牛猪肝肾和肌肉组织中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚残留量的测定液相色谱-串联质谱法

牛猪肝肾和肌肉组织中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚残留量的测定液相色谱-串联质谱法

国家标准 GB/T20766一2006 牛猪肝肾和肌肉组织中玉米赤霉醇 玉米赤霉酮、己烯雌酚、己炕雌酚、 双烯雌酚残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Methodfordeterminationofzearalanol，zearalanone diethylstilbestrol，hexestrolanddienoestrolmulti-resides inbovineamdequinelier，kidnesy andmuscle- LC-MS-MSmethod 2007-03-01实施 2006-12-31发布 国家质量监督检验检疫总局 发布 中 国国家标准化管委员会国家标准
GB/T20766一2006 前 言 本标准的附录A和附录B为资料性附录 本标准由秦皇岛出人境检验检疫局提出 本标准由国家质量监督检验检疫总局归口 本标准起草单位:秦皇岛出人境检验检疫局、天津出人境检验检 疫局 本标准主要起草人:庞国芳、许泓、林安清、古珑、何佳、张曼 本标准系首次发布的国家标准
GB/T20766一2006 牛猪肝肾和肌肉组织中玉米赤霉醇、 玉米赤霉酮、己烯雌酚、己炕雌酚 双烯雌酚残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 范围 本标准规定了牛猪肝肾和肌肉组织中玉米赤霉醉、玉米赤霉酮,已烯雌酚、己烧雌酚、双烯雌酚残留 量液相色谱-串联质谱测定方法 本标准适用于牛猪肝肾和肌肉组织中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌盼、己婉雌酚、双烯雌酚残留 量的测定 本标准的方法检出限;牛猪肝肾和肌肉组织中玉米赤霉醉、玉米赤霉酮和己烧雌酚为0.54g/kg" 已烯雌酚和双烯雌酚为1.0g/kg 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注目期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度正确度与精密度第1部分:总则与定义 (GB/T6379.1一2004,IsO5725-l;1994,IDT) GB/T6379.2测量方法与结果的准确度(正确度与精密度)第2部分;确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法(GB/T6379.2一2004,IsO5725-2;1994,IDT) GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT66821992,neqIs03696.1987) 原理 试样中残留的玉米赤霉醇、玉米赤霉酮己烯雌酚、己烧雌酚、双烯雌酚用叔丁基甲基和乙酸盐缓 冲溶液加酶解剂分别提取,硅胶固相萃取柱净化后浓缩,用液相色谱-串联质谱仪测定,保留时间和离子 丰度比定性,内标法定量 试剂和材料 除另有说明外,所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水 4.1叔丁基甲基酥:色谱纯 4.2乙酸.优级纯 4.3乙酸钠(CH.cOONa3H,O) 乙酸盐缓冲溶液:0.2mol/LpH=5.2 称取2.72只乙酸(4.2)和12.95g乙酸钠(4.3)溶解于 800mL水中,用氢氧化钠溶液(4.6)调节pH值至5.2士0.1,加水定容至1000mL 4.5氢氧化钠;优级纯 4.6氢氧化钠溶液:3mol/L 称取120g氢氧化钠(4.5)溶于1000ml去离子水中 甲醇色谱纯
GB/T20766一2006 乙睛色谱纯 4. 4.9乙酸乙酯;色谱纯 4.10正己烧色谱纯 4.11二氯甲熔色谱纯 4.12溶解液;正己熔十二氯甲炕(60十40) 量取60mLE己烧(4.10)与40mL二氯甲烧(4.11 混合 4.13淋洗液;乙酸乙酯十正己烧(6十94) 量取6ml乙酸乙酯(4.9)与94mL.正己熔混合 4.14洗脱液:乙酸乙酯十正己烧(60十40) 量取60mL乙酸乙酯与40ml正己烧混合 4.15g葡糖苷酸酶:H-2型,含8葡糖苷酸酶124400units/mL,硫酸酯酶3610units/m 4.16激素及代谢物标准物质;玉米赤霉醇包括a-玉米赤霉醇和g玉米赤霉醇,各50%),纯度 >97%;玉米赤霉酮,纯度>97%;己烯雌酚,纯度>99%;己烧雌酚,纯度>98%;双烯雌酚,纯度 98% 4.17激素及代谢物标准溶液;分别准确称取适量的玉米赤霉醇,玉米赤霉削,己雌酚、双烯雌酚和己 婉雌酚标准物质,用甲醇(4.7)配制成1.0mg/mL标准储备溶液 再根据需要以甲醇配制成不同浓度 的混合标准溶液作为标准工作溶液,保存于4C冰箱中,可使用三个月 4.18内标标准物质;尔代玉米赤霉醉(包括a玉米赤霉醉-4尔代和g玉米赤霉醇-4尔代,各50%),纯 度>99%;己烯雌酚-8爪代,纯度>98% 4.19内标标准溶液;准确称取适量玉米赤霉醇-4尔代和己烯雌酚-8爪代标准物质,用甲醇分别配制 成1.0mg/mL内标标准储备溶液 再以甲醉稀释成与5ng/mL玉米赤酶醉和己烯雕酌峰面积或峰高 相当浓度的混合内标标准工作溶液,保存于4C冰箱中,可使用三个月 硅胶固相萃取柱50o ,3mL 使用前用6mL正己婉分两次预洗硅胶柱，流速均为 4.20 mg,3 4mL/min 4.210,454m滤膜 仪器 5.1液相色谱-串联质谱联用仪;配有大气压化学电离源 5.2分析天平;感量0.1mg和0.01g 5.3自动固相摹取仪或固相萃取装置 5.4高速均质器,转速大于10000r/mim. 5.5氮气浓缩仪. 5.6涡旋振荡器 5.7离心机:转速大于3000r/min. 5.8pH计;测量精度士0.2pH单位 5.9具塞试管;25mL,50mL 10微量注射器;25L.100L 5. 试样的制备与保存 试样的制备 取有代表性样品500g,绞碎后搅拌均匀,制成实验室样品 试样分为两份,置于样品盒中,密封,并 做上标记 6.2 试样保存 制备好的试样置于-18C冰柜保存
GB/T20766一2006 测定步骤 7.1基质混合标准溶液的制备 7.1.1试样的称取 称取5个阴性样品,每个样品为5g(精确到0.01g),置于50ml离心管中,分别加人不同量混合 标准工作溶液(4.17),使玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和己烧雌酚的浓度为1.25ng/ml2.5ng/ml 5.01 ng/ml.,12.5ng/ml.、25ng/ml;已烯雕酚和双尬雕酚的浓度为2.5ng/'ml5.0ng/ml 10ng/mL.25ng/ml..50o /ml 再分别加人适量内标标准溶液(4 19),使内标物浓度均为 ng 10ng/ml. 7.1.2提取 3000 1离心 加人20ml叔丁基甲基献(4.1),在10000r/min转速下高速均质(5.4)1min )，/min (5.7)5min,将上清液全部转移至另一50mL具塞试管(G.9)中备用 离心管中的残渣置于通风橱中 挥发30min,加人15ml乙酸盐缓冲液(4.4),高速均质1min,3000r/min离心5min,将上清液全部 转移至另一25mL具塞试管(5.9)中,并在氮气浓缩仪(5.5)上于40C水浴中吹去残余叔丁基甲基醒 后,加人80L}葡糖苷酸脉(4.15)混匀,于52C烘箱中放置过夜 在此缓冲游液中加人氢氧化钠游 液(L.6)将游液pH值调至7,加人10ml叔丁基甲基脏,充分混合,300, r/nmin离心2nmin 移取叔丁 基甲基醒层与前述的叔丁基甲基鲑提取液混合,在氨气浓缩仪上于40C水浴中吹干 加人1mL溶解 液(4.12),涡旋30s溶解,待净化 7.1.3净化 把样液转人硅胶固相萃取柱(4.20),流速为2mL./min,在样品试管中加人3ml.淋洗液(4.13),混 合后过柱,流速为2nmL/min,用3mL淋洗液以3mL/min的速度淋洗,加人2mL空气以4mL/min 的速度吹过硅胶柱 用6ml洗脱液(4.l4)洗脱,流速为2mL/min,加人2ml空气以6mL/nmin的速 度吹过硅胶柱,收集洗脱液 ，将洗脱液在氮气浓缩仪上于40C水浴中吹干,加人1mL流动相,涡旋 0s溶解 溶液经滤膜(4.21)过滤后,供液相色谱-串联质谱测定 7.2试样溶液的制备 称取待测样品5g(精确到0,01g)于50mL离心管中,加人内标标准工作溶液,使内标物含量均为 2.0g/kg 按7.1.2和7.1.3操作 7.3空白基质溶液的制备 称取阴性样品5g(精确到0.0lg)于50m棕色离心管中,按7.1.2和7.1.3操作 测定 4.1液相色谱条件 色谱柱:ZORBAxEclipseSBC ,3.54m,150mm×4.6mm或相当者; aa bb 柱温;25C; 流动相:乙晴十水(70十30); cc d流速;1.0mL/min 进样量:50L e 7.4.2质谱条件 离子化方式;大气压化学电离 a b)扫描方式;负离子扫描 检测方式:多反应监测(MRM); c 离子源温度;325C 雾化气压力:0.1035MPa; e 气帘气压力:0.0690MPa;
GB/T20766一2006 辅助气压力:0.2415MPa g h)喷雾器电流:一5A 电喷雾电压;一4500V; 定性离子对,定量离子对,碰撞气能量和去簇电压,见表1 表1五种激素及代谢物的定性离子对,定量离子对,碰撞气能量和去簇电压 药物名称 定性离子对(m/e) 定量离子对(m/:) 碰撞气能量V 去簇电压/八 321.1/277.2 -35 一100 玉米赤霉醇 321.1/277.2 321.1/303.2 -35 -100 319.3/205,1 一42 一126 玉米赤霉制 319.3/205.1 -126 319.3/160.9 34 325.1/208.9 -36 -l00 玉米赤霉醇-4尔代 325.1/263. 325.1/263.1 -38 -100 -90 267.0/222. 40 己烯雕酚 267.0/222. 267.0/237.1 40 -90 265.0/221.1 35 -90 双烯婚雕盼 265.0/235. 265.0/235.1 -32 -90 269.0/119.0 22 -75 已烧雌酚 269.0/134.0 269.0/134.0 46 -75 275.1/227.9 一40 -73 己烯雌酚-8尔代 275.1/245.0 40 -74 275.1/245.0 7.4.3液相色谱-串联质谱测定 7.4.3.1定性测定 每种被测组分选择1个母离子.2个以上子离子.在相同试验条件下,样品中待测物质和内标物的 保留时间之比,也就是相对保留时间,与混合基质标准校准溶液中对应的相对保留时间偏差在士2.5% 之内;样品谱图中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的混合基质标准校准溶液谱图中对应的定性 离子的相对丰度进行比较,若偏差不超过表2规定的范围,则可判定为样品中存在对应的待测物 表2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 >50 >2050 >10~20 <10 允许的最大偏差 士20 士25 士30 士50 7.4.3.2定量测定 在仪器最佳工作条件下,基质混合标准溶液(7.1)分别进样,以工作溶液浓度为横坐标,峰面积为纵 坐标,绘制标准工作曲线 采用内标法进行定量测定 样品辫液中玉米赤霉醉.己端雌酌已棕雕附和 双烯雌酚激素的响应值应在工作曲线范围内 在上述色谱条件和质谱条件下,标准物质液相色谱-串联 质谱的多反应监测(MRM)色谱图参见图A.1 本方法的添加回收率数据参见附录B 7.5平行试验 按以上步骤,对同一试样进行平行试验测定 7.6空白试验 除不称取试样外,均按上述步骤同时完成空白试验
GB/T20766一2006 结果计算 试样中被测物的测定结果可由数据处理系统按内标法自动计算,也可按式(1)计算 1000 X- × -c×义是×会x" 1000 式中 -试样中被测物残留量,单位为微克每千克(4g/ke) 基质标准工作溶液中被测物的浓度,单位为纳克每毫升(ng/ml); 试样溶液中被测物的色谱峰面积 基质标准工作溶液中被测物的色谱峰面积 试样溶液中内标物的浓度,单位为纳克每毫升(ng/mL); 基质标准工作溶液中内标物的浓度,单位为纳克每毫升(ng/mlL); 基质标准工作溶液中内标物的色谱峰面积; 试样溶液中内标物的色谱峰面积; 样液最终定容体积,单位为毫升(ml); 试样溶液所代表试样的质量,单位为克(g) 7 注:玉米赤霉醇和己婚雌酚的峰面积或峰高值分别是其两异构体峰面积或峰高值的和 精密度 本标准的精密度数据是按照GB/T6379.1和GB/T6379.2的规定确定的,重复性和再现性的值 以95%的可信度来计算 重复性 在重复性试验条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r,牛猪组织中玉米赤 霉醇、玉米赤霉酮,己烯雌酚、,己婉雌酚、双烯雌酚的含量范围及重复性方程见表3 如果差值超过重复性限,应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定 9.2再现性 在再现性试验条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R,牛猪组织中玉米赤 霉醇、玉米赤霉酮,己烯雌酚,己婉雌酚、双烯雌酚的含量范围及再现性方程见表3 表3含量范围及重复性和再现性方程 化合物名称 重复性限r" 再现性限R 含量范围/gg/kg) 玉米赤霉醇 0.25~5.00 lgr=0.9695lgm一0.7326 lgR=0.8152lgm-0.6343 玉米赤霉酮 0.255.00 lgr=1.1888lgm-0,5939 lgR=1.2064lgm-0.5195 己烯雕盼 0.5010.00 lgr=1.0198lgm一0,8763 lgR=1,0846lgm一0,5621 双烯雕酚 0.5010.00 lgr=0.5401lgm-0.2908 lgR=0.8781lgm-0.2471 己烧雌前 0.255.00 g"=0.9546lgm一0.7379 lgR=0.9088lgm一0,4473 注:m为两次测定结果的算术平均值
GB/T20766?2006 ? A ?? ?ù,?ù???????????? ?ù-4??-8????(NRM)?? ?ù,?ù?,?,,???????ù-4?,? 8?????(MRM)??,?A.1 2.54 ?ù9 321.1/277.2 2.28 ? t/min ?ù a 2.96 ?ù319.3/205.1 t/min b ?ù? 2.54 ?ù-4?325.1/236.1 2.28 t/min ?ù-4? 2.97 3.25 267.0/222. 1/min d ? 2.99 ?269.0/134.0 1/min e ? 2.94 ??265.0/235.l 1/min fD ?? 2.97 -8257.1/245.o 3.25 1/min ?-8? g ?A.1?ù?ù?,?????,????? ?ù-4??-8????(MRM)??
GB/T20766一2006 附录 B 资料性附录 收率 五种激素及代谢物添加浓度及其平均回收率的试验数据,见表B.1 表B.1五种激素及代谢物添加浓度及其平均回收率的试验数据 激素名称 添加浓度/ug/kg 平均回收率/(% 0.5 84.93 玉米赤霉醇 2.5 88.58 5.0 91.35 0.5 76.10 玉米赤霉剩 5 79.18 2 5.0 1o1.00 1.0 80,12 己烯雌酚 5.0 78.67 10.0 102.70 1.0 74.83 双烯雌酌 5.0 93.00 10.0 99.53 0.5 91.33 已炕雌酚 2.5 72.67 5.0 92.47