GB/T35904-2018
旋毛虫实时荧光PCR检测方法
Real-timePCRmethodfordetectionofTrichinellaspiralis
- 中国标准分类号（CCS）B41
- 国际标准分类号（ICS）11.220
- 实施日期2018-09-01
- 文件格式PDF
- 文本页数5页
- 文件大小334.15KB
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旋毛虫实时荧光PCR检测方法
国家标准 GB/T35904一2018 旋毛虫实时荧光PCR检测方法 RealtimeCRmethndtrdeeetionfTriehinellaspiralis 2018-02-06发布 2018-09-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/35904一2018 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草
本标准由农业部提出
本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/Tc181)归口
本标准起草单位:东北农业大学、黑龙江出人境检验检疫局
本标准主要起草人;宋铭忻、张子群、李雅丽、韩彩霞、王海燕,李巍、李晓云、路义鑫
GB/35904一2018 旋毛虫实时荧光CR检测方法 范围 本标准规定了旋毛虫实时荧光PCR检测的操作方法
本标准适用于家猪、野猪和犬等动物的旋毛虫核酸检测
规范应引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的
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GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 仪器 3.1荧光PcR仪
3.2高速冷冻离心机
3.3生物安全柜
3.4高压灭菌锅 3.5天平;精密度达0.0lg以上
3.6组织匀浆机
3.7冰箱
3.8涡旋混合器
3.9研钵 3.10无菌离心管
3.11微量移液器
试剂 4.110×PCRBuffer缓冲液(无Mg'+),rTaq酶,dNTP,Mg十等,所有试剂均为生物试剂公司生产
4.2本方法试验用水符合GB/T6682规定的一级水
对照样品 S 5.1阳性对照样品 含有5条/g以上的国际标准种Trichinellaspiralis(T1)或Trichinellanatia(T2)旋毛虫的大鼠 肉样
5.2阴性对照样品 经检测不含有旋毛虫的大鼠肉样
GB/T35904一2018 6 操作区域 样品处理区要有相应的生物安全设施;配液区要求高度清洁;样品处理、加样和检测区应在不同区 域进行,不同区域配备不同的加样工具和用具 样品采集和处理 7.1采样部位 7.1.1家猪 横嗝膜肌脚部、肋间肌、腰肌咬肌、舌肌
7.1.2野猪 前肢肌、膈肌 7.1.3犬 咬肌、舌肌,腓肠肌
7.2样品采集 根据不同种类动物脯体的具体情况,从采样部位各采样一块,记为一份肉样,总质量不少于50g一 100g,与朋体编成相同号码
7.3样品处理 在样品处理区内进行,将肉样去除脂肪、肌膜或腱膜,用剪刀顺肌纤维方向,按随机采样的要求，自 肉上剪取约0.5g肉样10粒,合并成一个小样,并编号
将小样放人组织匀浆机内以3000r/min,捣碎 5s60s,使其彻底匀浆,然后放人含有液氮的研钵中充分研磨,继续进行核酸提取,或置一20C贮存 备用
荧光CR操作程序 8 8.1NA提取 可使用经验证的商品化组织DNA提取试剂盒提取NA
8.2荧光PCR检测 8.2.1引物和探针 旋毛虫实时荧光PCR试剂;采用无DNA酶,无RNA酶的水将每条引物和探针配成100mol/L 储存液,置一20C或更低温度冻存;使用时取适量配置成10mol/几工作液,避免多次冻融
上游引物;5'-TGCAGTcTTAAAGAGAATcCAAccT-3';下游引物;5'-CAAGTTTcGTcTGT TcGAcGATA-3';TaqManMGB探针:5'-FAM-TTGcCGAcGGTTTAAA3'-NFQ-\MGB
8.2.2荧光PCR反应体系 25AL荧光PCR反应体系包括
GB/35904一2018 10×PCR反应缓冲液 2.5L dNTP(2.5mmol/儿 1.5L Mg+25mmol/L 2.4l 上游引物(10pmol/L) 0.,5l 下游引物(10mol/L 0.5l 探针(10mol/L 0.3l rTa酶(5U/AL 0.3l DNA模板 5.0l 12.0丛L PCR用水 每次试验应设标准阳性,阴性和空白对照
标准阳性用阳性对照DNA做模板,标准阴性用阴性对 照DNNA做模板,空白对照用PCR用水做模板
8.2.3 上机检测 8.2.3.1 荧光通道设置 荧光素设定;报告荧光(reportdye)设定为FAM,淬灭荧光(quenchdye)设定为None,校准荧光 referencedye)设定为None
可根据不同品牌仪器说明等效设置参数
8.2.3.2循环条件设置与检测 第一阶段,预变性95C/2min 第二阶段,变性95C/10s,退火、延伸,荧光采集60C/30.s,共40个循环 检测结束后,保存结果,根据收集的荧光曲线和C值判定结果
结果判定 9 9.1质量控制 读取每个样品C值
标准阳性对照有特异性扩增曲线而且C值<30,标准阴性对照和空白对照 无特异性扩增曲线,说明质控合格
以上要求需在同一次实验中同时满足,否则,本次实验无效,需重新 进行
9.2结果描述及判定 9.2.1被检样品有特异性扩增曲线,而且C值<30,判定为旋毛虫核酸阳性
9.2.2被检样品无特异性扩增曲线,判定为旋毛虫核酸阴性
9.2.3被检样品C值在3040之间,而且出现特异性扩增曲线需要重复取样检测,如重复检测的试 验结果C值<40,而且出现特异性扩增曲线,判定为旋毛虫核酸阳性;否则,判定为旋毛虫核酸阴性
GB/T35904-2018旋毛虫实时荧光PCR检测方法
旋毛虫是一种常见的水生寄生虫，对于水产养殖业来说，其危害极大。如何及时、准确地检测旋毛虫成为了水产养殖行业亟待解决的问题。而GB/T35904-2018认证标准提出了实时荧光PCR检测方法，为水产养殖业提供了更为准确和科学的解决方案。
旋毛虫实时荧光PCR检测方法主要包括样品处理、DNA提取、PCR扩增和信号检测等步骤。该方法的优点在于高度特异性、灵敏度和精度，并且可快速完成检测，节省了时间和成本。
除此之外，GB/T35904-2018认证标准还规定了实验室环境、设备和试剂等方面的要求。例如，实验室应具有相对独立的空间，并且应该定期进行消毒和洁净化处理；试剂和仪器设备需要符合相关标准，并且在使用前应该进行符合性检查。
总之，GB/T35904-2018认证标准提出的旋毛虫实时荧光PCR检测方法为水产养殖业提供了更为科学和权威的检测手段。企业应该积极引进和应用该技术，以确保产品的质量和安全。
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