禽疱疹病毒2型荧光PCR检测方法

禽疱疹病毒2型荧光PCR检测方法

国家标准 GB/T27644一2011 禽瘪疹病毒2型荧光PCR检测方法 Pelfreal-tmeCRftordletetngGalltdlepersVirus2 2011-12-30发布 2012-04-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T27644一2011 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009的规则起草 本标准由农业部提出 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/Tc181)归口 本标淮起草单位;深圳出人境检验检疫局、扬州大学,河南农业大学 本标准主要起草人:詹爱军、刘文博、王新卫、卢体康、花群义、陈书堪、秦智锋、陈兵、高小博
GB/T27644一2011 禽瘪疹病毒2型荧光PCR检测方法 范围 本标准规定了禽庖疹病毒2型荧光PCR检测的操作方法 木标谁适用于青泡穆构毒了型的整定及其流行赖学调鑫,诊断,检疫和监测 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 缩略语 下列缩略语适用于本文件 c'值;每个反应管内的荧光信号量达到设定的闯值时所经历的循环数 DNA:deoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸 NP;deoxy-ribonueleosideriphosphate三磷酸脱氧核糖核苷 含有dcTP,dGTP.dATP dTTP四种脱氧核糖核 EDTA:ethylenediaminetetraaceticacid乙二胺四乙酸 GHV2:GallidHepersVirus 2 禽瘤疹病毒2型(马立克氏病病毒血清1型). MD:Marek'sDisease 马立克氏病 PBS: 磷酸盐缓冲生理盐水 :phosphatebelancedsolution PCR: 聚合酶链式反应 :polymerasechainreaction Real-timePCR:Real-timepolymerasechainreaction 实时荧光聚合酶链反应 I酶Thermusaquatieuspolymerase 耐热DNA聚合酶 试剂 试剂级别-除另有规定,本方法试验用水应符合GB/T6882规定的二级水,所用化学试剂均为分 析纯 4.2禽瘤疹病毒2型荧光PCR检测试剂盒，一20C保存,组成及使用注意事项参见附录A 4.3引物和探针序列(产物长度142bp 上游引物:5'CCACCACCTCCCATCTGTAC3 下游引物5'GACAAGG;CTGAGCGTAAACC3’ TaqMan探针:5’ACACGGCTcGGTAACAGGACACAATG3',其5'端和3'端分别标记FAM 和BHQ(或Tamra或Eclips se 4.41%肝素钠,配制方法见B.1,4保存 S 4.5 三氯甲烧,常温保存
GB/27644一2011 4.6异丙醇,使用前预冷至一20C 4.7无水乙醇 4.875%乙醇,采用无水乙醇和灭菌双蒸水配制,使用前预冷至一20C 4.90.01mol/I，PBS,pH7.2,配制方法见B.2 器材和设备 5.1无菌注射器,1mL.5mL.,10mL,25mL.,100mL 5.2 -次性无菌塑料袋 5.31.5mL无DNA酶和RNA酶的Eppendorf管 0.2mL无DNA酶和RNA酶的P(CR薄壁管、八联管或96孔板 荧光PCR检测仪 高速台式冷冻离心机,可控温至4C、离心速度可达12000g以上 5.7振荡器 研钵 5 8 普通冰箱和超低温冰箱;规格2C8C,-20C,-80C 5. .10微量移液器,0AL2AL,1lL10L,l0AL100AL,20L200L,l00L1000AL,并配 备与移液器匹配的无DNA酶和RNA酶的吸头 样品的采集和处理 6.1样品的采集 6.1.1全血 用预先加人1%肝素钠的无菌注射器直接吸取全血至无菌Eppendor管中,盖上管盖并编号 6.1.2羽毛和组织脏器 取待检羽毛(从根部挤出少量羽髓,肝脏、肾脏和啤脏样品装人一次性塑料袋或其他灭菌容器,编 号,送实验室 6.2样品贮运 样品采集后,放人密闭的塑料袋内(一个采样点的样品,放一个塑料袋),于保温箱中加冰,密封,送 实验室 6.3样品处理 6.3.1全血 3000离心30min,取棕黄色层转人无菌的1.5mlEppendorf管中,加人500l PBS洗涤 3000g离心15nin,弃上清,编号备用 6.3.2羽毛或组织脏器 取待检样品2.0g加人2mLpH7.2的0.0mol/LPEs于洁净,灭菌并烘干的研钵中充分研磨" 分装编号备用
GB/T27644一2011 样本存放 制备的样本在2C8C条件下保存应不超过24h,若需长期保存应置一70以下,但应避免反复 冻融(冻融不超过3次),淋巴细胞样品在2C一8C条件下保存 核酸提取及荧光PCR检测 注意事项 实验室注意事项见附录C 7.2核酸提取 7.2.1取n个灭菌的1.5mlLEppendorf管(n为被检样品之和),编号 7.2.2每管加人250LDNA提取液(参见附录A),然后分别加人被检样本各250L,一份样本换用 一个吸头,再加人10l蛋白酶K1mg/mL),混匀器上振荡混匀,56C消化2h,加人等体积的三叙甲 烧,混匀,15000离心15min 7.2.3取与7.2.1相同数量灭菌的1.5mLEppendor管,吸取7.2.2各管中的上清液转移至相应的 管中,不能吸出中间层,然后再分别加人等体积的一20C预冷的异丙醇,颠倒混匀 in.小心倒去上清,倒置于吸水纸上.沾干液体;加人800L75%乙脖,颠倒 7.2.415000g离心15min 洗涤 7.2.515000g离心10min,小心倒去上清,倒置于吸水纸上,尽量沾干液体 7.2.6500o离心10s,小心倒去上清,将管壁上的残余液体甩到管底部,用微量加样器将其吸干,室 温干燥5min10min 7.2.7加人10l灭菌双蒸水,溶解管壁上的DNA,6000g离心5s,4C保存备用 若需长期保存须 放置一80C冰箱 7.3扩增检测 7.3.1扩增试剂准备 在反应混合物配制区进行 取出MDVPCR反应液(参见附录A),在室温下融化后，1000g离心5s,每个PCR反应按表1配 制PCR反应混合液(需配制反应液数量=样本个数一阴性对照十阳性对照) 表" 试剂 MDvPCR反应液 Taq酶 21. 用量 石山 0， L 将以上CR反应试剂按使用量吸取到一个离心管中,充分混匀,然后在每个PCR管中分装22l. 转移至样本处理区 7.3.2加样 在已分装有PCR反应混合液的PCR管中分别加人已提取好的核酸3L，盖上管盖,将PCR管放 人荧光PCR检测仪内,记录样本放置顺序
GB/27644一2011 7.3.3PCR扩增检测 在扩增检测区进行 7.3.4反应条件设定 第一步502min,955min:; 第二步;95C5s,60C45s.0个循环 60C时设置采集荧光 7.3.5荧光素设定 ReportDye设定为FAM.,QuenchDye设定为BHQ(或Tatmra或Eclipse);Referencedye设定为 自带校正荧光ROX,如使用其他品牌仪器应设为空白或自带校正 条件设定及结果判定 条件设定 8.1 禽庖疹病毒2型阳性对照和阴性对照质控标准;阳性对照有S型PCR扩增曲线,而且C值<35; 阴性对照无s型PCR扩增曲线,而且Ct值显示为无 否则此次实验结果无效 结果判定及描述 8.2.1C值<35的样本为阳性,表明禽瘤疹病毒2型核酸阳性 C值显示为无的样本为阴性样本 表明禽疮疹病毒2型核酸阴性 8.2.2对于35GB/T27644一2011 附 录A 资料性附录 试剂盒的组成及使用说明 A.1试剂盒组成 每个试剂盒可做48个检测,包括以下成分 GHV2PCR反应液 1.lmLX1管 Taq酶 12.5LX1管 阴性对照 1.0mL×1管 阳性对照 1.0mL×1 管 双蒸水 lmL×1管 DNA提取液 12.5mL×1管 A.2说明 A.2.1GHV2PCR反应液(1×);含50mmol/L.KCI,10mmol/LTris-HCI(pH8.3),2.5mmol/儿L MgCl,0.2 mmol/LdNTPmix，上、下游引物各20nmol/mL,探针10nmol/mL,1UTaq酶,5%甘油 mmol/LEDTA,1%SDS A.2.2DNA提取液主要成分:20mmol/LTris-HCl(pH7.4),200n A.3使用时的注意事项 A.3.1在检测过程中,应严防不同样品间的交叉污染 A.3.2反应液分装时应避免产生气泡.上机前检查各反应管是否盖紧,以免荧光物质泄露污染仪器
GB/27644一2011 附 录 B 规范性附录 试剂的配制 B.11%肝素钠 称取肝素钠1.0g,溶于三燕水中,定容至100ml,0.224m过滤除菌,4C保存 B.2磷酸盐缓冲液(0.01mol/LPBs,pl7.2) 先配制A液、B液: A液(0.2mol/LNaH,PO溶液): 称取一水合磷酸二氢钠(NaHPOHO)27.6g,或二水合磷酸二氢钠(NaHPO 2H.O 31.2g,溶于蒸僧水中,定容至1000mL B液(0.2mol/L.NagHPO溶液): 称取十二水合磷酸氢二钠(Na,HPO12H.(O)71.6g,或二水合磷酸氢二钠(Na,HPO2H.O) 35.6g,溶于蒸僧水中,定容至1000ml 称取8.5g氯化钠,用适量蒸僧水溶解,量取14mLA液和B液36mL,调节pH值至7.2,用蒸僧 水定容至1L
GB/T27644一2011 C 附 录 规范性附录 禽疤疹病毒2型荧光PCR检测方法的实验室规范 C.1实验室设置要求 C.1.1实验室分为三个相对独立的工作区域;样本制备区、PCR反应混合物配制区和检测区,并且明 确标识 C.1.2每一区域须有专用的仪器设备,并且明确标识 C1.了进人各个工作区城严格遵循单一方向顺序,即只能从样木制备区.R反应混合物配制区至检 测区 c.1.4在不同的工作区域应使用不同颜色或有明显区别标志的工作服,工作服不能穿离各特定区域 C.1.5实验室清洁时应按PCR反应混合物配制区、样本制备区至检测区的顺序进行 C.1.6不同的实验区域应有其各自的清洁用具以防止交叉污染 C.2工作区域仪器设备配置 C.2.1样本制备区仪器设备配置 2C一8C冰箱;一20C冰箱，一80C超低温冰箱;冰冻台式离心机(>12000r/min);混匀器;微 量加样器(0.5l一10L.Sl一20L.,20AL一200l.200l一1000l);可移动紫外灯 C.2.2CR反应混合物配制区仪器设备配置 2 C8C冰箱;一20C冰箱;台式离心机(>3000r/min);混匀器;微量加样器(0.5l10L ,20 200 ,200 5l20 1000AlL);可移动紫外灯 0L 0L 0Al 0Al" C.2.3检测区仪器设备配置 荧光PCR仪;可移动紫外灯;打印机 C.3各工作区域功能及注意事项 C.3.1样本制备区 C.3.1.1标本的保存,核酸提取、贮存及其加人至扩增反应管在样本制备区进行 C.3.1.2可在本区内设立正压条件以避免邻近区的气溶胶进人本区造成污染 用过的加样器吸头应放人专门的消毒(例如含次氨酸钠溶液)容器内 实验室桌椅表面每次 C.3.1.3 工作后都要清洁,实验材料(原始样本、提取过程中样本与试剂的混合液等)如出现外溅,应作清洁处理 并作出记录 c.3.1.4对实验台适当的紫外照射(254nm波长,与工作台面近距离)可以帮助灭活病毒和消除核酸 的污染 工作后通过移动紫外线灯管来确保对实验台面的充分照射 C.3.2CR反应混合物配制区 C.3.2.1试剂的分装和反应混合液的制备在本区进行
GB/T27644一2011 C.3.2.2在整个本区的实验操作过程中,操作者应戴手套 工作结束后应立即对工作区进行清洁 本工作区的实验台表面应可耐受诸如次氯酸钠等的化学物质的消毒清洁作用 C.3.3检测区 C.3.3.1在本区进行荧光PCR检测 C.3.3.2PCR扩增产物不能在本实验室开盖,PCR管应抛弃在远离本实验室的垃圾箱中 C.3.3.3实验完成后采用紫外灯对实验室进行充分照射

禽疱疹病毒2型荧光PCR检测方法GB/T27644-2011

禽疱疹病毒2型是一种致禽类动物可怕感染病，对家禽养殖业造成了严重威胁。为了准确、迅速地检测该病毒，GB/T27644-2011标准规定了禽疱疹病毒2型荧光PCR检测方法。 该方法基于聚合酶链反应（PCR）技术，采用特异性引物和探针进行扩增和检测。相比传统方法，这种检测方法具有高灵敏度、高特异性和高效率等优点。同时，该方法还可以在实验室、野外、转运等多种环境下进行。 该方法的操作流程包括样本处理、核酸提取、PCR扩增和结果分析等步骤。在样本处理中，需要将样品均匀混合并加入到离心管中；在核酸提取中，可以选择化学法或者磁珠法进行提取；在PCR扩增中，需要根据实验需求设置PCR反应体系，并进行PCR扩增；在结果分析中，利用荧光定量PCR仪进行检测和分析。 总之，禽疱疹病毒2型荧光PCR检测方法GB/T27644-2011是一种高效、准确的检测方法，对于防控禽疫病具有重要意义。同时，为了保证检测结果的准确性，建议在使用该方法时进行严格的质量控制和标准操作，以确保检测结果的可靠性。

禽疱疹病毒2型荧光PCR检测方法的相关资料

和禽疱疹病毒2型荧光PCR检测方法类似的标准

GB/T27644-2011

禽疱疹病毒2型荧光PCR检测方法

2022/11/8 22:11:38 现行