动物源性饲料中狗源性成分定性检测方法PCR方法

动物源性饲料中狗源性成分定性检测方法PCR方法

国家标准 GB/21105一2007 动物源性饲料中狗源性成分定性 检测方法PCR方法 IdentificationofCanisderivedmaterialsinanimal-originated eedlstufrs一rCRmethoa 2007-10-24发布 2008-04-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管蹬委员会国家标准
GB/T21105一2007 前 言 本标准的附录A为资料性附录 本标准由国家质量监督检验检疫总局提出 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口 本标准起草单位:山东出人境检验检疫局、检验检疫科学研究院、中华人民共 和国辽宁出人境检验检疫局、深圳出人境检验检疫局 本标准主要起草人;高宏伟,梁成珠、王岩、于立新、徐宝梁、陈颖,吴亚君、宗卉、温燕辉、曹际娟 本标准首次发布
GB/T21105一2007 动物源性饲料中狗源性成分定性 检测方法PCR方法 范围 本标准规定了动物源性饲料中狗(Canis)源性成分检测的PCR方法,该检测方法的检出限为 0.1% 本标准适用于动物源性饲料中狗源性成分的定性检测 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14699.1饲料采样(GB/T14699.1一2005,ISO6497:2002,IDT) SN/T1193基因检验实验室技术要求 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 3.1 聚合酶链式反应polymerasechainreaction;CR 用于扩增位于两段已知序列之间DNA(deoxyribonuceleosideaaeid,脱氧核糖核酸)的方法 模板 DNA经过高温变性成单链,在DNA聚合酶和适宜的温度下,两条互不互补的寡核苷酸片段即引物分 别与模板DNA两条链上的一段互补序列发生退火,接着在DNA聚合酶的催化下以4种dNTPde oxyribonueleosidetriphosphate,脱氧核苷酸三磷酸)为底物,使退火引物得以延伸,如此反复变性,退火 和DNA合成这一循环,使位于两段已知序列之间的DNA片段呈几何倍数扩增,经25个30个扩增 循环,扩增倍数达到约10 原理 利用裂解液破碎细胞，三氧甲烧抽提蛋白质,异丙醉沉淀得到DNA;以提取的DNA为模板进行 PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物;PCR阳性产物应用限制性内切酶酶切反应进行确证 试剂和材料 除另有规定外,试剂为分析纯或生化试剂,实验用水符合GB6682的要求 狗源性成分检测用引物(对)序列为: canisF:5’-TCCAGGTAAACCCTTCTT-3” canisR:5’-TACGAGCAAGGGTTGATGG3” 2 5. TaoDNA聚合酶(Taq,Ther" ,水生栖热菌. rm1usaquaticu 限制性内切酶:HhI酶 4 5. dNTP.dATP(doxsysdenosinetriphopharte,脱氧腺苷三磷酸),.dirTP(deoxsythymiadinetriphos
GB/T21105?2007 hate,),dcTP(deoyeytidinetriphosphate,).dGTP(deoyguanosine triphosphate, 5.5?;? 5.6?? 5.7? 5.8 5.970% 5. .10??(100bp2000bp)(bp:basepair , 5.11??;1%cTAB(cetyltrithyla lammoniumbromide,???),0.05mol/I.Tris HClpH8.0)[Tris-;tris(hydroxymethylaminomethane,(??)],0.7mol/LNaCI. 0.01mol/LEDTApH8.0)(ethylenediaminetetraacetieacid,?) 5.12TE?Tris-HClEDTA?);10mmol/LTrisHClpH8.0)1mmol/LEDTA pH8.0) 5.1310PCR?;l00mmol/LKCI,l60mmol/L.(NH,)SO,,20mmol/MgSO,200mmol/L Tris-HClpH8.8),1%TritonX-100(toetylphenoxypolyethoxyethanol,?) albumin,???. mg/mlBSA(bovineserum 5.14??,Tis54g,27.5g.0.5nolLTE?(pHB.0)20ml.?100mlL ??10?? 5.15???;??10mg/mL 55. 16?;0.25%?,40%(?)?? 5. 17?л?;10nnol/LIis-HCl(pH7.5),10nmnmol/1LMgCl,50mnmol/LNa(Cl.0.1mg/mLBSA 豸 6.1DNA?? 6.2????? 6.3?? 6.4?:12000 6.5?? 6.6?? 6.7? pH? 6. .8 6 ?;0.01g ??? GB/T14699.1,??,???á 鲽 8 ?DNA? ?(?100??50mg;60??l00mg;20??200mg)1.5mL ?,600L800l??,6530min,?????;12000?5min;? ???,400L.????(24+1),;120005min,??;0.8 ,;12000g5min,?;70%??,;50AlLTE,? ??ЧDNA????DNA
GB/T21105一2007 8.2DNA浓度和纯度的测定 取5AlLDNA溶液加双蒸水稀释至1mL,使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测 260nm和280nm处的吸光值A和A们 DNA的浓度按式(1)计算: c=A×N×50/1000 式中: DNNA浓度,单位为微克每微升(4g/L); A---260nm处的吸光值; N -核酸稀释倍数 当A/A比值在1.71.9之间时,适宜于PCR扩增 8.3PCR扩增 25AlL的反应体系,在0.2ml的PCR反应管中,引物canisF和canisR各200nmol/L,10×PCR 反应缓冲液，2mmol/I MgCl,200nmol/LdNTPsl.5UTaqDNA聚合酶,l.0Al DNA模板 100ng士50ngDNA) 设立阳性对照、阴性对照、空白对照组 PCR反应条件随仪器不同略有改变，一般的反应程序为94C预变性3min 94C变性45s.56c 退火45s,72C延伸45s,35个循环 72C延伸5min 4C保存 检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照 用已知含狗源性成分的样品作阳性对照,用巴 知不含狗源性成分的样品作阴性对照,用等体积的双蒸水代替模板DNA作空白对照 8.4PCR扩增产物电泳检测 取2g琼脂糖,于100mL电泳缓冲液中加热,充分熔化,加人祺化乙锭贮存液至终浓度为0.5pE/ml. 制胶 在电请帽中加人电冰级冲液,使液面刚刚没过硬胶 将 A一区R扩增产物分别相适量 加样缓冲液混合,点样 9V/em恒压电泳,直至澳酚蓝指示剂迁移至凝胶中部 紫外检测仪下观察电 泳结果并记录 8.5限制性内切酶酶切及产物电泳检测 如果PCR扩增产物电泳检测结果阳性,进行限制性内切酶酶切反应 反应体系(20L);HphI酶2U,酶切缓冲液2l,加人PCR扩增产物至总体积20l 酶切在37C下进行,20nmin 酶切完成后电泳,方法见8.4 结果判断与表述 PCR扩增产物电泳检测结果 9 阳性样品的PCR扩增产物大小为213bp(序列参考附录A) 限制性内切酶酶切结果 9. 2 阳性样品PCR产物采用内切酶HphI酶切后,酶切片段大小为179bp和34bp 9 3 结果表述 PCR产物和酶切产物都为阳性者判为含有狗源性成分,表述为检出狗源性成分 PCR产物为阴性者判为不含有狗源性成分,表述为未检出狗源性成分 10 检测过程中防止交叉污染的措施 按照SN/T1193执行 11 废弃物处理 检测过程中的废弃物,收集后在焚烧炉中焚烧处理
GB/T21105一2007 附录 A 资料性附录 PCR产物测序结果 TCCAGGTAAAcCCTTcTTCCcTcCcCCcTATGTACGTCGTGCATTAATGGTTTGCCCCATGC ATATAAGCATGTACATAANTATTATNTCCTTACATA\GGACATATTAACICAANTCTCATAGT TCACTGATCTGTCAACAGTAATCGAATGCATATCACTTAGTCCAATAAGGGCTTAATCAC CANTGCCTCGAGAAACcATCAACCCTTGcTcGTA