GB/T37226-2018
法庭科学人类荧光标记STR复合扩增检测试剂质量基本要求
CriterionofforensicsciencehumanfluorescenceSTRmultiplexamplificationreagent
- 中国标准分类号（CCS）A92
- 国际标准分类号（ICS）13.310
- 实施日期2018-12-28
- 文件格式PDF
- 文本页数12页
- 文件大小840.38KB
以图片形式预览法庭科学人类荧光标记STR复合扩增检测试剂质量基本要求
法庭科学人类荧光标记STR复合扩增检测试剂质量基本要求
国家标准 GB/T37226一2018 法庭科学人类荧光标记STR复合扩增 检测试剂质量基本要求 CriterionofftorensicseieneehumanluoreseeneeSIRmultiplex amplifieationreagent 2018-12-28发布 2018-12-28实施 国家市场监督管理总局 发布 币国国家标准化管理委员会国家标准
GB/37226一2018 目 次 前言 范围 2 术语和定义 3 技术要求 检测方法 标识,包装与运输、贮存 附录A资料性附录9947A阳性对照分型结果 参考文献
GB/37226一2018 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草
请注意本文件的某些内容可能涉及专利
本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本标准由全国刑事技术标准化技术委员会(SAC/Tc179)归口
本标准主要起草单位:公安部物证鉴定中心 本标准参加起草单位;广州市公安局北京市公安局、辽宁省公安厅、上海市公安局、公安部刑事技 术侦察局、天津市公安局
本标准起草人:葛百川、叶健、刘超、刘雅诚、姜先华、赵兴春、周怀谷、张庆霞、王海欧、国金枝、白雪
GB/37226一2018 法庭科学人类荧光标记STR复合扩增 检测试剂质量基本要求 范围 本标准规定了法庭科学人类荧光标记STR复合扩增检测试剂(以下简称“试剂”)的技术要求、检测 方法、标识,包装、运输和贮存
本标准适用于法庭科学领域使用的人类荧光标记STR复合扩增检测试剂生产,使用和质检机构， 其他领域使用“试剂”可参考采用本标准
术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 2.1 短串联重复序列shorttandemrepeat;STR 存在于人类基因组DNA中的一类具有长度多态性的DNA序列,其核心序列一般由2个一6个碱 基构成由于核心序列重复次数的不同致个体间存在差异
2.2 基因座loeus 染色体上基因所占的位置或基因组DNA中的一段
2.3 聚合酶链式反应polymeraseehainreaetiom;PCR -个酶促的特定DNA片段体外扩增过程
人类荧光标记STR复合扩增检测试剂humanfuorescentSTRmultiplexamplirieationreagent 利用聚合酶链式反应(PCR)技术和荧光标记检测技术,能同步对人类DNA样本多个STR基因座 2.2)进行复合扩增并得到sTR基因座分型,用于检验人类样本STR基因分型的一系列试剂
2.5 常规试剂generalreagent 以提取的生物样本DNA为模板,通过PCR(2.3)反应,获得STR分型的一类法庭科学人类荧光标 记sIR复合扩增检测试剂(2.4)
2.6 直接扩增试剂DirectPCR reagent 直接在PCR(2.3)反应体系中使用含有血液(斑),唾液(斑)的生物样本,使样本在反应体系中释放 DNA,获得STR分型的一类法庭科学人类荧光标记sTR复合扩增检测试剂(2.4)
注:直接扩增试剂应于试剂外包装上标注“直接扩增”字样
2.7 分型准确性 Veracity 试剂检测阳性DNA对照样本分型结果与规定分型结果的符合程度
GB/T37226一2018 2.8 稳定性 stabilit S 试剂在保质期和规定的储存、运输条件下能够保持产品品质不发生改变 2.9 灵敏度sensibilty 在推荐条件下试剂成功检出所含全部基因座(2.2)DNA分型的最小DNA样本量
2.10 mixture 引物混合物primer -定数量的标记和未标记荧光的寡核苷酸引物按一定浓度比例进行混合的溶液
2.11 0sitivecontroDNA 阳性DNA对照样本 S 已知浓度和分型的人类DNA样本
2.12 等位基因分型对照物allelicladder 试剂中所有基因座(2.2)的常见等位基因的混合物
2.13 内标intermallanesizestandard -系列已知分子量大小,标记特定荧光的DNA片段混合物,作为计算同一泳道内的DNA片段分 子量大小的依据
2.14 荧光染料校正物dyematrix 不同荧光染料标记的一组DNA片段,能为试剂提供相应的荧光光谱校正
2.15 相对荧光单位relativeluorescenceunit;RFU 在给定的阔值之上的荧光信号强度
2.16 均衡性balance 同一基因座(2.2)杂合等位基因间、同一荧光标记的各基因座(2.2)之间以及不同荧光标记的基因 座间分型峰高之间的比值,以低值与高值之比的百分数表示
2.17 伪峰artifact 由于DNA分析过程中不可避免的技术缺陷而造成的,电泳后存在的一些不代表DNA片段的假 象峰 3 技术要求 3.1试剂成分 3.1.1引物混合物 无可见杂质,体积应与试剂标识相一致
3.1.2PCR缓冲液 无可见杂质,体积及浓度应与试剂标识相一致
GB/37226一2018 3.1.3DNA聚合酶 浓度、体积活性、纯度等应与试剂标识相一致,无可见杂质
3.1.4等位基因分型对照物 等位基因分型对照物技术要求包括 等位基因分型对照物应包括常见等位基因,按说明书推荐的方法检测得到的分型与其描述的 a 完全一致,图谐清晰; 每个等位基因分型的峰高大于200相对荧光单位; b 每个基因座第一个峰高与第二个峰高的比例应大于50%以上,各等位基因峰高均衡性在20% 以上,所有等位基因分型对照物应在规定范围之内; 每个基因座的相邻两个等位基因间片段差应在预期的范围 d e 相邻两个基因座间不应有等位基因分型间的重叠; fD 经软件分析,等位基因分型对照物和阳性DNA对照样本不会产生错误的基因分型; 在等位基因范围内出现的非等位基因应低于相邻等位基因峰高的20%
g 3.1.5 内标 内标经检测分析后所含有的条带应清晰明确,片段数量与说明书上描述的完全一致,与重复检验的 等位基因分型对照物间标准偏离应介于士0.2bp之间
同时要求内标中每个DNA片段的峰高大于 200相对荧光单位
3.1.6荧光染料校正物 所有基因座和内标在应用荧光染料校正物进行光谱校正条件下,峰高在2500相对荧光单位以下， 不出现高于50相对荧光单位的荧光渗透
3.1.7阳性DNA对照样本 阳性DNA对照样本的浓度和DNA分型应与说明书(参见附录A)上的描述完全一致 3.2试剂性能 3.2.1种属特异性 试剂检验常见动物如;马、狗、猪、牛,羊、猫、,鸡、鸭、鼠兔、鱼)和细菌如;大肠杆菌),在分型范围 内,不出现特异的DNA分型
3.2.2分型准确性 试剂检验阳性DNA对照样本,分型应与厂商说明书(参见附录A)上的描述完全一致
3.2.3灵敏度 常规试剂在加人阳性DNA对照样本量低至0.125ng时,应能检出全部sTR基因座分型
直接扩增试剂加人阳性DNA对照样本量低至0.5ng时,应能检出全部STR基因座分型
在推荐 条件下,对滴在实验滤纸上的血样,取直径为1.2mm的圆片,应能检出全部STR基因座分型
3.2.4适应性 常规试剂应对血液(斑),精液(斑),唾液(斑),脱落细胞、各种组织、带毛囊(根)的毛发等常见生物
GB/T37226一2018 检材进行准确的分型
直接扩增试剂应能直接扩增检验含有血液(斑),唾液(斑)等常见生物样本并得到准确分型
3.2.5耐受性 对有降解、含有一定量抑制因素的DNA样本,试剂应具有一定的稳定性 3.2.6一致性 -致性要求包括: a 在不同的试验条件下(人员.检测设备变化),对同一样本进行重复性检验,其分型结果应一致; b) 对已知分型的同一批样本检验时,人类荧光标记sTR复合扩增试剂分型结果与已知分型无显 著差异
3.2.7均衡性 均衡性要求包括 a 对阳性DNA对照样本进行检测,当模板量为试剂推荐的最佳用量时,根据DNA检测分型的 峰高,杂合等位基因间的均衡性比值不小于70% b)同一荧光标记物的不同基因座之间的均衡性不小于50% 不同荧光标记物间的均衡性不小于30%
c 3.2.8 反应条件的验证 用阳性DNA对照样本,按试剂推荐的反应体系、扩增循环数、退火温度、延伸时间,DNA聚合酶用 量、引物量、缓冲液浓度等条件进行检验,达到厂商说明书(参见附录A)明示的分型效果
3.2.9混合样本 常规试剂当模板DNA总量为1ng时,对两个单一DNA样本的不同浓度比例进行混合检测,混合 比例为1;4时,应能准确检出两个样本的每个基因座的基因分型
本条不适用于直接扩增试剂
3.2.10稳定性 稳定性要求包括 有效期内的试剂在厂商推荐的保存温度环境下,分型结果不受影响; a b) 将试剂在有效期内反复冻融,冻融N/20次(N为试剂的人份数,N>20),不影响分型结果 不出现信号高于50相对荧光单位的随机伪峰
3.2.11批间差 抽查不同批次的产品,对一定数量的检材进行检验,所有样本的分型结果应完全一致;不同批次间 的内标、等位基因分型对照物应一致 检测方法 4.1样品制备 4.1.1阳性DNA对照样本 4.1.1.19947A,10ng/ML
GB/37226一2018 4.1.1.29948.,10 ng/Ala 4.1.1.3阳性DNA对照样本的定量;按照AB7500操作手册对被测样本进行检测,每个样本平行操作 三次,取均数作为最终测试结果
4.1.1.4根据测得浓度将9947A稀释,使其终浓度分别为1.0ng/L,0.5ng/L、0.25ng/L 0.125ng/AL、0.0625ng/L,分别编号为AlA5;稀释9948,使其终浓度为1.0ng/AL,编号为A6.
稀释后样品4C放置备用
4.1.1.5混合样品制备:将4.1.3及4.1.4中浓度为1.0ng/l的两个样品按19:1、18;2、16:4、 14:6、12:8、10:10,8:12,6:14、4:16、2:18、1:19的比例进行混合,依次编为B1B11号,4C 放置备用
4.1.2种属特异性检测样本 4.1.2.1马、狗、猪、牛,羊,猫,鸡、鸭、鼠,兔,鱼DNA样品
根据说明书稀释为1.0ng/AL,分别编号为 ClC1l,4 笔放置备用 4.1.2.2大肠杆菌DNA样品
根据说明书稀释为1.0ng/AL,编号为C12.4C放置备用 4.1.3适应性及一致性所需常规检材 4.1.3.1取已知分型的血斑(D1、D2)、精斑(D3、D4),唾液斑(D5、D6)脱落细胞(D7、D8)、各种组织 D9、,D10、带毛囊(根)(D11、D12)的毛发、软骨(D13、,D14)各2份,分别用GA/T383一2014中Chelex 法提取DNA,编号见括号,4C放置备用
4.1.3.2取4.1.3.1中血斑(D1),、精斑(D3)肌肉组织(D9),软骨(D14)和烟蒂(D5)DNA,分别由两名工 作人员,在两台扩增仪和基因分析仪上进行扩增和分离
4.1.3.3取已知分型的数据库DNA样本88个96孔板1板),编号为F1~F88,4C放置备用 4.1.4降解样本 编号为E1
取4.1.1.4中浓度为1.0ng/L的9947A样品17L与1LAluIDNA内切酶及 3L
酶切缓冲液,2AL
BSA混合,37C水浴放置60min,再加l4lHaeDNA内切酶,两种酶切缓 冲液各2L混合.37C水浴放置60min
反应液用IQ或Qigen试剂盒纯化
浓缩到2L进行PCR 反应 含抑制因素的样品 4.1.5 4.1.5.1靛蓝;编号为E2
0.1%靛蓝1L与4.1.1.4中浓度为1.0ng/aL的9947A样品10AL
4.1.5.2血红素;编号为E3-1、E3-2、E3-3、E3-4
在模板为1.0ng9947A的标准PCR反应体系中,分 别加人血红素,使其终浓度分别为5mol/L,10mol/L,20mol/L、40mol/L,观察扩增结果
使用ABI7500型荧光定量PCR仪对DNA进行抑制因素分析
4.1.5.3 4.2试剂成分检验 4.2.1体积检测 检验方法;根据试剂说明书,使用移液器吸取各试剂组分 4.2.1.1 4.2.1.2判别规则:各试剂组分体积不低于说明书含量,判定为合格
4.2.2荧光标准物检测 4.2.2.1检验方法;按照说明书推荐的标准用量,将试剂配套的荧光染料校正物(dyeMatrix)进行混
GB/T37226一2018 合,在两台序列分析仪上各电泳检测16道matrix混合物
按照说明书要求,应用生成的matrix文件 分析等位基因分型标准物及分子量标准
4.2.2.2判别规则:所有基因座和分子量标准在应用荧光标准物进行光谱校正条件下,峰高在2500相 对荧光单位以下,不出现高于50相对荧光单位的荧光渗透,判定为合格
4.2.3分子量标准检测 4.2.3.1检验方法;按照说明书推荐的标准用量,在两台序列分析仪上与同一等位基因分型标准物共同 电泳检测各三次,观察内标电泳图谱
4.2.3.2判别规则;内标所含有的条带应清晰明确,片段数量与说明书上的描述完全一致;与重复检验 的等位基因分型标准物间标准偏离应小于士0.2bp;同时要求内标中每个DNA片段的峰高大于200相 对荧光单位,单独电泳检测内标,不出现非特异性谐带
同时符合以上三项判定为合格
4.2.4等位基因分型标准物检测 4.2.4.1检验方法;按照说明书推荐的标准用量,在两台序列分析仪上分离等位基因分型标准物及阳性 er软件分析得到分型结果
DNA对照样本,各检测三次,并应用Genemappe 4.2.4.2判别规则:等位基因分型标准物应包括人群中常见的等位基因,检测图谱清晰,分型与说 明书上的描述完全一致;每个等位基因分型的峰高大于200相对荧光单位,每个基因座第一个峰高与第 二个峰高的比例应大于50%以上,各等位基因峰高均衡性在20%以上,所有等位基因分型标准物应在 规定范围之内;每个基因座的相邻两个等位基因间片段差应在预期的范围;相邻两个基因座间不应有等 位基因分型间的重叠;经软件分析,等位基因分型标准物和阳性DNA对照样本不会产生错误的基因分 型;在等位基因范围内出现的非等位基因应低于相邻等位基因峰高的20%
判定为合格
4.2.5阳性DNA对照样本检测 4.2.5.1检验方法;按照说明书推荐的标准用量,对DNA阳性标准物分别进行2次扩增,每次扩增产 物在两台序列分析仪上电泳检测,Genemapper软件分析得到分型结果
4.2.5.2判别规则;阳性标准物的分型及峰型与说明书上的描述完全一致,同时不出现非特异性谱带 判定为合格
4.3试剂性能检测 4.3.1扩增 按照说明书推荐的标准扩增体系,使用4.1.2.1中制备的模板DNA,其中除C1C12模板量为5. 其余均为1;同时扩增2个阳性DNA对照样本和2个阴性对照样本 4.3.2检测 扩增产物在3130XL序列分析上按照产品说明书的电泳分离条件进行电泳分离,使用Genemapper 软件分析得到分型结果
4.3.3结果判定 4.3.3.1种属特异性检测:Cl~C12模板在分型范围内,不出现特异的DNA分型,判定为合格
4.3.3.2准确性检测:2个阳性对照DNA样本的分型与说明书上的描述应完全一致,这些STR基因 座的等位基因的碱基数与l.adder相应基因座的碱基数的偏差,差别应小于士0.5bp,否则为不合格
GB/37226一2018 4.3.3.3灵敏度检测;将Genemapper中各颜色分析值设为50rfu相对荧光单位),以分型结果未发 生基因座丢失现象的最低模板量作为试剂盒的检测灵敏度
当模板为A4时,应在全部STR基因座上 都能检验出该样本的明确分型而无基因座丢失现象,否则为不合格
4.3.3.4不同检材的适应性检测:D1~D12全部基因座均能得到分型结果,各等位基因峰高均在100相 对荧光单位以上,否则为不合格
.3.3.5耐受性检测E1分型结果,小于200p的基因座均能得到分型结果,各等位基因峰高均在100 相对荧光单位以上,否则为不合格
E2E4根据定量结果分析试剂检验此类模板的能力
-致性检测:D1,D3,D5、,D9、,D14样本由不同检验人员、使用不同的扩增仪和测序仪进行检验 4.3.3.6 结果应具有一致性,否则为不合格
F1~F88分型结果与已知分型无显著差异 4.3.3.7峰值均衡性检测;分析两次阳性DNA对照样本结果,同一基因座中等位基因中低峰的峰值除 以高峰的峰值为基因座内部等位基因间的均衡性;将同一颜色中的杂合基因座的两个峰值取平均值,纯 合基因座的峰值除以2
再将各个基因座所得的值进行比较,选出其中的最大值和最小值,并用最小值 除以最大值,代表同一标记物的不同基因座之间均衡性;将某一荧光标记的基因座中杂合基因座的两个 峰值取平均值,纯合基因座的峰值除以2,将各个基因座所得的值取平均值,与另一荧光标记的该平均 值进行比较,用较小值除以较大值,代表不同标记物间的均衡性
等位基因间的均衡性应大于70%,同一标记物的不同基因座之间的均衡性应大于50%,不同标记 物间的均衡性应大于30%,否则为不合格
4.3.3.8反应条件的验证;分析阳性DNA对照样本分型结果,达到厂商说明书明示的分型效果,为 合格
4.3.3.9混合样本检测,B3~B9样本能准确判断两个DNA样本的每一个基因分型,即认为合格
稳定性检测;将试剂反复冻融N/20次(N为试剂盒的人份数)
每次在一20C冷冻3h以 4.3.3.10 上,取出室温融化,用检测阳性DNA对照样本,观察分型结果
试剂反复冻融N/20次内,阳性DNA 对照样本的结果应无明显变化,否则为不合格
4.3.3.11批间差检测;检测内标的批间差,将各批内标两两混合,电泳分离后在Rawdata窗口观察内 标间的重叠性
检测L.adder的批间差,将各批L.adder两两混合,电泳分离后Genemapper软件分析得 到分型结果,观察l.adder间的重叠性
内标各条带完全重叠,无双头峰出现,否则为不合格
L.adder 各带完全重叠,无双头峰出现,否则为不合格
标识,包装与运输、贮存 5.1标识、包装 标识,包装应符合以下要求 a 产品标识应包括试剂名称生产批号,试剂规格、生产日期与有效期、贮存环境、生产厂家; b包装完整,表面整洁; 试剂各组分应封装严密; c d)产品应提供质量合格证明、产品说明书;产品说明书中应包括详细的产品信息,包括试剂的组 成、用量、用法,储存、注意事项等 包装盒内所包含的组分与包装盒上的标识相符合
5.2运输、贮存 运输、贮存应符合以下要求 运输应使用干冰或其他冷冻物品冷藏,运输过程中防止受压 a b 产品应贮存在产品说明书标识的贮存环境内
GB/T37226一2018 附 录 A 资料性附录) 9947A阳性对照分型结果 9947A阳性对照分型结果见表A.1
表A.1DNAIyper19M试剂盒9947A分型结果 基因座 9947A分型 Ameogenin X,X D5S818 1l,ll 21s1 30,30 D7S820 10,1m CSF1PO 10,12 D2S1338 19,23 D3S1358 14,15 vwA 17,18 D8S179 13,13 1,12 D16S539 E 2,13 Penta TPOX 8,8 TH01 8,9.3 D19S433 14,l5 D18S51 15,19 FGA 23,24 D6S1043 12,18 D13S317 l,11 D12S391 18,20
GB/37226一2018 考文 参 献 GA/T382一2014法庭科学DNA实验室建设规范 [[2]GA/T3832014法庭科学DNA实验室检验规范 [3]GA469一2004法庭科学DNA数据库选用的基因座及其数据结构 [4打DNArecommendations1992reportconcerningrecommendationsoftheDNAcommissionof theinternationalsoeietryforforensichaemogeneiesrelatingtotheuseofPCRbasedpolymorphisms. DNAcommissionlInternational LegalMedicine,1992,105(1):63-64 [5" DNArecommendationsfurther commmissionoftheISFH ardng" the ofthe regat useofshorttandemrepeat 1997，87;179-184. Sc1encelnternat1onal [6DNAcommission Forensic. lnternationalSociety Genetics;Recommendations theinterpretationofmixturesForensicSciencelnternational,2006. 160:90-101. DevelopmentalValidationofaSingle-TubeAmplificationofthe13CODISSTRLoci， D2S1338，D19S433，andAmelogenin:TheAmpFISTRldentifiler?PCRAmplificationKitJFo rensicSci，2004，49,
No. [8]DNAAdvisoryBoardQualityAssuranceStandard、forForensicDNATestingLaboratories FederalBureauofInvestigation2000QualityassurancestandardsforforensicDNAtestinglaborato ies，ForensicSeienceCommunications. RevisedvalidationGuidelinesScientifcworkingGrouponDNAAnalysisMethods(SwG [9 DAM). StandardsandGuidelinesSeientificworkingGrouponDNAAnalysisMethods(swG [10] DAM). [l1]Validationofa16-LoeusFluorescentMultiplexSystem*JForensicSei,July2002，47 4 No. [12]ValidationofSTRSystemsReferenceManual美国Promega公司.
法庭科学人类荧光标记STR复合扩增检测试剂质量基本要求GB/T37226-2018
STR（Short Tandem Repeats）是一种常见的DNA多态性标记，已广泛应用于人类个体识别、亲子鉴定以及犯罪现场物证鉴定等方面。STR复合扩增检测试剂是一种用于扩增和检测STR位点的试剂盒。与传统的RFLP技术相比，STR复合扩增检测试剂具有更高的灵敏度和特异性。
GB/T37226-2018是中国国家标准化委员会制定的一项关于人类荧光标记STR复合扩增检测试剂质量基本要求的标准。该标准对所需试剂、设备和操作流程进行了详细规定，大大提高了STR复合扩增检测试剂的质量和可靠性。
在使用STR复合扩增检测试剂时，需要注意以下几点：
- 保证样品质量，避免外源性DNA的污染
- 控制PCR反应条件，防止假阳性或假阴性结果的出现
- 选择适当的电泳条件，保证STR片段的分离和检测的准确性
- 按照GB/T37226-2018标准的要求操作，严格执行每一个步骤
总之，人类荧光标记STR复合扩增检测试剂是法庭科学中不可缺少的一项技术手段。符合GB/T37226-2018标准的测试剂能够保证其质量和可靠性，为刑事案件的侦查、鉴定和审判提供有力的支持。
