GB/T29589-2013
香菜腐烂病菌检疫鉴定方法
DetectionandidentificationofMycocentrosporaacerina(Hartig)Deighton
- 中国标准分类号（CCS）B16
- 国际标准分类号（ICS）65.020.01
- 实施日期2013-12-06
- 文件格式PDF
- 文本页数9页
- 文件大小435.24KB
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香菜腐烂病菌检疫鉴定方法
国家标准 GB/T29589一2013 香菜腐烂病菌检疫鉴定方法 DetetonandidentifteationfMyeoeentrsporaaeina(Hartg)Deiehton 2013-07-19发布 2013-12-06实施 国家质量监督检监检疫总局 发布 国家标准花管理委员会国家标准
GB/T29589一2013 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草
本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口
本标淮起草单位北京出人境检验检疫局、山东出人境检验检疫 局、云南农业大学 本标准主要起草人:种巅、王英超、邵秀玲,赵汗青、庞国兴、江丽辉、李建勇,刘云国、高文娜、刘云龙、 纪琪、何永宏
GB/T29589一2013 香菜腐烂病菌检疫鉴定方法 范围 本标准规定了香菜腐烂病菌的检疫鉴定方法
本标准适用于香菜、胡萝卜、元葱、杜鹃花等经济作物和观赏植物中香菜腐烂病菌的检疫和鉴定 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的
凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件
凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 sN/T1157进出境植物苗木检疫规程 进出境植物种子检疫规程 SN/T1809 香菜腐烂病菌基本信息 中文名;香菜腐烂病菌 学名.MN ycocentrosoraacerina(Hartig)Deighton,1972
异名:Cerco Hartig,1880;Cere rosporaoh/seniNeergaard,1942;Ansatos" 0raaceri7na oraacro Newhall,1944
spore 病害英文名 carawaystemrot 属于真菌界Fungi,半知菌亚门Duteromycotina,丝抱纲Hlyphomycetes,丝袍目Hyphomycetales,暗色 菌科Dematiaceae,菌刺抱属Myce enrOsbor
通过惑病种子远距离传播
香菜腐烂病菌的其他信息参见附录A 方法原理 经现场查验,实验室分离培养根据病原菌的形态特征,生物学特性,结合寄主范围进行结果判定
仪器 5.1生物显微镜(具油镜镜头),具透射光源的体视显微镜(最大放大倍数不低于50×). 5 超净工作台
5.3电子天平
5.4光照恒温培养箱 5.5酒精灯. 5.6高压灭菌器 5.7培养m 5.8医用注射器(10mL)及针头(18号
GB/T29589一2013 5.9医用手术剪、锻子
55. 10烧杯(500mL)
55 .11试管(直径12mm 5. ..12载玻片,盖玻片
5. 13量简(500mL)
55. 14无色透明塑料袋 5. .15血球计数器
主要试剂 蒸水、PDA培养基、1%次氯酸钠或70%乙醉
现场检测 7.1抽样方法 棋盘式、五点式或随机抽样
7.2抽样数量 7.2.1种子 对来自香菜腐烂病菌发生国家和地区(参见附录A)的香菜,胡萝卜,芹菜等植物种子按SN/T1809 进行抽样 7.2.2整株植物或插枝 对芹菜,胡萝卜,杜鹃花等经济作物和观赏植物按SN/T1157进行抽样
7.3症状检查 对芹菜、胡萝卜、杜鹃花等经济作物和观赏植物或插枝,注意检查植株茎部上是否有腐烂和茎科枯 萎死亡等症状,对于种子观察是否有腐烂等症状;收集上述可疑植物材料等一并带回实验室检验 实验室检测 分生袍子的直接镜检观察 对于有腐烂和茎秆枯萎死亡等症状的芹菜、胡萝卜,杜鹃花等经济作物和观赏植物或插枝,以及有 腐烂等症状的种子,直接挑取症状上的霉状物镜检观察
单袍分离获得纯培养
8.2种子上病菌的分离和纯化 种子在1%次氯酸钠(有效浓度)中浸泡10min,然后倒去多余的溶液
后用无菌水洗34次
每 个培养皿中放三张9.0cm滤纸,并用无菌水浸透,倒去多余的水
在无菌条件下,在每个培养皿的滤纸 上均匀地摆放10一50粒种子,种子之间的距离最少应有20mm,间隔要均匀，一般每批次最少做400粒种 子
20下,12h的黑暗与12h近紫外光照交替培养8d一10d
培养皿在光管下约25cm处,不要重 叠
用肉眼或在解剖镜下挑取可疑菌落,获得纯培养
GB/T29589一2013 3 8. 植株上病菌的分离和纯化 选取可疑病斑,用1%次氯酸钠或70%乙醉表面消毒30s左右,用无菌解剖刀在样品病健交界处 挑取2 mmX2mm病健交界组织若干块,将组织置于1%次氯酸钠或70%乙醉处理的无菌平皿中 5 一l10 min,移人无菌水中洗三次,最后放置于PDA培养基(直径:7.5cm)平板上,每平板放置 min 5点,重复放置三块平板,20C25C下培养2d4d后用灭菌挑针挑取组织块边缘的菌丝,将其转移 至PDA上纯化3次获得纯培养
8 病原鉴定 8.1、8.2和8.3获得的纯培养,在温度为20C、室内光照条件下培养病原菌,观察其菌落形态、颜 色,色素,采用菌块切割保湿培养方法(见附录B)诱导分生袍子产生,观测其袍子大小,着生方式以及附 属丝的有无,综合以上进行鉴定
5 8. 致病性测定 按照附录B的方法进行接种试验
鉴定特征 9.1形态特征 9.1.1 镜检观察 将有症状病斑的种子和植株放在显微镜下观察分生抱子和分生抱子梗:分生抱子梗短菌丝状,上部 屈膝状,并具有宽而平的袍痕,淡色,通常不分枝,多无隔膜,少数具有12个隔膜,单生或35根丛 Am)
分生抱子单生、顶侧生,倒棍棒形,具长喙,长喙基部平截,淡 生,(18pm一65pm)x(4pm~10 褐色,(49m一260m)x(6m15m),424个隔膜,隔膜处微突起(参见附录C)
少数袍子具有 1l504m×2 一个从基部细胞侧生出的刺状附属丝,(25 2m一34m)
未发现有性阶段
5Am" 9.1.2培养观察 7 在PDA培养基上培养,菌丝宽4m" Am,后期菌丝胞壁加厚,形成念珠状串生的褐色厚垣袍 子,厚垣袍子长椭圆形或矩圆形,(15m一30Mm)×(15m~20m)
在人工培养基上不易产生分生 抱子,采用菌块切割保湿培养方法可获得分生抱子
9.2培养特征 在PDA培养基上培养在全黑暗的条件下菌丝的生长速度最快,其颜色最初呈白色,以后逐渐变 成黑色,无玫瑰红色素的产生
光照条件下菌落初期无色,48h后变为紫红色或玫瑰红色色素可扩散 到基质里,随菌龄增长菌落中央变为灰色直至最后变为黑色
9.3致病性测定 番茄症状;病斑初期水溃状,后变为浅褐色,病斑近圆形,随后病斑合并腐烂
叶柄和枝柄受害 呈暗褐色水溃状缢缩,病斑长梭形,脱落;茎秆受害后病斑变褐折垂
病斑表面生稀疏白色霉层 9.3. 2 胡萝卜接种症状:初期水溃状,后变为浅褐色,最后变为黑色
致病菌的再分离和鉴定:用接种发病的叶片作常规病组织分离,获得的分离菌与原接种菌形态 特征相同
镜检观察在患病组织上可产生较多的分生抱子,特征与8.1描述的特征一致
GB/T29589一2013 10 结果判定 如现场检疫症状,分离物的形态特征,培养特征,致病性特征及再分离菌株的形态特征与7.3,第9 章所述鉴定特征吻合,可判定为香菜腐烂病菌
11 菌种的保存 分离并最终鉴定为香菜腐烂病菌的菌株应转接到试管斜面上，经登记和经手人签字后置于4C左 右冰箱中保存,并定期(30d一604)转管,防止因斜面干燥而造成病原菌死亡
菌株至少需保存6个 月,保存期满后,需经灭菌处理
GB/T29589一2013 附 录A 资料性附录 香菜腐烂病菌相关资料 A.1致病性 在低温高湿条件下引起蔬菜和观赏植物病害,如胡萝卜根腐病、芹菜冠腐病、欧防风溃疡病、报春花 根腐病等
A.2地理分布 A.2.1亚洲:日本,印度尼西亚、(辽宁省新宾县,清原县、风城县、桓仁县,本溪县和云南省文山州. A.2.2欧洲:法国、丹麦、荷兰、挪威、英国、德国、奥地利、保加利亚、捷克
.2.3大洋洲;澳大利亚、新西兰
A， A.2.4北美洲:美国、加拿大
A.3寄主范围 香菜腐烂病菌的寄主范围相当广泛,寄主植物已达25科50属61种,其中自然感病寄主16科 27属32种
涉及经济价值较高的经济作物和观赏植物有:伞形科中的胡萝卜Dan rot)、芹菜 acscarr Apiumgraveolens),欧防风Pasinacsalivu、 香菜HerbaCoriandri),百合科的洋葱(Aliu ycobersiconesculentum，豆科的菜豆Phaseoluusulgaris ceba a),茄科的番茄(L 藜科的甜菜(Bea ulguris),十字花科的花椰菜(Brascaoleraeea),菊科的莴苣(Lac'wa.saiua),矢车菊(Cenaureucyw 翠菊(Callistehuschinensis),秋海棠科的四季海棠(Begoniasemperflorens),报春花科的报春花 1s 葵Pelargoniungrazeolens)，杜鹃花 Primulaalacoidles Rhododlendlronsimnsi),麝香石竹(Dianthuscaryophyllus 三色紫罗兰(Mathiolaincana,德国鸢尾 urea),风铃草(Camanula Irisgermanica),钓钟柳Penstemonbarbatus),紫盆花(Scabiosatropurp medlium),辽细辛(Asarumhelerotropoidesvar
mandshuricum),汉城细辛Asarumsieboliar seoulese),三七(Pana.rnotogisen1 seng
此外该菌还可寄生于人的面部和胞囊线虫卵内
A.4生物学特征 香菜腐烂病菌是一种在低温高湿条件下易于侵染的病原菌,侵染的最低温度为亚冰点温度 一0.7C),最高30C,最适温度为15C一20C
菌丝生长最适温度为17C,pH范围为4~10,最适 6.5
直射光、散射光和灯光均可产生色素,菌丝产生的色素与光照时间以及强度成正比
A.5传播方式 香菜腐烂病菌是一种土传病害,其厚垣抱子具较强抗逆性,能够在土壤中至少存活2年,是该菌主要的侵 染源
分生抱子和菌丝也可在病残体上越冬,成为发病的初侵染源
伤口是该病菌侵染的主要途径
GB/T29589一2013 附 录 B 规范性附录 香菜腐烂病菌致病性测定方法及步骤 B.1接种物的准备 用无菌水收集在PDA平板培养7d的菌落上的厚垣袍子,或采用菌块切割保湿培养方法获得分生 抱子,并配成1010'个/mL以上的抱子悬浮液
或者取在PDA平板上培养4d5d的菌落边缘的 菌丝块做接种菌丝 B.2菌块切割保湿培养法 将培养7d的菌落用0.5em的打孔器将其切割成菌块,置于放有无菌水和滤纸的培养皿中,18 光照培养,诱导分生袍子产生
B.3接种方法 采用致伤接种方法接种番茄叶片或胡萝卜块茎或其他寄主植物
喷雾袍子悬浮液接种,或菌丝接 种(用无菌水保湿)
用袍子或菌丝接种的,均喷无菌水或无菌培养基于刺伤部位作为对照
供试寄主 或离体叶片或胡萝卜在20C,明暗交替各12条件下保湿48h后观察叶片或胡萝卜发病症状
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香菜腐烂病菌检疫鉴定方法GB/T29589-2013
在食品安全领域，腐烂病菌是一种重要的病原微生物。其中，香菜常常容易被腐烂病菌污染，从而影响香菜的质量和安全性。
国家标准GB/T29589-2013就是针对香菜腐烂病菌的检疫鉴定方法，该方法主要包括以下步骤：
- 1.样品制备：选择新鲜的香菜叶片，用无菌剪刀将叶片切成约5mm×5mm大小的块状样品。
- 2.接种处理：用无菌吸管蘸取适量的腐烂病菌悬浮液，滴加在香菜块状样品表面，放置于37℃恒温培养箱内培养48小时。
- 3.检测方法：采用PCR技术或荧光定量PCR技术对接种后的样品进行检测。其中，PCR技术包括DNA提取、扩增和电泳等步骤；荧光定量PCR技术则可以直接通过荧光信号来定量检测。
使用该检疫鉴定方法，可以快速准确地检测出香菜腐烂病菌的存在情况，为保障食品安全提供有力支持。
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