GB/T40135-2021
葡萄细菌性疫病菌检疫鉴定方法
DetectionandidentificationofXylophilusampelinus(Panagopoulos)Willemsetal.
- 中国标准分类号（CCS）B16
- 国际标准分类号（ICS）65.020.01
- 实施日期2021-12-01
- 文件格式PDF
- 文本页数14页
- 文件大小3.16M
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葡萄细菌性疫病菌检疫鉴定方法
国家标准 GB/T40135一2021 葡萄细菌性疫病菌检疫鉴定方法 DeteetionamdidentifeationofXylophilasampelins(Pamagopolos) Willemseal. 2021-05-21发布 2021-12-01实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标涯花管理委员会国家标准
GB/40135一2021 前 言 本文件按照GB/T1.1一2020<标准化工作导则第1部分;标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草
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本文件由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口
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本文件主要起草人:周慧平、莫瑾、袁小雅、黄迎波、张红梅、王哲,朱金国、粟智平、彭梓、严君
GB/40135一2021 葡萄细菌性疫病菌检疫鉴定方法 范围 本文件规定了葡萄细菌性疫病菌的分离培养、免疫学及分子生物学等检测鉴定方法
本文件适用于葡萄及其繁殖材料中葡萄细菌性疫病菌的检疫和鉴定
规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款
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GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样方法 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义
葡萄细菌性疫病菌分类信息 中文名;葡葡细菌性疫病菌、嗜木质菌 学名:Xylophilusamelinus(Panagopoulos)wilemslal.,1987 异名:XanthoonasamelinaPanagopoulos,1969 英文名;cankerofgrapevine,bacterialblightofgrapevine 分类地位;细菌(Bacteria),真细菌(Eubaeteria),变形菌门(Proteobacteria),变形菌纲(Betapro teobaeteria),伯克霍尔德氏菌目(Burkholderiales),丛毛单胞菌科(Comamonadaceae),嗜木质菌属 Xylophilus) 其他信息见附录A
方法原理 S 根据葡萄细菌性疫病菌与抗体之间特异性反应,对待测物进行免疫学检测;根据葡萄细菌性疫病菌 的特异性DNA序列进行分子生物学检测;根据葡萄细菌性疫病菌的培养性状、生物学特性以及危害症 状等对病原菌进行分离培养,必要时进行致病性检测
试剂、材料和培养基 6.1试剂和材料 除有说明外,所有试验用试剂均为分析纯或生化试剂
GB/T40135一2021 试剂;75%酒精,葡萄糖,琼脂糖、无菌双蒸水、十二炕基硫酸钠(SDS)、三氯甲炕、异戊醉,苯盼,异 丙醇,无水乙醇、蛋白酶K、核酸染料,DNA分子质量标准物,50×TAE电泳缓冲液
试剂及其配制的信息见附录B. 材料:植物基因组提取试剂盒、细菌基因组提取试剂盒、普通PCR反应试剂盒、荧光PCR反应试剂 盒等
6.2培养基 YPGA培养基、营养琼脂培养基(NA),培养基及其制备的信息见附录C
分离培养基推荐用YPGA 也可用NA代替
仪器和用具 7.1仪器 生物显微镜(放大倍数400倍以上),恒温培养箱,电子天平(千分之一)、植物光照培养箱、冰箱、离 心机、酶标仪,电泳仪、PCR扩增仪、实时荧光定量PCR仪等
7.2用具 可调移液器(2.5AL,104L,20L,l00l,1000AL),吸头,离心管等
检疫鉴定方法 8 8.1现场取样 参照附录A中的症状描述观察藤茎(图A.1)和叶片(图A.2)是否有葡萄细菌性疫病菌的典型症 状
对现场发现上述类似症状的植株进行取样
果实和植株取样方法按照sN/T2122
8.2样品处理 实验室用水应满足GB/T6682要求
根据后续试验的需求可选择无菌水或不同的抽提缓冲液并 做适当的稀释
8.2.1有症状植物材料 样品中包括多个植物组织或多个样品,应选择具有典型症状的植物组织分别分离病原菌
幼苗和 藤茎、叶片的分离如下 幼苗和藤茎;取葡萄幼苗或藤茎,将表皮或其他腐烂组织去除后,用无菌刀具取病健交界部位的 a 维管束组织0.5cm~1cm数段放人3ml5ml无菌水或无菌磷酸盐缓冲液中静置10 min一 15min 得到抽提液
也可取长约5cm的幼苗或藤茎用自来水冲洗后迅速浸人75%的酒精约1min,然后用无菌刀 具将两端部分及坏死的病变组织移除,再将剩余部分浸人75%的酒精后并使之燃烧(此部分 仅适用于病原菌的分离)
待幼苗上的酒精烧尽后放人无菌塑料袋中,无菌塑料袋中按 无菌水植物组织=6:1比例加人无菌蒸僧水,并捶打挤压幼苗
将此抽提液室温下轻轻搅 动放置40 min~60min,或5C静置16h,l000g离心5min备用 b 叶片;用自来水清洗干净样品,再用75%的酒精表面消毒并迅速用无菌水漂洗
无菌刀具截 min15 取病健交界部位的叶脉和叶柄捣碎后置于无菌水或无菌磷酸缓冲液中,静置10" min
GB/40135一2021 得到抽提液
从幼苗和藤茎,叶片中得到的抽提液应即提即用
长期保存需在抽提液中加人无菌甘油(分析纯) 无菌甘油占总体积的20%30%体积分数),-20C保存
8.2.2无症状植物材料 无症状植物材料按照随机抽取的原则,按照8.2.1中方法获取抽提液
也可将藤茎切成1cm2cm长的小段置于10ml15ml无菌磷酸缓冲液中,或用50ml无菌 注射器吸取收集藤茎汁液约2mL置于无菌磷酸缓冲液中备用 抽提液应即提即用
长期保存需在抽提液中加人无菌甘油(分析纯),无菌甘油占总体积的20%~ 30%体积分数),一20C保存
8.2.3葡萄果实 葡萄果实用自来水冲洗后迅速浸人75%的酒精约1min,无菌操作去皮后置于无菌培养皿或无菌 均质袋中,捣碎或均质后取葡萄汁液作为抽提液备用
抽提液应即批用
长朋保存需在抽提液中加人无甘油(分析纯),无菌甘油占总体积的20% 30%(体积分数),一20C保存
8.3免疫学检测 采用ELIsA方法进行检测,按照说明书进行操作及结果判定
8.4分子生物学检测 8.4.1模板制备 从8.,2中得到的抽提液,按照附录D中的D.1提取总DNA作为分子生物学检测反应模板
对于 分离培养得到的疑似菌株,可直接作为分子生物学检测反应模板
根据实验室条件,可选择下列任一方 法(8.4.2或8.4.3)进行检测
8.4.2普通CR和巢式PCR 从抽提液或其他分离物中提取的DNA作为模板,进行普通PCR和巢式PCR检测
检测步骤和条 件按照D.2进行
8.4.3实时荧光CR 从抽提液或其他分离物中提取的DNA作为模板,进行实时荧光PCR检测
检测步骤和条件按照 D.3进行
8.5病原菌分离 8.5.1有症状植物材料 取8.2.1中得到的液体直接涂布于YPGA平板,每个样品涂布5个10个平皿
25C下培养,从 第三天起每天观察平板上菌落生长情况
典型菌落在培养基上生长慢,光滑不黏稠,有光泽,微凸,淡黄 色,圆形,边缘整齐规则,培养7d12d后大小约2mm
必要时可对菌落进行一次纯化培养
8.5.2无症状植物材料 取8.2.2中得到的液体1.0ml,用无菌水或磷酸缓冲液进行10倍、100倍、1000倍稀释,各取200
GB/T40135一2021 稀释液用于YPGA平板涂布分离,每个稀释度涂布5个10个平皿
培养方法同8.5.1
8.6致病性检测 必要时,可进行致病性测定
致病性实验在盆栽易感菌葡萄藤茎或新托插幼苗上进行
将在YPGA培养基上新鲜培养的疑似 菌收集后用无菌水制成约1×1oCFU/mL的菌悬液,在幼苗藤茎上用无菌刀具切开2cm一4em长并 直达维管束深的新鲜伤口,将1滴一2滴菌悬液接种到伤口上,或叶片新鲜伤口上,用无菌水蘸湿的灭 菌棉覆盖伤口并用锡箱纸包扎5个~10个重复
同法用葡萄细菌性疫病菌标准菌株做阳性对照,用无 菌水做阴性对照至少2个重复
接种后的葡萄幼苗置于20笔 27C,日照时间为14h~18h,水分 肥料充足的环境中培养3周4周
致病性实验也可在试管内已生根的易感菌葡萄藤茎上进行,将在YPGA培养基上新鲜培养的疑似 菌收集后用无菌水制成约 CFU/mL的菌悬液,用无菌刀具将葡萄藤茎的最顶端切除后,将1滴 1×10 菌悬液接种到伤口上,用无菌水蘸湿的灭菌棉覆盖伤口并用锡箔纸包扎,5个10个重复
同法用葡萄 细菌性疫病菌标准菌株做阳性对照,用无菌水做阴性对照,至少2个重复
接种后的葡萄幼苗置于 20 -27C,日照时间为14h~18h潮湿的环境中培养3周4周
9 结果判定 9.1有典型症状的植物组织 对样品抽提液或疑似菌株按照8.3和8.4进行检测,两种方法检测结果均为阳性的可判定为检出葡 萄细菌性疫病菌;两种方法检测结果均为阴性的可判定为未检出葡萄细菌性疫病菌;检测结果中只有一 个结果为阳性的,进行病原菌分离,分离得到典型或疑似菌株，经8.3或8.4任一方法(与初筛检测出阳 性结果不同的方法)进行检测,结果为阳性的即判定为检出葡萄细菌性疫病菌,未分离到典型或疑似菌 株,或菌株鉴定结果为阴性的判定为未检出葡萄细菌性疫病菌
9.2无典型症状的植物组织 对样品抽提液采用8.3和8.4方法进行检测筛选,筛选结果有一个阳性结果或两个均为阳性结果 进行病原菌分离,分离得到典型或疑似菌落按照8.3和8.4进行检测,必要时结合致病性实验结果,出现 2个阳性结果则可判定检出葡萄细菌性疫病菌;两个均为阴性结果的可判定未检出葡萄细菌性疫病菌; 结果有一个阳性的,可采用8.4中与检测出阳性结果不同的PCR方法或结合致病性实验进行进一步鉴 定,进一步鉴定结果为阴性的可判定未检出葡萄细菌性疫病菌
按8.3和8.4方法筛选结果均为阴性的可判定未检出葡萄细菌性疫病菌
未分离到典型或疑似菌 落的,可判定出未检出葡萄细菌性疫病菌
10样品保存 检出葡萄细菌性疫病菌的样品经登记和经手人签字后妥善保存6个月以上
保存期满后应经高压 灭菌后方可处理
11 菌种保存 分离并最终鉴定为葡萄细菌性疫病菌的菌株转接到YPGA培养基试管斜面上,登记和经手人签字 后置于4C冰箱中保存,30d转接一次
也可将菌株冻干保存
GB/40135一2021 附 录 A 资料性) 葡萄细菌性疫病菌 A.1分布 该病菌目前分布在:南非、突尼斯、日本、土耳其、奥地利、比利时、保加利亚、法国、希腊、意大利、摩 尔多瓦、荷兰、,葡萄牙,塞尔维亚、,斯洛文尼亚、西班牙,瑞士、联合王国(英国,阿根廷,乌拉丰
A.2寄主 自然寄主;葡萄(Viti、uinijferaLimn.)是目前知道的其唯一宿主 A.3发病特征 每年春季至6月在葡萄树上就可以观察到症状
12em一30cm长的藤条上,下方2或3节常先发 病,然后逐渐向上扩展
初期出现红褐色的条斑,从藤条的茎部向顶端扩展,并逐渐发展成透镜状的开 裂或溃疡,有时深达木髓,藤条最后萎藉、干枯(见图A.l)
在一些幼嫩的枝条上变色较少,整个枝条枯 死,发病枝条较短,使葡萄出现矮化现象
茎秆横切面上,组织呈褐色
主枝、分枝发病和枝梢产生的症 状一样
在叶上病菌经由叶柄、维管束侵人叶片,叶片常常枯死(见图A.2)
另外病菌由气孔直接侵染 叶片,这种侵染类型使叶片上产生红褐色的角斑
病菌从气孔侵染时,变成红褐色
温度较高时,病叶 上可以看到淡黄色菌脓流出
花受到感染后,成熟前变黑和枯死
病原菌也能侵染葡萄的根,无论是嫁 接植株还是自身砧木上的植株,都会使枝梢生长减慢
葡萄细菌性疫病菌的生活周期至今没有完全阐 明,初侵染主要发生在12年生的枝条上，经过叶片,花和果实侵人植株,病原菌随着植株传播,尤其是 在潮湿的有风的天气就更容易传播,然后在初夏季节扩散到其他新芽
病害发生需要温暖、潮湿的 条件
shootsymptoms 图A.1葡萄细菌性疫病在葡萄嫩苗上的危害状
GB/T40135一202 SourceCAB SouncAa 图A.2葡萄细菌性疫病在葡萄叶片上的危害状 A.4病菌生物学特性 菌体杆状,极端具1根鞭毛,大小0.生mm一0.8mm,革兰民阴性菌
在YPGA培养基上,菌落光滑 不黏稠,黄色,圆形,边缘整齐规则
在适当的培养基上25条件下培养7d~12d,菌落最大直径约 2mm
A.5传播方式 病原菌可以很容易地通过修剪工具传播,并主要通过修剪的伤口侵人健康组织
病菌可以在木材 中存活,因此,可以通过带病插条在各个温室间传播
喷灌则有利于病菌传播
用来防治葡萄根瘤蚜的 灌溉水也可能传播病菌
病菌主要通过带菌的繁殖材料进行远距离传播.自然的传播仅局限于葡萄园内及周围区域
GB/40135?2021 ? B B.1??(0.01mol/L)(PBs0.01mol/L) ?8.0g,??2.7g,?0.4g?1000mL(pH7.2) к?121C15miná B.2TE? 10mmol/LTris-HCl,pH8.0 lmmol/LEDTA,pH8.0 B.3IAE??(pHH8.5)(50) Tris 242g 57.1ml. 37.5" 1000mL NaEDTA2H.O ? B.410%?(SDS) 100 900mL SDS ? g 68C?,1000mL
GB/T40135一2021 录 附 C 资料性 培养基 C.1YrGA培养基 酵母浸出粉5.0g,际蛋白陈5.0g,D(十)葡萄糖10.0g,琼脂粉15.0g 将上述成分加人1000mL蒸憎水中,加热煮沸至完全溶解,分装后121C灭菌15min备用 (pH6.57.0)
c.2NA培养基 牛肉浸膏3.0g,蛋白陈5.0g,NaCI5.0g,琼脂粉15.0g
将上述成分加人1000mL蒸僧水中,加热煮沸至完全溶解,分装后121C灭菌15min备用 pH7.3士0.1).
GB/40135一2021 录 附 D 规范性 葡萄细菌性疫病菌的分子生物学检测方法 D.1总DNA的提取 将8.,2的步骤得到的液体移至一干净灭菌的离心管中,12000r/min离心15min,弃上清
在沉淀 中加人TE缓冲液5mL,l0%SDS溶液300L,20mg/mL蛋白酶K30L.,混匀,37C水浴孵育1h
加人等体积的三氯甲婉-异戊醇(24:1),混匀
10000r/min离心5min,将上清液移至一个新离心管 中
加人等体积苯酚-三氯甲烧-异戊醇(25:24:1),混匀,10000r/min离心5nmin,将上清液移至一 新离心管
加人0.6倍体积的异丙醉,轻轻混匀,10000r/min离心5min,弃上清,管中加人70%乙醉 洗涤沉淀,晾干,加人50L
TE缓冲液溶解DNA沉淀，-20C长期保存
也可采用商业化植物基因组DNA提取试剂盒按照操作说明提取样品总DNA,疑似菌落用细菌基 因组DNA提取试剂盒操作说明提取总DNA,一20C保存备用
D.2普通CR和巢式PCR检测 D.2.1普通CR和巢式PCR引物信息 普通PCR和巢式PCR引物序列见表D.1
表D.1普通CR和巢式PCR引物信息 引物序列 PCR类型 引物名称 PCR产物大小 目标基因 xaTs1 5'-TGcGTAGTTcAAcAccAAAGT3 普通PCR ITS序列rr基因 129bp XaTs2 5'-TATGAcccTcTTrcCACCAGC3' XaA1 5'-AGTcGTAACAAGGTAAGccG3 742bp XaB1 5'-CYRYTGCCAAGCATcCACT-3 16s23srDNA 巢式PCR XaS3 5'-GGTGTTAGGCCGAGTAGTGAG3 277bp XaS4 5'-GGTCTTTCACCTGACGCGTTA-3 注普通CR引物信息来源Xyophlesam/pelins2009oEPP/EPPo;巢式CR引物信息来源;Det etectionof Xylophilusamelinusingrapevinecuttingsusinganestedpolymerasechainreaction,PlantPathology
D.2.2普通PCR和巢式PCR反应体系 检测葡萄细菌性疫病菌的普通PCR和巢式PCR反应体系见表D.2
表D.2检测葡萄细菌性疫病菌的PCR反应体系 组成 加样体积 普通PR和巢式PCR第一 巢式CR第二轮 2×PCRMix 2×PCRMix 10.0A 正向引物(10pmol/gL) 正向引物(10pmol/aL) l.0Al
GB/T40135一2021 表D.2检测葡萄细菌性疫病菌的CR反应体系续) 组成 加样体积 巢式PCR第二轮 普通PCR和巢式PCR第一轮 反向引物(10pmol/L 反向引物(10pmol/L) 1.0Al 模板DNA(ng/L一10ng/pL 第一轮R产物(10~100倍稀释) l.0AL 7.0AL 双蒸水 双蒸水 总体积 总体积 20l D.2.3普通PCR和巢式PCR反应循环参数 普通PCR:94C预变性3min;94C:30s,60C;45s,72C;45s,进行40个循环;72C延伸 5min;4C保存
巢式PCR;第一轮(引物对XaA1,XaB1);94C预变性3min;94C;30s,56C;60s,72C;60s 进行30个循环;72C延伸5min;4C保存
巢式PCR第二轮(引物对XaS3、XaS4):94C预变性3min;94C30s,60C:;45s,72C;45s 进行40个循环;72C延伸5min;4保存
D.2.4普通PCR和巢式CR扩增及产物分析 D.2.4.1普通PCR 用葡萄细菌性疫病菌标准菌株基因组DNA作为阳性对照,用不含有葡萄细菌性疫病菌的葡萄植 物组织材料或其他植物病原菌基因组DNA为阴性对照,用双蒸水作空白对照,进行PCR扩增
用TAE电泳缓冲液制备2%的琼脂糖凝胶,按比例混匀电泳上样缓冲液和PCR产物,将混有上样 缓冲液的PCR扩增产物加至样品孔中,用DNAMaker作分子量的标记,进行电泳分析,电泳结束后， 在凝胶成像分析仪下观察是否扩增出预期的特异性DNA电泳带,拍摄并记录实验结果
待测样品扩增产物的电泳结果与阳性对照一致,阴性对照和空白对照未出现条带,则判断为阳性 未出现与阳性对照一致的条带则判断为阴性
D.2.4.2巢式PCR 巢式PCR第一轮反应:以抽提液中提取的DNA或疑似菌株作为模板,用葡萄细菌性疫病菌标准 菌株基因组DNA作为阳性对照,用不含有葡萄细菌性疫病菌的葡萄植物组织材料或其他植物病原菌 基因组DNA为阴性对照,用双燕水作空白对照,进行第一轮扩增和琼脂糖电泳分析
电泳结果显示 空白对照无扩增条带,阳性对照出现特异性带条,阴性对照和待测样品均出现数条条带
巢式PCR第二轮反应;以第一轮扩增产物作为模板,进行第二轮扩增和琼脂糖电泳分析
待测样 品扩增产物的电泳结果与阳性对照一致,阴性对照和空白对照未出现条带,则判断为阳性,未出现与阳 性对照一致的条带则判断为阴性
D.3实时荧光PCR检测 D.3.1实时荧光PCR引物信息 葡萄细菌性疫病菌实时荧光PCR检测的引物和探针见表D.3
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GB/40135一2021 表D.3实时荧光CR引物和探针 引物探针序则 引物名称 PCR产物大小 目标基因 5'-cccGATGATAAATACcGAAAAcTC3' Xamp14F Xamp1.27A， l04R 5'-TGTcTTcTG(GTTGTTTT(G(TTTTAAT-3 Xamp1 91bp 16srDNA Xamp14F/104MGB 5'-FAM-AGCGCCTGACGCAT-MGB3 注:实时荧光CR引物和探针信息来源xylophilusampelinus2009OEPP/EPPO. D.3.2实时荧光PCR反应体系 实时荧光PCR反应体系见表D.4
每个样品进行实时荧光PCR检测时应设置2个平行
表D.4实时荧光定性PCR反应体系 组成 加样体积 2×PCRMix 0.0AL 正向引物(10pmol/L l.0l 反向引物(10pmol/AL 1.0AL 探针(10pmol/L .0l 模板DNA(1ng/L一10ng/pL 1.0l 双蒸水 6,0AL 20 总体积 Al D.3.3实时荧光PCR反应条件 实时荧光PCR反应循环参数为;预变性95C,10min;95C,15s,60C,lmin,40个循环
使用 不同荧光PCR仪,可对参数做适当调整
设置荧光PCR反应管荧光信号收集条件,应与探针标记的报 告基团一致
具体设置方法可参照仪器使用说明书
D.3.4实时荧光PCR结果判断 用葡萄细菌性疫病菌标准菌株基因组DNA作为阳性对照,用不含有葡萄细菌性疫病菌的葡萄植 物组织材料或其他植物稍原随基因组DNA为阴性对照.用双蒸水作空白对照,进行实时荧光R 扩增
在阳性对照、阴性对照和空白对照均成立的情况下 疑似分离物;出现典型扩增曲线判定为阳性;无典型扩增曲线判定为阴性
a 样品检测;出现典型扩增曲线,且cT值<35,判定为阳性;35
了解葡萄细菌性疫病菌检疫鉴定方法GB/T40135-2021
葡萄是一种重要的水果作物，在全球范围内都有广泛的种植。然而，由于各种原因，如气候变化、土壤病害等，葡萄的生长遭受到了威胁。其中，细菌性疫病菌是葡萄栽培中的一大难题。
GB/T40135-2021标准是针对葡萄细菌性疫病菌检疫鉴定的方法和技术进行规范的，其主要内容包括以下几个方面：
- 样品处理：标准详细说明了如何采集、处理样品，并给出了相应的实验室操作步骤。
- 检测方法：标准列举了多种检测方法，包括PCR、ELISA等，同时还给出了每种方法的优缺点和适用范围。
- 结果判定：标准明确了检测结果的判定标准和方法，确保检测结果的准确性和可靠性。
此外，《葡萄细菌性疫病菌检疫鉴定方法GB/T40135-2021》还对检测设备和仪器的要求进行了详细描述，包括设备的选择、使用和维护。标准的发布将对葡萄产业的健康发展起到积极的推动作用。
总之，《葡萄细菌性疫病菌检疫鉴定方法GB/T40135-2021》是一份非常重要的标准，它规范了葡萄细菌性疫病菌的检测方法和技术，有助于保障葡萄生产的质量和安全，促进葡萄产业的发展。
