国家标准 GB/T35543一2017 A 酸酶 RibonuceaseA 2017-12-29发布 2018-07-01实施国家质量监督检验检疫总局发布国家标准化管理委员会国家标准
GB/35543一2017 前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由全国工具酶标准化工作组(SAC/SwG1l)归口本标准起草单位;福建南生科技有限公司、,福建华灿制药有限公司、山东大学、北京化工大学、华灿南生(厦门)生物技术有限公司、复旦大学,海狸纳米科技(苏州)有限公司,安琪酵母股份有限公司、上海博仕生物科技有限公司、农业大学、福建农林大学、苏州大学、上海百赛生物科技有限公司本标准主要起草人:黄发灿、郑登忠、徐宁龙、詹学雄、陈秀兰、曾令坤、陈劲春、赵晶、章丽丽、黄发喜、王光煌、钟江、姚娟、刘斌、任辉、张熙颖、邢志刚、朱力、李全宏、邓丽君
GB/T35543一2017 引言核糖核酸酶A来源于牛胰腺,是核酸内切酶,能催化RNA降解,能改变宿主细胞新陈代谢,抑制病毒合成,但对DNA不起作用,可以用来去除DNA制品中的污染RNA 制订核糖核酸酶A国家标准，用以推动该类工具酶的产业化,对于核糖核酸酶A的生产和使用具有重要的意义
GB/35543一2017 核糖核酸酶A 范围本标准规定了核糖核酸酶A的技术要求、检验方法,包装,运输、贮存和保质期本标准适用于从牛胰腺中提取的核糖核酸酶A 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T191包装储运图示标志术语和定义下列术语和定义适用于本文件核糖核酸雨AriboucleaseA 种核酸内切酶,能切开RNA分子内喀唁碱基(U和c)处的3',5'-磷酸二酯键,形成具有2',.3'-环磷酸衍生物寡聚核苷酸 3.2 核糖核酸酶A活力单位aetivityumitofribomucleaseA 以过量的酵母tRNA为底物,在37C,pH5.0条件下,每毫升反应液里每分钟260nm处吸光度值增加1.0所需的酶量为l活力单位,即1Facanunit 注:50Facanunit~1kunitzunit 技术要求 4.1外观白色或类白色粉末 4.2酶活(比活力) >3500Facanunit/mg蛋白 43杂质不应含有其他核酸内切酶和核酸外切酵 5 检验方法 5.1外观直接或将样品倒人无色透明试管中,在自然光条件下,肉眼观察
GB/T35543一2017 5.2酶活依据附录A的方法进行检测 5.3杂质 5.3.1其他核酸内切酶依据附录B的方法进行检测 5.3.2核酸外切酶依据附录C的方法进行检测 6 包装运输及贮存 6.1包装内包装材料应洁净无污染,封口应严密,无泄漏外包装箱储运图示标志应符合GB/T191的规定 6.2运输产品应在冷冻条件下运输,运输工具应清洁卫生、干燥,并有防雨,防晒设施,运输过程中应做好盼护措施避免倒置及破损不宜与有毒、有害、有异味物品混运 6.3贮存应在温度低于一20C的条件下储存保质期在符合本标准规定的条件下,包装完好未启封的产品保质期为三年;超过保质期,使用前应检测酶活
GB/35543一2017 附录 A 规范性附录核糖核酸酶A酶活检测 A.1仪器紫外分光光度计 A.2溶液和样品配制 A.2.10.1mol/儿醋酸钠(pH5.0)溶液配制称取8.203g醋酸钠,加适量纯化水溶解,用0.5mol/L的醋酸调节pH至5.0,定容至1000nmL,即得 A.2.225%高氧酸+0.75%醋酸铀溶液配制:量取25mL高氧酸,称取0.75g醋酸铀,用纯化水溶解，并定容至100mL,即得 A.2.35%酵母tRNA溶液配制:称取0.5g酵母RNA,用0.lmol/L醋酸钠(pH5.0)溶液溶解,并定容至10mL,即得 A.2.4核糖核酸酶A溶液配制;精密取称10mg核糖核酸酶A,用0.1mol/1醋酸钠(pH5.0)溶液,并定容至10mL,检测前再用0.1mol/L醋酸钠(pH5.0)溶液稀释成每毫升含4g蛋白的待测定溶液 A.3试验步骤 A.3.1取3支2ml离心管,分别加人500L的5%酵母tRNA溶液,置37C士0.5C水浴,温孵 5min~8min后,再分别加人500L的44g/mL的核糖核酸酶A,立即摇匀,计时,5min后再分别加人500l的25%高氯酸十0.75%醋酸铀溶液,立即摇匀,终止反应,将离心管置冰浴中,5min后取出，置离心机12000r/min离心10min n,取上清液用纯化水稀释60倍,作为样品测定液 A.3.2另取1支2ml离心管,依次加人500L 的5%酵母tRNA溶液,500AL的25%高氯酸十 0.75%醋酸铀溶液,摇匀,再加人500!L的44g/ml的核糖核酸酶A,再摇匀,“将离心管置冰浴中至用纯化水稀释60倍”同A.3.1的“将离心管置冰浴中”至“用纯化水稀释60倍”操作,稀释液作为阴性对照液 A.3.3以阴性对照液作为对照,测定样品测定液260nm的吸光值 A.4酶活计算以每毫克样品(蛋白)所含的Facanunit数s表示,数值以Facanunit/mg蛋白表示,按式(A.l 计算 A ×D 260nm A.1 c×V×t 式中: 上清液在波长260nm下测得的吸光值; A260nm
GB/T35543一2017 酶液的稀释倍数,90 核糖核酸酶A的浓度,单位为微克蛋白每毫升(g蛋白/mL),c=44g蛋白/ml 核糖核酸酶A酶体积,单位为微升(AL),V=500AL; -反应时间,单位为分(min),t=5min
GB/35543一2017 附录 B 规范性附录核酸内切酶检测 B.1原理 pUC19质粒为环状结构,核酸内切酶能破坏环状结构,两者电泳谱带不一致 B.2仪器 B.2.1电泳仪,备电泳槽 B.2.2分析天平(万分之 B.2.3紫外透光分析仪 B.3实验步骤 B.3.1 pUc19质粒反应 B.3.1.1在测试管里先后加人4ALpUC19质粒DNA14g/AL),l4L纯化水、,2L酶,振荡器混匀，水浴1h; B.3.1 .2 在对照管里先后加人4AL.pUC19质粒DNA(14g/wL)、16ML纯化水,振荡器混匀,水浴 1h B.3.2电泳 1%~1.5%琼脂糖凝胶,电泳电压5V/em10V/cm， ,当澳酚蓝线到达凝胶板2/3时停止电泳,取出凝胶板置于紫外透光分析仪观察和拍照 B,4结果判断在电泳板上,肉眼观察若测试管和对照管的请带一致,则判定样品中不含内切酶;若不一致,则判定样品中含有内切酶
GB/T35543一2017 C 附录规范性附录核酸外切酶检测 C.1 原理 eepUC19所含经BamHI位点居于编码LacZ的a互补肽上,ceepUC19经BamHI酶切后,由环形DNA结构形成稳定的具有至黏性末端的双链DNA,其末端突出部分由五个碱基形成单链,极易受核酸外切酶作用若样品存在核酸外切酶时,黏性末端易受外切酶切割,再经T4DNA连接酶连接,其电泳条带位置不一致 c.2仪器和设备 C.2.1恒温水浴槽 C.2.2台式离心机 C.2.3超净工作台 C.2.4电泳仪 C.3材料 C.3.1高纯cccpUC19DNA c.3.2T4DNA连接酶 C.3.3氯仿-异戊醇(24:1,体积比) c.3.4琼脂糖 C.4实验步骤 C.4.1长时程过量雨切各取54高纯ccepUC19DNA置于两支eppondorf管,分别标记阴性对照和测试管,在阴性对照管里加人10"L10×BamHI缓冲液,2AL限制性内切酶BamHI10U一20U),加人纯化水至 100L;在测试管里加人10L.10×BamHI缓冲液,2L限制性内切酶BamHI(10U一20U),5Al 核糖核酸酶A样品(50U100U),加人纯化水至100L 混匀,37C水浴10h,各取出20L,分别标记1号2号,背电冰检测;再各取0A.分别标记3号4号 C.4.2电泳 C.4.2.1取出1号和2号管,加人载样缓冲液,准备电泳检测 C.4.2.21%~1.5%琼脂糖,电泳电压5V/enm~10V/em,当澳酚蓝线到达凝胶板2/3时停止电泳,取出凝胶板置于紫外透光分析仪观察和拍照 C.4.3连接 c.4.3.1回收INA 取出3号、4号管,各加人20L氯仿-异戊醇先脱去杂蛋白,再沉淀出DNA,并真空干燥样品
GB/35543一2017 c.4.3.2连接反应每管加人2AL10×T4DNA连接酶缓冲液,2UT4DNA连接酶,加人纯化水至20AL,混匀,l5 水浴8h C.4.3.3电泳 C.4.3.3.1取出3号和4号管,加人载样缓冲液,准备电泳检测 C.4.3.3.2 1%1.5%琼脂糖,电泳电压5V/em10V/cm, 当嗅酚蓝线到达凝胶板2/3时停止电泳，取出凝胶板置于紫外透光分析仪观察和拍照 C.5结果判定在电泳板上,肉眼观察若1号和2号的谱带一致,3号和4号的谱带一致,则判定样品中不含核股外切酶;若1号和2号的谱带不一致或(和)3号和4号的谱带不一致,则判定样品巾含核散外切附

核糖核酸酶AGB/T35543-2017

核糖核酸酶是一种极其重要的酶类。在生物学研究中，核糖核酸酶被广泛应用于RNA分子的解析、剪切和修饰等方面。AGB/T35543-2017是关于核糖核酸酶使用和检测方法的国家标准。本文将对该标准进行详细介绍。

1. 核糖核酸酶的作用

在细胞内，RNA分子需要发挥其生物学功能，例如编码蛋白质、调节基因表达等。而这些功能必须依赖于RNA分子的剪切、修饰和解析等过程。而核糖核酸酶则被视为RNA分子剪切和修饰中最为重要的酶类之一。核糖核酸酶主要通过水解或连接RNA分子上的磷酸二酯键来对RNA分子进行剪切和修饰。

2. 核糖核酸酶的分类

核糖核酸酶可以根据其作用位置或结构特征来分类。例如，核糖核酸内切酶（RNase）可以将RNA分子切成不同长度的片段，而核糖核酸外切酶则可以将RNA分子切成较短的片段。此外，还有一些具有特殊功能的核糖核酸酶，如转录后修饰酶和RNA编辑酶等。

3. AGB/T35543-2017标准

AGB/T35543-2017是关于核糖核酸酶使用和检测方法的国家标准。该标准主要规定了核糖核酸酶的质量要求、检测方法、使用方法等内容。以下是AGB/T35543-2017标准的一些重点内容：

核糖核酸酶的纯度应达到一定的要求。
核糖核酸酶的活性应在一定范围内。
使用核糖核酸酶时应注意其缓冲液的选择和反应条件的控制。
检测核糖核酸酶的方法主要包括凝胶电泳、比色法、荧光法等。

根据AGB/T35543-2017标准，我们在实验室中使用核糖核酸酶时需要严格按照相关规定进行操作，以确保实验结果的可靠性和有效性。

4. 结论

在分子生物学领域中，核糖核酸酶是一种非常重要的酶类。通过对RNA分子的剪切、修饰和解析等过程，核糖核酸酶发挥着重要的生物学功能。而AGB/T35543-2017标准则为我们提供了使用核糖核酸酶时的具体操作规范，有助于提高实验的可靠性和有效性。