本方法的关键步骤是裂解 A.1. .3 试剂 A.1.3.196%乙醉(CH,OH),一20C保存及应用 3.2冰乙酸(CHH,cOoH) 乙酸钾Kc,H.o.) A 37%盐酸(HCl 异戊醉[(CH).CHcH,CH.o 酚(C,H,O). 1.3.7 三氯甲烧(CHCl). 1.3.8Tris(hydroxymethyl)-aminomethane,TRIs(CHNO). 1.3.9乙二胺四乙酸二钾盐KEDTA(CHN.O,Na) A 1.3.10氢氧化钾(KO)H 1.3.11氯化钾KCI). 1.3.12十二炕基磺酸钠SDs(CHoSN) 1.3.13蛋白酶K,冷冻干燥条件下约20IU/mg A.1.3.14RNA酶,无DNA酶,来自牛胰腺,冷冻干燥条件下50IU/mg A.1.3.15饱和盼 A.1.3.16三氯甲婉:异戊醇,24:1 A.1.3.17酚:;三氯甲熔:异戊醇,25:24:1 A.1.3.18抽提/裂解缓冲液(pH8.0),TRIs0.050mol/L,K,EDTA0.050mol/儿L,sDs30g/L,使用 Hc!或KoH调节pH A.1.3.19TE缓冲液(pHH8.0),TRIs0.010mol/L,K,EDTA0.001mol/L,使用Hcl或KoH调 节pH A1.3.20蛋白孵K游液,蛋白酶K20mg/nl.,无菌水游解,.不要灭菌，一20c保存,避免反复冻融 RNAsc-A溶液,10mg/mL,一20C保存,避免反复冻融 A.1.3.21 A.1.3.2270%乙醇溶液(CH.OH),一20C保存
GB/T19495.3一2004 A.1.3.23乙酸钾溶液,3mol/L,使用乙醋酸调节pH值到5.2,不要灭菌(0.22m膜过滤 主要仪器设备 A.1.4.1离心机 A.1.4.2水浴锅(60C70C工作范围 A.1.4.3真空干燥机 A.1.4.4冷冻干燥机 1.4.5涡旋机 1.5提取步骤 称取0.25g粉碎,磨碎或液体材料至离心管中 a bb 加人1.6ml抽提缓冲液,50l蛋白酶K溶液,60C至70C温育30min至2h(可过夜). mL 5000g离心30 加人RNA酶至终浓度0.14g/ nmin,吸取上清液至另一离心管中 c 离心15min.吸取上层水相至另一新离心管中 加人等体积的饱和盼,混匀,500 d G 加人等体积酚:;三氯甲婉:异戊醇至上清液中,混匀,5000g离心15min吸取上层水相至另 -新离心管中,重复该步骤1次2次,直至中间相清亮 加人等体积三氯甲:异戊醇至上清液中,5000只离心10min吸取上层水相至另一新离心管 中,重复该步骤1次2次,直至中间相清亮 加人0.1×体积的乙酸钾溶液及2.5×体积的96%乙醇,轻轻颠倒混匀,液氮中放置5min.、 g 或一80C放置1h,或一20C过夜 15min,弃上清液.用2×体积的70%乙醇小心洗涤沉 h)10000g或13000g4离心至少 淀，100o0g(或13000)4C离心15min,小心倒掉上清 干燥沉淀 用100A水或TE缓冲液游解沉诧,得到DNA储存液 iD 注，根据样品量调整缓冲液的体积 A.2酚-三氧甲婉-2法 A.2.1范围 本方法适用于从香肠中提取总DNA,包括细菌基因组DNA 从发酵香肠及热发酵香肠中提取的 DNA,可用于PCR法检测重组DNA 本方法适用于从乳酪样品中分离总DNA以特异地检测金黄色葡萄球菌(Stahyocoe cLsaureus 本方法在采样量0.4g的情况下在实验室之间证明有效 A.2.2原理 本方法包括从匀浆的香肠样品中回收细菌细胞,随后经过离心,沉淀物不仅包含细菌而且包含肉颗 粒 溶菌酶降解细胞壁可特异裂解细菌,肉乳杆菌细胞壁的裂解,可加人变溶菌素 sDs及蛋白酶K 可完全的裂解细胞,随后用酚-三氯甲烧-异戊醇几次抽提水相 酚-三氯甲婉有利于去除核酸酶及PCR 反应抑制剂 最后用乙醇沉淀DNA 安全防护 在处理有机试剂时采用通风橱 试剂 异丙醉[CH.CH(oHCH] A.2.4.296%乙醇(C,H,OH),一20C保存及使用 A.2.4.3冰乙酸CHCOOH A.2.4. 4 37%盐酸(HCI A.2.4.5氢氧化钠(NaOH 异戊醉[(CH),CHCH.CH.oH] A.2.4.6
GB/T19495.3一2004 A.2.4.7酚(C,H,O) A.2.4.8三氯甲烧(CHCl). A.2.4.9Tris(hydroxymethyl) -aminomethane， ,TRIs(CHNO. A.2.4.10乙二胺四乙酸二钠盐(NaEDTA) A.2411十二烧基颧酸钠sDs(C,H,osNa) A.2.4.12溶菌酶,50000IU/mg蛋白质 A.2.413蔗糖(CaH.O,). A.2.4.14蛋白酶K,冷冻干燥条件下20U/mg A.2.4.15乙酸钠(NaC,H,O. A.2.4.16饱和酚 A.2.4.17三氯甲炕:异戊醇,24:1 A.2.4.18盼-三氯甲炕-异戊醇,25:24:1 A.2.4.19变溶菌素溶液,500IU/m或5000IU/ml 变溶菌素,无菌水溶解,不要灭菌，一20C保 存,避免反复冻融 A.2.4.20溶菌酶溶液,10mg/ml,使用无菌水溶解,不要灭菌,一20C保存,避免反复冻融 A.2.4.21蔗糖溶液(CH,Oi),400g/L A.2.4.22缓冲液A(pH8.0)，TRIs0.020mol/L.,NaEDTA0.020mol/L,NaCl0.1nmol/I.,用 HCl或NaOH调pH至8.0. A.2.4.23抽提/裂解缓冲液,1×体积缓冲液A和1×体积的蔗糖溶液 I A.2.4.24SDs溶液,250 g A.2425蛋白酶K溶液,20mg/mL,使用无菌水溶解,不要灭菌,保存在一20C,避免反复冻融 A2毛.3870%乙脖溶液(cH.oH),一0C保存及使用 乙酸的游液(NCH.o,)m/L.,用乙M酸调pH至5.2 A.2.4.27 A.2.4.28TE缓冲液,Tris0.010mol/L,NaEDTA0.001mol/L,用Hcl或NaOH调pH至8.0 A.2.5主要仪器及设备 A.2.5.1粉醉机 A.2.5.2离心机(12000g》 A.2.5. 3 水浴锅或温育器 A.2.5.4真空干燥器(可选) A.2.5.5涡旋机 A.2.6提取步骤 切下200g一500mg肉肠,加人到3×体积的水中(至1.5mL),室温放置10min a b)小心转移500l上清液至反应管中,12000g离心10min,倒掉上清液 加人00儿抽提级冲液悬浮沉说,并加人0DL游菌鹏游被 若仅加游菌鹏效果不好,可 c 加人10U变溶菌素(须做预实验),37C温育1h 加人25AL.SDS溶液及25L蛋白酶K溶液,60C温育10min d 加人等体积酚-三领甲棕-异戊醉,混匀2 2min,12000g离心3min,转移水相至另一新管中 e D 加人等体积三氯甲烧-异戊醇,混匀2min 12.000只离心3mim,转移水相至另一新管中 加人0.1×体积的乙酸钠溶液及1×体积的异丙醇 颠倒几次混匀,室温放置至少30min. g 12000g离心15min,弃上清液 n.小心倒掉上清 倒掉上清液,干 h)用2×体积的70%乙醇小心洗涤沉淀,12000g离心10min 燥沉淀 用100nL水或者TE缓冲液溶解沉淀,得到DNA储存液 i 注:根据样品量调整缓冲液的体积
GB/T19495.3?2004 .3 -??-3 A. A.3.1Χ DNA?,?ζ??????? ????? A.3.2? ??????(coagulatedcasein)? ????,??(?)????? sSDs,?K?,?-?-?,DNA A.3.3? ?л??? A.3.4? A.3.4.1 [CH.cH(oHcH? A.3.4.296%(CH.,OH),-20C?? A.3.4.3?(CH.COOH) (NacD) A.3.4.5(CHNa,O. A.3.4.637%(HCI A.3.4.7(NaO A.3.4.8[(CH).CHCHCH.OH] A.3.4.9(c,H,O) A.3.4.10?(CHCL A.3.4.11Tris(hydroxymethyl)-aminomethaneTRIS.(CHNO. A.3.4.12?(NaEDTA) 13 ?sDs(CH.o,sNa). A.3.4. A.3.4.14??,50000IU/mg? 15 (CH.O. 16?K,20IU/mg,??? A.3.4.17(NaC,H,O. A.3.4.18?(C,H,Na.O,),400g/1 ?(NaOH),0.4mol/L,???,,??? 19 A.3.4. 4.20?/?,5XSsc,NaCl0.75mol/L.c,H,Na.,O0.075mol/L,?? SsC?(20SsC),???? A.3.4.21Ρ A.3.4.22??:,24:1 A.3.4.23:?:?,25:24:1 A.3.4.24?-?,500IU/ml.5000IU/mL?,?????20C ,?? A.3.4.25???,10mg/mL??,?????20C,?? A.3.4.26?(CH.O),400g/L A.3.4.27?A(pH8.0),TRIS0.020mol/LNaEDTA0.020mol/LNaCl0.100mol/L, HClNaOHpH? A.3.4.28?/??,1??A1?
GB/T19495.3一2004 A.3.4.29SDS溶液,250g/L A.3.4.30蛋白酶K溶液,20mg/mL浓度,无菌水溶解,不用灭菌,-20C保存,避免反复冻融 A. .3.4.3170%乙醇溶液(CH.OH),-20C使用和保存 A.3.4.32乙酸钠溶液(NaC,H,O),3mol/L,用乙酸调节pH值到5.2. A.3.4.33TE缓冲液(pH8.0),TRIs0.010mol/L,Na.EDTA0.001mol/L,用HCI或NaOH调节 pH值 主要仪器和设备 离心机(12000g) A.3.5.2水浴锅或加热装置 A.3.5.3真空干燥机 涡旋机 A.3.6提取步骤 充分摇匀酸奶,取250L酸奶到2nL的反应小管中 加人80L柠檬酸钠溶液 加人氢氧 a 化纳游液并且混匀 12000g离心2 mln b丢弃上层的脂肪和水相重新以500LssC溶液悬浮沉淀 12000g离心至少2min,丢弃上 请液 重新用500L5xssC浴液游解沉淀 12000些离心至少2min,丢奔上请液 用500提取缓冲液悬浮沉淀 加人50溶菌酶溶液 若仅加溶菌酶效果不好,可加 10IU变溶菌素(须做预实验 7C温育1h,加人25AL.sn5游液和25蛋白酶K游液,60C温育10 min,加人500l 酚-三氧甲烧-异戊醉溶液,混匀2nmin,12000g离心3min,将上清液转移到一个新的反应小 管,加人1×体积三氨甲婉;异戊醇溶液,混合2min.12000g离心3min. 上层水相转移到新的反应小管中 加人0.1×体积的乙酸钠溶液和1×体积的异丙醇,室温下 放置30min,1200《离心15mim.弃上请液 用至少00Al.乙脖游液小心洗涤沉淀、 12000g离心10min,丢弃上清液,干燥沉淀 用100L的水或者TE缓冲液溶解,得到DNA储存液 f 注，根据样品量调整缓冲液的体积 酚-三氯甲烧-4法 A.4.1范围 本方法适用于一步法从酵母,丝状真菌或分离的菌落中提取PCR级的DNA 本方法适用于成分 复杂的样品中的转基因微生物中DNA提取,尤其适用于对裂解不敏感的真菌或革兰氏阴性菌 A.4.2安全防护 在处理有机试剂时采用通风橱 A.4.3试剂 A.4.3.196%乙醇(CH.oH),在一20C使用和保存 A.4.3.2冰乙酸(CH.COOH A.4.3.3硫酸H.SO.,>90% A.4.3.4碳酸氢钾(KHco A.4.3.5 乙酸钾(KC.H.). A.4.3.637%盐酸HCl A.4.3.7 异皮醉[C(cH.).cHcH.cH.oH1. A.4.3.8(CH.O) A.4.3.g三氯甲婉(CHcl
GB/T19495.3一2004 A.4.3.10Tris(hydroxymethyI)-aminomethaneTRIS(CHNO) A.4.3.11乙二胺四乙酸二钾盐K,EDTA(CHN,ONaa) A.4.3.12氢氧化钾(KOH). A.4.3.13十二婉基碱酸钠SDs(CH.OSNa). A.4.3.14RNA酶,不含DNA酶,来自于小牛胰腺，大约50IU/mg冷冻干燥状态下 A.4.3.15饱和酚 A.4.3.16三氯甲炕;异戊醉,241 A.4.3.17酚;三氯甲婉:异戊醇,25;24:1 A.4.3.18提取/裂解缓冲液(pH8.0),TRIS0.050mol/L,K,EDTA0.050mol/L,SDS30g/L用 HCI或KOH调节pH值 A.4.3.19TE缓冲液(pH8.0),TRIs0.010mol/L,K,EDTA0.001mol/L,用HCl或KOH调节pH值 4了.20RNA佛岸被.RNAeeA0mx/nl.冷冻干燥状态下,一0C保存 A A .4.3.2170%乙醇溶液(CH.OH),一20C保存使用 mol/L用冰乙酸调节pH值到5.2,不用灭菌(0.22膜过滤》. A.4.3.22乙酸钾溶液(KCH,O),31 A.4.3.23玻璃珠,将直径为0.2mm一0.5mm 的玻璃珠放到浓硫酸中过夜,然后用灭菌水洗涤,在碳 酸氢钾溶液中煮沸,用灭菌水洗涤,然后在真空干燥器中80C干燥 碳酸氢钾帝液(KHco),50g/L A.4.3.24 主要仪器和设备 A.4.4 珠子打击器,以100次/min的敲打速度对2ml螺纹口的聚乙烯试管进行打击 A 44. 离心管,2mL螺纹口聚乙烯试管 4.3过滤装置,25mm直径玻璃纤维膜 A 离心机,配备2mL离心管的转子 4.4.5水浴锅或加热装置 真空干燥器 A.4.4.7涡旋器 A.4.5提取步骤 A.4.5.1测试样品制备和样品中微生物菌落的准备 DNA提取前需分离微生物,有时微生物的分离要经过琼脂或液体培养基增菌 收获微生物后,可 直接进行DNA的提取或一20C冷冻保存直到进行下一步处理 A.4.5.2DNA提取 用玻璃纤维滤器收集真菌,用不含sDS的裂解液洗涤两次,将菌丝洗下并转移至2ml螺纹帽 a 的离心管中,内装处理过的玻璃珠,600L裂解液,b0儿前-三氧甲熔-异皮解 b 对于微生物菌群,细菌,真菌,酵母或酵母样微生物,用不含SDs的1mL裂解液洗涤1次,然 后10000只13000只离心10min,至少重复一次 然后用600l裂解液悬浮 转移至含有 玻璃珠及酚-三氯甲炕-异戊醇的离心管中 a)b)后,以100次/nmin的速率在珠子打击器上震荡1min一2min离心管,立即在65C温浴 g13000g离心10min 转移上清液到新管中 对于定量PCR 30min~l20min 10000 可温浴30nmin后,10000g一13000只离心15min,转移上清至普通离心管中,加人RNA酶 至终浓度为0.001mg/ml.,65C温浴30min~90min) 加人乙酸钾至终浓度为0.3mol/L 混匀,加人1.2mL乙醇 一20C过夜或一80C保存1h 4C条件下10000g~13000g离心 15， min 用乙醇溶液小心洗涤DNNA沉淀,干燥 用50L~100 AL水溶解DNA 如果 -20C长期保存(5年以上),用TE代替水 1o
GB/T19495.3一2004 附录B 规范性附录 PVP法提取DNN B.1范围 本方法适用范围广,尤其适用于富含多酚成分的样品 B.2原理 本方法首先在sDs和高浓度EDTA的情况下进行热裂解,裂解出的成分如多酚,多糖,新陈代谢 成分和蛋白质以和PVP和乙酸氨结合方式从含有DNA的液相中除去 用乙醇沉淀的方法浓缩DNA 并且除去盐 B.3安全防护 有机物处理在通风橱中进行 B.4试剂 B.4.196%乙醉(CH.OH),在一20C使用和保存 BB .4.2异丙醇(CH,CHOHCH,). .4.3聚乙烯毗咯皖酮(PVP),分子量M=360000D;内在粘度(K值80100') B 3.4.4冰乙酸(CH.COOH). .4.537%盐酸(HCI. B .4.6氧化钠(NaCD. )aminomethane B. 4.7Tris(hydroxymethylD TRIs(CHNO.. .4.8乙二胺四乙酸二钠盐(NaEDTA. B B .4.9十二熔基磺酸钠SDs(CHOSNa). B. .4.10 乙 酸氨(NH,CH,O.). B.4 11 70%乙醉溶液(c,H,OH),在一20C的条件下使用和保存 B.4.12提取缓冲液(pH8.0),TRIs0.2mol/儿L,NaCl0.250mol/儿,Na,EDTA0.025mol/L,sDs 50g/L,用HCI或NaoH调节pH值 乙酸氨溶液(NHC,H.O.),7.5nmol/L,用灭菌水溶解,0.22pm滤膜过滤 B.4.13 B.414TE缓冲液(pH8.0),TRIs0.Q10molL..Na.EDTA0.001molL..用Hc或NaoH调节 pH值 B.5 设备和仪器 B.5.1离心机(10000， g) B.5 2 水浴锅或温浴 3 B.5. 真空干燥器 B.5.4冷冻干燥器 B.5.5涡旋器 11
GB/T19495.3一2004 B.6提取步骤 a 称取0.25g经过研磨或压碎或者液体材料到小容器中,加人1mL 提取缓冲液,65C搅拌 h,室温下冷却,随后将60nmgPVP粉末和0.5×体积的乙酸氨溶液与上清液混合,冰浴 30 min; b 10000g离心10min,将上清液转移的一个新的小管中 将裂解物和1×体积的异丙醇混合， -20C放置30min 4C条件下10000g离心10min,小心弃去上清液 用2×体积的乙醇溶液洗涤DNA沉淀2次 小心弃掉上清液(如果沉淀是松散状态,4C条件 下10000g离心l0min.)干燥沉淀,用100AL水或TE缓冲液重新溶解沉淀 12
GB/T19495.3一2004 附录 C 规范性附录 CAB法提取DNA C.1范围 本方法适用于提取植物及植物类产品中的DNA 本方法可以有效去除影响DNA质量的多糖类 和多酚成分 本方法也适用于植物性食品 C.2原理 本方法由CTAB热裂解,抽提(去除多糖和蛋白质),异丙醉沉淀核酸及乙醉洗涤核酸等步骤组成 根据测试样品所含组分的性质,可采用相关的酶处理样品中非DNA类的杂质,如在裂解缓冲液中 加人a-淀粉酶处理含有淀粉类的样品;加人蛋白酶K去除蛋白质;加人RNase去除RNA等 DNA提取过程中,盐的浓度对于除掉污染物非常重要,因为如果在室温下盐的浓度低于0.5mol L和(或)如果室温低于16C,将会形成CTAB核酸共沉淀 在核酸溶解的情况下,可通过提高盐浓度 如NaCI)去除与CTAB结合的变性蛋白质和多糖复合物 三氯甲烧可进一步从CTAB和多糖/蛋白 质复合物中分离核酸 c.3安全防护 处理有机物时需要在通风橱中进行 试剂 淀粉酶(可选).1500IU/mg蛋白3000IU/mg蛋白 C 三氯甲烧(cHCl, 98%乙醇(CH,OH 乙 二胺四乙酸二钠盐Na;EDTA(CHN,O,Na 4 .5 Hexadeeyltrimethyammonium- n-bromideCTAB(CHeIBrN 4.637%盐酸(HCI 异丙醇(CH,CHOHcCH, 4.8蛋白酶K(可选),冷冻状态下约20IU/mg 4.9RNA酶(可选),不含DNA酶,冷冻状态下约50IU/mg 氯化钠(NaCl 10 4 4.11氢氧化钠(NaOH) c.4.12Tris(hydroxymethyl)-anminomethaneTRIs(c,HNO C.4.13淀粉酶溶液(可选),淀粉酶10mg/ml,不要灭菌 一20C保存,避免反复冻融 c.4.14cTAB1提取缓冲液(pH8.0) 称取4.00gcTAB,16.38gNicl,2.2gTis，1.50gNaEDTA，4.00&PvP-40,用适量水游 解后,调节pH，定容至300ml高压灭菌 临用前按使用量加人魏基乙脖，使终浓度为2% C.4.15CTAB2取缓冲液(pH8.oy 称取4.00gcTAB，16.38只NHcl,2.2区Ti，L.50ENaEDTA，用适量水溶解后,调节pH 13
GB/T19495.3一2004 定容至200mL，高压灭菌 C.4.16CTAB沉淀液(pH8.0 称取1.00gCTAB,0.50gNaCl，用适量水溶解后,调节pH，定容至200ml，高压灭菌 C.4.17氧化钠溶液(NaCIl),1.2mol/L c. .4.1870%乙醇溶液(CH,OH) C.4.19蛋白酶K溶液(可选),蛋白酶K20mg/mL,无菌水溶解,不要灭菌,一20C保存,避免反复 冻融 C.4.20NA酶-A溶液(可选),RNaseA10mg/mL,分装后一20C保存 C.4.21TE缓冲液(pH8.0),TRIS0.01mol/L,NaEDTA0.001mol/L,用HCI或NaOH调节pH C.5设备和器材 C.5.1摇床 C.5.2离心机(12000g C.5.3 涡旋振荡器 C.5.4 真空干燥器 提取步骤 C.6.1 CTAB-1法 a 称取100mg样品至2mlEppendorf离心管中,加人700L.CTAB1缓冲液,涡旋振荡混匀 后于65C温育30nin,期间颠倒混匀离心管2次一3次 b)加人700AL的三氯甲炕-异戊醉,涡旋振荡混匀后放置10 期间颠倒混匀离心管2次3 min， 次;12000g离心5min. 转移上清液至1.5mlEppendorf离心管中,加人0.6倍体积经4C预冷的异丙醇,于一20C下 静置5 min,l2000g离心5 min 1,小心弃去上清液 加人70%乙醇1000L,倾斜离心管,轻轻转动数圈后,4C下8000g离心1min,小心弃去上 清液;加20 RRNaseA酶(l0g/mL),37C温育301 kL mln 0L的三叙甲烧-Tis饱和酣,颠倒混剑 加人600 L 氯化钠溶液,65C温浴10 加人600 rmin n,转移上层水相至1.5mLEpendorl离心管中 后,12000g离心5 mln， 加人0.6倍体积经4C预冷的异丙醇,颠倒混匀后,于4C下静置30min;4C下12000【离心 10min,小心弃去上清液 加人1000L经4C预冷的70%乙醉,倾斜离心管,轻轻转动数圈后,4C下 12000g离心 g 0min,小心弃去上清液;用经4C预冷的70%乙醇按相同方法重复洗一次 室温下或核酸真 空干燥系统中挥干液体 h)加.50L.TE缓冲液溶解DNA.4C保存备用 注转移上清液时注意不要吸到沉淀、漂浮物和液面分界层 C.6.2CTAB-2法 固体样品称取1.00g至50mL离心管中;半固体样品和液体样品称取2.00g一4.00只至 a 50mL离心管中 b 加人10ml.65C预热的CTAB2提取缓冲液和RNaseA酶(使其终浓度为104g/mL),颠倒 混匀后于65C温育30min,期间颠倒混匀离心管2次3次;12000g离心10min,转移2ml. 一4mL上清液至10m离心管中 加人与上清液等体积的三氯甲炕,颠倒混匀后,12000g离心l0 min,转移上清液至干净 0mL离心管中 14
GB/T19495.3一2004 加人2×体积CTAB沉淀液,颠倒混匀后,室温静置1h;12000g离心10min,弃去上清液 d 向沉淀中加人400L氧化销溶液,使沉淀游解,之后转移溶解液至1.昏ml.Fpendorl离 心管 在溶解液中加人等体积三氯甲烧,颠倒混匀后,12000g离心101 nmin,转移上层水相至1.5ml Eppendorf离心管中 加人0.6倍体积经4C预冷的异丙醇,颠倒混匀后,于4C下静置30 ,4C下12000g离心 min g 10min,小心弃去上清液 h)加人约半管体积经4C预冷的70%乙醇,倾斜离心管,轻轻转动数圈后,4C下12000g离心 10 nmin,小心弃去上清液;用经4C预冷70%乙醉按相同方法重复洗一次 室温下或核酸真空 干燥系统中挥干液体 i 加50L.TE缓冲液溶解DNA,4C保存备用 注，转移上清液时注意不要吸到沉淀,漂浮物和液面分界层 c.6.3CTAB-3法 在2mL离心管中加人1ml.食用油和400LTE溶液,颠倒混匀5min,室温下离心12000g a nmin,去除上层油脂层;再次向同一支管中加人1ml食用油,离心,去除上层油脂层,反复 3 2次一5次 取水相用于提取DNA. 取步骤a)约400L的水相中或油脂与正己炕混合液体中,加人400ALCTAB提取缓冲液和 RNaseA酶溶液(使其终浓度为104g/mL)振荡1s3s,65C温育30min. 加人等体积三氧甲婉-异戊醇,轻缓颠倒数次后室温下静置5min,12000g离心5min,转移上 mLEppendor离心管中(如果上清液比较浑浊,重复此步骤》 清液至1.5 等分上清液于2支1.5mlEppendorf离心管巾,于每支离心管中加人lp区一2gDNA担 体,并加人0.6倍体积经一20C预冷的异丙醉,颠倒混匀后,于一20c下静置1h一2h沉淀 核酸 12000g离心10min,弃去上清液;用70%乙醇洗涤沉淀两次,干燥沉淀物;每支离心管中加 人30AL50ALTE缓冲液,溶解DNA,4C保存备用 15
GB/T19495.3一2004 附 录 D 规范性附录 硅土法提取DNA D.1 范围 本方法适用于从各类样品中提取DNA,适用范围广 本方法也适用于由其他方法提取的DNA的 纯化 本方法不适于脂类丰富的基质 D.2原理 本方法由sDS热裂解、盐酸呱存在条件下利用硅树脂纯化等步骤组成 其原理是在水活性低时由 于能量效应,核酸结合硅土 用异丙醇洗涤,杂质从树脂脱离,而核酸仍结合其上 最后用低盐溶液洗 脱DNA 本方法因为不需要三氯甲烧并且要求的离心速度低,可大规模提取并易于自动化. D.3安全防护 处理有机物时需要在通风橱中进行 D.4试剂 .4.1氯化钠(NaCI) D D .4.2Tris(hydroxymethyl)-amminomethaneTRIS(CHNO) .4.3 二胺四乙酸二钠盐NaEDTA(CHN.o.Na D. 乙 二 D.4.437"%盐酸(HCI) D .4.5氨氧化钠(Na(OH) .4.6十二烧基碱酸钠(CH.o,SNa) D D.4.7蛋白酶K.冷冻干燥状态下约20U/m mg 盐酸呱(CH.NHcD) 4.8 D. D.49氧化娜(KcD D .4.10磷酸氢二钠(NaHIPO. .4.11磷酸氢二钾(KH.PO D D 12异丙醉[CH.CH(OH)CH] A 硅土(SiO.)大小介于0.5am~10am(80%产品是1am一5am) 13 D.4. D.4.14RNA酶,无DNA酶,冷冻干燥状态下100IU/mg 15 蛋白酶K溶液，蛋白酶K20mg/mL,无菌水溶解,不要灭菌，-20C保存,避免反复冻融 D.4. 盐酸溶液-1(CH,N,Hcl),5mol/L,121C灭菌15nmin D.4. 盐酸呱溶液-2(cH.N,Hcl),6mol/L,121C灭菌15min. D.4. 17 Ps缓冲液(pH7.5) 18 NaCl0.157mol/L,KCI0.0027mol/L,NaHPO0.010mol/L KHPO.0.0018mol/L,用HCl调节pH D.4.19硅土悬浮液 称取5g硅藻土至50mL试管中,加人50mLPEBS缓冲液 混合均匀后静置2h 用微量加样器 16
GB/T19495.3一2004 吸掉上清 再加人50mlPBS缓冲液,混合均匀后静置2h 吸去上清 2000g离心2min 弃去剩 余的上清 用50mL6mol/L的盐酸呱溶液悬浮 2个5个月使用期 使用前充分混合 D.4.20TNESDs提取缓冲液(pH8. ) ,NaCl0.150mol/L,TRIS0.002mol/L,NaEDTA0.002 mol/L,SDs10g/L,用HCI或NaOH调节pH,加人SDS之前灭菌处理 D .4.2180%异丙醇溶液(C;H,O) .4.22TE缓冲液(pH8.0),TRIS0.010mol/L,NaeEDTA0.001mol/IL,用HCI或NaOH调节pH 值 D.4.23RNAse-A溶液，RNAseOmg/mL,分装后一20C保存,避免反复冻融 D.5仪器设备 D.5.1离心机 D.5.2温育器 摇床 D.5.3 D.5.4涡旋振荡器 D.5.550ml离心管 D.6提取步骤 称取200mg一300mg研磨材料至管中,加人2mL抽提缓冲液，20L蛋白酶K溶液 60c 温育1h~5h,期间摇晃样品(约250r/min),2000 因岗心15min,转移550AL.上请液至新 管中 加人2L.RNiaee游液,37C温育》min,加人55L昏ml儿盐酸呱溶液,l00L硅土悬浮 液,轻轻混匀,静置约1min. 800g离心2min,弃去上清,加人500L异丙醇溶液,混匀(必要时旋涡振荡). 重复步骤c) d 1500总离心2min,弃去上清,干燥沉淀,加人100LTE缓冲液,小心混匀以溶解沉淀,60c 温育5nmin,2000g离心5nmin,转移80%的上清液至新管中,注意切勿取硅土部分,上清液巾 加人2LRNase溶液,.37C温育1h或室温过夜,得到DNA储存液 n
GB/T19495.3一2004 附录 规范性附录 腻-三氯甲炕法提取DNA E.1范围 本方法适用于多种食品和饲料样品中DNA提取 E.2原理 本方法由含酶,SDs和变性盐酸呱缓冲液的热裂解、三氯甲婉抽提去除脂类和蛋白质等杂质和异 丙醉沉淀DNA的步骤组成 某些样品需要进一步纯化DNA E.3通则和安全防护措施 处理有机物时需要通风橱 E.4试剂 E. 淀粉酶,冷冻状态下1500IU/mg一5000IU/mg 4.1 E.4.2冰乙酸(CH,COOH. 4.3三氯甲烧(CHCl,) E.4.496%乙醇(cH.oH E .4.5 乙 二胺四乙酸二钠盐Na,EDTA(CHN,O,Na 4.6盐酸呱(CHN,HcIy E E.4.737%盐酸(HCID B 4.8异丙醉(CH,CHOHCH 4.g蛋白酶K,冷冻干燥状态下约20IU/mg 4.10RNA酶-A,不含DNA酶,冷冻干燥状态下大约50IU/mg E. 11 氯化钠(NaCl 4， 4.12十二婉基瞒酸钠sDS(CH.o.sNa) E E.4.13氢氧化钠(NaOH 14 E.4. TrishydroxymethyI) -aminomethane TRIs(C,HNO.. 15 淀粉酶溶液,淀粉酶10g/mL.,溶于无菌水中,不要灭菌,一20C保存,避免反复冻融 4 16 70%乙醇溶液(CH,OH) F 4 17 E.4 提取缓冲液(pH8.0),TRISs0.1mol/L,NaCl0.15mol/L,NaEDTA0.05mol/L,SDS10g/" L,用HCl或NaOH调节pH值 E.4.18盐酸呱溶液(CH,N,HCl),5nmol/L,灭菌(121C最多15min) 蛋白酶K溶液,蛋白酶K20mg/mL,无菌水溶解,不要灭菌，一20C保存,避免反复冻融 E 4.19 RNA酶-A溶液,RNA酶A10mg/ml,-20C分装保存 E 4.20 TE缓冲液(pH8.0),TRIs0.01mol/L.NaEDTA0.001molL.用HC或NaoOH调节 E.4.21 pH值 18
GB/T19495.3一2004 E.5器材和设备 E.5.1离心机 E.5.2可温控摇床 E.6提取步骤 称取200mg一500mg研磨或压碎的样品到小管中 加人1.6ml.60C预热的抽提缓冲液 a b 加人10ALRNA酶-A溶液和10AL淀粉酶溶液,小心混匀,60C轻微晃动,温育50 min 加 人1/10体积的盐酸呱溶液,用涡旋振荡器混匀 加人20Al蛋白酶K溶液,手动轻柔混匀,60C轻柔震荡至少2h 将上清转移到一个新的小 管中 加人1×体积的三氧甲烧,混匀.8000只离心15 min 将上清转移到一个新的小管中,加人0.6倍体积的异丙腺,混匀后小管在冰上放置50 min 至少8000g离心20min 用至少2mL乙醇溶液洗涤沉淀,8000g离心10min,弃去上清 干燥沉淀后用100L水或TE缓冲液游解DNA 19
GB/T19495.3一2004 附录 资料性附录 提取NA方法应用实例 酚-三氯甲法提取DNA应用实例 醋-三瓢甲惊1法 F.1.1 本方法可从下列样品中成功地提取DNVA;大豆，脱水首宿,婴儿饼干,婴儿牛奶，细菌,袍子体,大 麦种子,牛肉/猪肉干,啤酒,奶酪,玉米,胡萝卜种子,谷物,鸡肉,菊苣叶,菊苣根,巧克力蛋糕,巧克力 糊,肉桂饼干,蜜饯,谷物片,醉米，甜冰激淋，干豌豆种子,玉米饼干,玉米油蛋糕，玉米粉,玉米面筋何 料,玉米种子,食用木薯片,肉类牛肉,猪肉,鸡肉,火鸡肉),西瓜果浆,西瓜种子,醉肉,绿豆芽，燕麦 种子,土豆块茎,甜菜子油蛋糕,甜菜种子，甜菜种子，香肠,大豆蛋白，大豆卵磷脂(褐色粗制品和黄色 提纯),大豆芽,大豆饮料,大豆粒,大豆膏,大豆油蛋糕,大豆太妃糖,意大利面酱,小麦种子,干甜菜浆 新鲜的甜菜根，甜菜种子,太阳花种子,太妃糖,西红柿,去皮西红柿,西红柿种子,蔬菜汉堡包,含大豆 和无大豆巧克力,麦,面粉,小麦面筋饲料,小麦饲料,小麦粗颗粒,酸奶 F.1.2酚-三氯甲炕-2法 本方法可从表F.1的样品中成功地提取DNA 表r.1酚-三氯甲炕方法二提取DNA实例 测试样品 微生物 发酵香肠 乳酸菌 热处理的发酵香肠 乳酸菌 嗜热性链球菌 乳酪 F.1.3酚-三氯甲炕-3法 本方法可从表F.2的样品中成功地提取DNA 表r.2酚-三氯甲烧方法三提取DNA实例 测试样品 成分、添加剂等 微生物 原味酸奶 3.5%脂肪 嗜热性链球菌 1.5%脂肪,加工淀粉,榛子,白明胶 1.5%脂肪,3.8%蛋白质,甜味剂,菠萝 果味酸奶 嗜热性链球菌 3,5%脂肪,调味品,动物胶,桃子,可可果 10%脂肪,加工淀粉,柠檬,调味晶,杏仁,果胶,维生素B 嗜热性链球菌 热处理的原味酸奶 3.5%脂肪 F .1.4酚-三氯甲炕-4法 本方法已成功地应用于25个真菌属,325种处于菌丝体或抱子形态细菌的DNA提取;曲霉菌,假 丝酵母菌、隐球菌、镰刀菌、青霉菌、根霉菌、酵母菌,黄萎菌等 对于定量PCR,采用本方法提取的DNA必须以另外方法进一步纯化 20
GB/T19495.3?2004 F.2PVP?DA?? ????DNA? ?,??,???,??,,,?С,? ?,,???,?,?,,????????, ,?,(?С?),?,??,?,,,潴,? ,??,???,?,? F.3CTAB?DNA?? ??????DNA ???(?),???,,,?,,??,(,С, ,,С),?,?,?,?,С,?,?, ,,?, ,,?,??,?,???,,? ?,?,,?,?,,??/,?? ,,?,?,???,??,?,??,?(),?, ,龥,??,,????/?),,??, .??(?),?,ζ?.еζ?,??,?? ?),??,,,/,?,?,?,,? ,,?,??,?,,???,??,?,С ,? ?DNA?? F. 4 ?????DNA ?,,,??,??,?,,??, ,,??,??,??,?? r.5-???DNA?? ?????DNA: ?,??,??,?,,?,,,??? ,??,?,?/,??,?,?/,ζ?, ,?,?(?????).??,/,?? 21
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GB/T19495.3?2004 GmbH Verlug" [[26]UntersuchungvonLebensmitteln;NachweiseinergentechnischenVeranderungvon Kar dfeln PCR durehAmplifizierungderverandertenDNA-SequenzmitHilfe CPolymerise der ChainReactionundHybridisierungdesPCR-ProduktesmiteinerDNA-SondeDeteetion ofageneticmodifieationofpotatoesbyamplifieationothemodifiedDNAsequenceusing the polymerasechainreactionPCRandhybridizat ationofthe Droductwith 24.01-01February1996 1997 revisedinanuary Sammlungvon probe Untersuchungsverfahrennach 35LMBG;VerfahrenzurProbenahmeundUntersuchung vonLebensmittelnTabakerze kerzeugnissenkosmetischenMittelnundBedarfsgegenstanden BgVVIn:OffieialCollectionofmethodsunderarticle35oftheGermanFederalFoodAct Methodsofsamplingandanalysisoffoodstobaccoproductscosmetiesandcommodity LoseblattausgabeStandJan1997Bd 1 looseleafeditionasof1997-01 goods/BgVV). Vol1BerlinKoln:BeuthVerlagGmbH [27 technischenVeranderungvonTo UntersuchungvonLebensmitteln:Nachweiseinergente mmatendurchAmplifizierung verandertenDNA-SeguenzmitHilfederPCRPolymerase ChainReaction)undHybridisierungdesPCR-ProduktesmiteinerDNA-SondeI25.03.01 S November1999In:AmtlicheSammlungvonUntersuchungsverfahrennach 35LM BG;VerlahrenzurProbenahmeundUntersuchungvonlLebensmittelnTabakerzeugnissen kosmetischenMittelnundBedarfsgegenstanden/BgVVIn:OfficialCollectionofmethods sampling underarticle35oftheGermmanFederalFoodAct;Methodsof andanalysisof foodstobaccoproductscosmeticsandcommoditygoods/BgVV)loseblattausgabe StandNov1999Bd1looseleafeditionasof1999-11Vol1BerlinKoln:BeuthVerlag GmbH [28 IippM.BrodmannP.PietschK.PauwelsJ.andAnklamE.:IUPACCollabo- rativetrialstudyofamethodtodetectgeneticeallymodifiedbeansandmaizeindried powders. ofAOACInternational,199982No4923-929 [[29 BoyleJ.S.andIewA.M.:TrendsGenet1995,lp. [30 HubnerPh.MeyerR.PauliU.VogeliUand BrodmannP.Eugster LuthyJ.:NachweisgentechnischveranderterRoundupReadyISojabohnenmittelsder Polynmerase-Ketenreaktion(PCR).MethodenvorprufungimRahmenderSubkommission 29adesSchweizerischenLebensnmitelbuchesMitt.GebieteLebensmHyg1997,88:722 731 [[31]HubnerP.,StuderE.andlithy,J.;QuantitativeCompetitivePCRfortheDeteetion ofGeneticallyModifiedinFoodFoodControl,1999,10;353-358 [32]HtbnerP.,Studer;E.andLuthy,J.;Quantitationofgenetieallymodifiedorganismsin oodNatBiotechnol.1999,17;1137-1138 [33]Patents;EP0389063USP5,234,809 [34]MelzakK.A.,Sherwood.C.S.TurnerR.F.BandHaynesC.A.:DrivingForces orDNAAdsorptiontoSilicainPerehlorate ColloidandInterfaceSeience Solutions 1996181;635-644 [35]sambrook.J.FritschE.FandManiatisT.:ln;MoleularCloning;aLaboratory -K" Mmua-2ndedISN0879695096.1989.Vol5AppendixB16"pr >roteinase 1997Nachweis [[36]StuderE. desgenteehnischverianderten"Maximizer"-Maisnmittels etal 24
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