GB/T35521-2017
化学品胚胎毒性植入后大鼠全胚胎培养法
Chemicals—Embryotoxicity—Post-implantationembryoculturetest
- 中国标准分类号（CCS）A80
- 国际标准分类号（ICS）13.300;11.100
- 实施日期2018-07-01
- 文件格式PDF
- 文本页数13页
- 文件大小759.19KB
以图片形式预览化学品胚胎毒性植入后大鼠全胚胎培养法
化学品胚胎毒性植入后大鼠全胚胎培养法
国家标准 GB/T35521一2017 化学品胚胎毒性 植入后大鼠全胚胎培养法 Chemieals一Embryotoxieity一Post-implantationembryewlturetest 2017-12-29发布 2018-07-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/35521一2017 化学品胚胎毒性 植入后大鼠全胚胎培养法 范围 本标准规定了植人后大鼠全胚胎培养方法检测化学品胚胎毒性的术语和定义,试验原理,试验方 法,终点描述、质量控制、数据分析和评价. 本标准适用于应用植人后大鼠全胚胎培养法检测化学品的胚胎毒性
本标准也可作为药物、消费 品、农业用化学品、食品添加剂和污染物胚胎毒性检测的参考方法
术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 2.1 半数致畸浓度ICformalformations 1Csa 50%的胚胎出现畸形的受试物浓度 2.2 313细胞半数生长抑制浓度IC0forinmhihitionofthegrowthof313eells IC 一5313) 50%的3T3细胞生长受抑制的受试物浓度 2.3 formmalformations 最大致畸浓度ICm 1C 最大比率出现畸形的受试物最低浓度 总体形态学评分无效应浓度ICoee fortotalmorphologieal Sc0re ICN ETMs 对总体形态学评分未见异常效应的最高浓度
试验原理 含有1个5个体节的大鼠胚胎在48h培养后,其生长发育和形态分化与体内同龄胚胎相似,且此 时期的胚胎处于器官形成期,对外源化学物敏感
转瓶培养有利于胚胎培养液与其上方的气体交换 由于胚胎发育对于氧气的需要越来越大,气体交换对于培养液的最佳氧饱和度非常重要
测试完成后， 评估胚胎的形态,将对照组和实验组的胚胎进行比较,得到受试物胚胎毒性结果
试验方法 4.1仪器设备 使用设备和器具如下:
GB/T35521一2017 体视显微镜; 慑子; 手术剪; 移液器; 培养皿;直径约100mm -带旋转设备的37C培养箱(宜内带观察显微镜); 旋转培养瓶:容量至少10ml
4.2试剂和材料 4.2.1大鼠 4.2.1.1用0.03mg/L.0.1mg/L.0.3mg/儿和mg/儿的5-氟尿略晓进行阳性对照实验.l000mg/I 的青霉素G钠进行阴性对照实验通过了阳性和阴性对照化合物的质量检查,并且有足够胚胎数目的 大鼠品系可用于本标准
4.2.1.2大鼠在温度20C一24C,湿度50%一70%的SPF级动物房中饲养,自由进食,不限饮水 4.2.1.3每天检查大鼠的一般行为,保持其健康
7周龄一10周龄,未经产雕鼠至少适应2周后,与至 少10周龄的雄鼠交配
用于制备血清的雄鼠体重应不低于250g
4.2.2化合物和培养液 使用的化合物和培养液如下 Hanlk's平衡盐溶液(IHBss).含0185g/L的CaC8.0g/儿的NacCl.0.4gL的KCl.0.2g/L的 MgsO,0.308g/1的NaHcO.,1.0g/1的葡萄糖,0.075g/1的NaHPO.,0.060g/I的 KH.PO,6C保存,以上试剂均为分析纯; 二甲基亚碱(DMSO,分析纯); 乙醇醉(分析纯); 二氧化碳(CO,,工业级); 5- -氟尿嗜; 青霉素G钠; 无菌真空采血管
4.2.3 血清制备 雄性大鼠采用cO麻醉后,打开腹腔,找到主动脉,用无菌真空采血管从主动脉收集血液,在1min 之内完成
1800r/min离心5min后吸取血清于冰上保存
采集完所有样品后,再次于1800 r/min 离心3min,收集血清,于56C热灭活30min
一20C储存备用,使用前于37C热融
4.3测试过程 4.3.1交配过程 雌性大鼠饲养在12h/12h明暗交替的环境中,上午6时至下午6时为暗
下午4时至6时,将发 情的未经产的雕鼠与雄鼠合笼次日清晨分笼
4.3.2分离胚胎 妊娠第10天上午(合笼当天为第0天),CO
麻醉致死,腹腔壁切口分离子宫,转移至手术板
用无 菌的锻子和剪刀从子宫里分离蜕膜上的胚胎
把独立的胚胎转移到含有无菌HBSS的培养皿中,在显
GB/35521一2017 微镜下用无菌手术子小心放人去掉蜕膜组织的赖歇特膜和卵黄囊壁,留下完整的内卵黄囊
含有 1个5个体节的胚胎将用于试验
4.3.3受试物制备 每个胚胎培养中加人2ml大鼠血清
采用合适的溶剂溶解化合物例如HBSs,DNMsO或乙醉). 在胚胎置人培养瓶之前,向培养血清中加人标准体积的化合物溶液,对照组中加人同体积的溶剂
加人 溶液的体积已在预试验中证明不会干扰培养瓶中胎的发育
培养瓶中游剂的最大浓度是1%水相浴 液(HBss),0.125%的DMso,以及0.2%的乙醉
培养瓶通气后,将胚胎放人培养瓶中
每个母体的 胚胎被尽可能均匀的分布在对照组和各个实验组中,并且尽可能保证平均每个浓度组的胚胎的起始体 节数一致
受试化合物浓度梯度和平行对照的数目相当,并且同时进行测试
4.3.4培养条件 胚胎在37C条件下,以20r/min一40r/min转速不间断旋转,无菌培养48h
培养瓶每天两次通 氧,每次通氧时间30s,而且随着培养时间的增长,通氧气体中的氧气含量不断增加
通氧计划表(见表1 给出了一个示例,不同实验室的最佳通氧条件会有所不同
如果37C培养箱中带有观察用的显微镜， 可在培养后0h5h21h一28h一45h时,通过判断尾端神经管封闭,胚胎弯曲、卵黄囊循环和心跳 频率(见附录A)来检查胚胎完整性
胚胎放人培养瓶的时刻定为0h
表1通氧计划表 气体浓度/% 培养时间" CO N 90 10 85 21 20 75 75 28 20 55 45 40 4.3.5剂量-效应评估 受试物浓度采用十倍稀释的剂量间隔,每个剂量3个胚胎,来寻找毒性作用范围
然后,采用总体 形态学评分(TMs)作为效应参数,在最高无效应浓度、TMs比对照减少至少50%的浓度,以及两个中 间浓度时进行测试,每个浓度7个胚胎,以区分特异性胚胎毒性和一般的发育迟缓
测试浓度间隔因子 最小为2
任何化合物的最高测试浓度为1000mg/L.,如果在此浓度下7个胚胎都没有产生效应,那么 不需要进行其他浓度的测试
S 终点描述 5.1实验终点和终点检测 5.1.1大鼠胚胎形态;按照图1所示观察形态变化(胚胎总体观察,包括体节个数,分化滞后,特定的畸 形)
5.1.2大鼠胚胎功能;功能变化(心脏搏动,卵黄囊循环和尿囊循环).
5.1.3大鼠胚胎发育;胚胎生长发育(卵黄囊直径,冠臀长,头长).
GB/T35521一2017 5.1.4细胞成活力;细胞成活(心脏搏动,卵黄囊循环和尿囊循环 中脑 前脑 后脑 后肢芽 上鄂灾 感光系统 嗅觉系统 耳系统" 心脏 脚门 体节形成 前肢芽 图1胚胎的形态 5.2终点检测值 畸形检测C和IC.,;以TMS计算lIC、 EcTMs
5.3终点测试 5.3.1培养48h后,胚胎被转移至含有HBSS的培养皿中(37C),按照附录B描述和确定生长发育情 况
按照培养的顺序对胚胎进行评分,以减少胚胎之间培养时间长短的差异 5.3.2用带有目镜测微尺的显微镜来测量卵黄囊直径,评价卵黄囊血管,卵黄囊循环和心脏搏动情况
用显微外科慑取出卵黄囊,确定冠臀长、头长、体节数、胚胎弯曲情况和所有器官的形态学发展情况
般把与前肢芽中部相对应的体节定为第9体节,由此开始向尾端方向计数体节数
按照附录B的方法 对所有器官的总体形态学发育进行评分
对于处于发展过程中的中间阶段,可采用半分评分,例如生长 处于阶段3和阶段4之间,可评分为3.5分
总体形态学参数包括培养后与培养前的体节数之差、 TMS
特定的畸形可能在任何一个形态学参数中出现,独立评分
所有器官的得分加在一起得到 TMs
与已列出的发育异常的形态学畸形情况需要单独标注
质量控制 6 6.1胚胎的质量检查 在培养之前,仔细检查卵黄囊的完整性和胚胎的形态
为了保证培养后胚胎的正常生长,需要同时 进行不含受试物只含所用的溶剂的培养基对照组的平行实验
将对照组的生长情况与同实验室的以往 对照组进行比较,以评价对照组的生长情况正常与否
对照组出现形态异常的最大机率为15%即7 个中有1个异常了. 6.2测试过程的质量控制 在进行受试物实验之前,用0.03mg/L,0.lmg/L,0.3mg/I和1mg/I的5-氟尿密喧进行阳性对 照实验，l000mg/儿的青霉素G钠进行阴性对照实验
GB/35521一2017 数据分析和评价 7.1数据采集 整理数据,为每个化合物建立单独的文件(可参考附录c),进行独立统计 7.2检测终点 7.2.1全胚胎培养过程中的检测终点得分可以被分为4组(见附录B)
生长参数包括卵黄囊直径、冠 臀长和头长
功能参数包括心脏搏动、卵黄囊循环和尿囊循环
总体形态学参数包括培养后与培养前 的体节数之差、TMS
特定的畸形可能在任何一个形态学参数中出现,进行独立评分
根据下面说明 的受影响的终点情况,每个胚胎评估可根据两种类别中的一种来进行
7.2.2整体发育迟缓是指胚胎整体上受到影响,和正常比例的胚胎相比,尺寸较小和/或大部分或者所 有器官整体分化迟缓 7.2.3特定的胚胎毒性是指一个或一定数量的器官的特定效应(畸形),可能归结为受试物的选择性 作用
7.3毒性评价 7.3.1评价方法 采用精细的形态学评分系统,来评价化合物作用48h后胚胎出现畸形或发育迟缓的体征或胚胎死 亡的作用
开发了两套评价模型(PM1和PM2),PMI评价分化和发育参数,PM2纳人了分化的小鼠 成纤维细胞(3T3)的细胞毒性数据
7.3.2预测模型一(P1 根据判别公式将受试物胚胎毒性分为3个级别;无毒性、弱毒性和强毒性
判别公式 10.19 函数1=18.08xlog(C.)-I1.56×log(Cwa) 10.65. * 函数II1=21.55×log(IC)一15.31×log(ICoBe 2.53 函数I11=8.70×log(IC)一8.53×log(ICgc 3 7.3.3预测模型二(P\M12 由于PM1只考虑分化和发育的参数,而没有细胞毒性的测定，PM2纳人了3T3细胞毒性测试的 数据
判别公式 函数1=0.21×[ICGT》一ICNo:/IC3nn]×100十15.37×log(ICm)一23.58(4 -Ic、 32.37(5 函数II=0.27×[ICMer3s CNoEc/ICMar)]×100十17.71×log(IC 函数I11=0.093×[ICMar,一ICNoe/ICr]×100十4.21×log(C.)一4.23 (6 7.3.4受试物胚胎毒性分级 根据计算结果进行毒性分级 如果PM中式(1)的结果大于式(2)和式(3)的结果,或PM2中式(4)的结果大于式(5)和式 6)的结果,则化合物为无胚胎毒性;
GB/T35521一2017 b 如果PMl中式(2)的结果大于式(1)和式(3)的结果,或PM2中式(5)的结果大于式(4)和式 6)的结果,则化合物为弱胚胎毒性; 如果PMl中式3)的结果大于式(1)和式(2)的结果,或PM2中式6)的结果大于式(4)和式 5)的结果,则化合物为强胚胎毒性
GB/35521一2017 录 附 A 规范性附录 胚胎培养生长情况记录表 项目 实验 3 日期 血清批次 胚胎培养生长情况记录 胚胎培养生长情况记录单 化合物 浓度 胚胎编号 初始体节数 培养顺序 5h 神经管 心跳频率 卵黄囊循环 弯曲 备注 21h 神经管 心跳频率 卵黄囊循环 弯曲 备注 28h 神经管 心跳频率 卵黄囊循环 弯曲 备注 45h 心跳频率 备注
GB/T35521一2017 温度和通氧记录 温度和通氧记录单 温度 氧气/% 时间 日期 签名 时间点 28 45
GB/35521一2017 附录 B 规范性附录 培养后胚胎评分记录表 项目 实验 胚胎编号 初始体节数 S 化合物 浓度 血清批次 培养后胚胎评分记录
GB/T35521一2017 培养后胚胎评分记录单 胚胎畸形(正常为0,畸形为1) 生长发育参数 卵黄囊直径/mm 卵黄囊血管缺损 冠臀长/mm 尿囊与胚胎惟不融合 头长/mm 尿囊过大 弯曲不足 功能参数(正常为1,异常为0) 心包囊宽,内有液体 卵黄囊循环 心脏腹侧转向 尿囊循环 后神经孔开放 心脏搏动 背中线不正 前脑开放 体节发育 中脑开放 终体节数 后脑开放 终体节数-初始体节数 前脑狭窄 颅神经褶皱联合线异常 总体形态学参数 头小、后弯曲 卵黄囊血管 颅表面异常 尿囊 神经管出血 后脑透明,尺寸偏大 弯曲 心脏 后脑狭窄 尾神经管 耳泡未形成 后脑 视觉系统未形成 中脑 腮弓未形成 前脑 上颌肿胀 耳系统 下未开 视觉系统 下飘未形成 嗅觉系统 体节过小 M 腮弓 体节异常 上颁发育 尾部拗折 下发育 尾短而粗 Q 前肢 皮下水瘤 后肢 出血 总体形态学得分[TMS=习(AR力 其他畸形 10
GB/35521一2017 C 附录 资料性附录) 受试化合物测试信息综合表 化合物 受试化合物测试综合信息 受试化合物测试综合信息表 培养基中受试物浓度/(mg/L 观测指标 对照 培养的胚胎数 初始体节数 平均值士s.E.M 最终体节数 平均值土S,E.M. 卵黄囊直径 平均值士s.E.M 冠臀长 平均值士S,E.M 头长 平均值士sE.M TMS 平均值士S,.E.M. 畸形胚胎数 卵黄囊 尿囊 弯曲 心脏 神经管 前、中、后脑 囊系统 颅面部发育 体节 其他 畸形胚胎总数
化学品胚胎毒性植入后大鼠全胚胎培养法GB/T35521-2017解析
GB/T35521-2017标准中的植入后大鼠全胚胎培养法是一种替代动物实验的方法，其基本原理是将植入后的大鼠胚胎取出，放置在体外培养液中进行培养，并通过观察胚胎发育情况、检测化学品对胚胎的影响等方式来评估化学品的毒性。这种方法具有高效、快速、准确等优点，且不需要动物参与，符合现代化学品评估的发展趋势。
植入后大鼠全胚胎培养法的操作流程包括：取出植入后的大鼠胚胎、放置在体外培养液中、暴露化学品、观察胚胎发育情况、评估化学品毒性等步骤。其中，评估化学品毒性可以通过观察胚胎发育情况、检测细胞增殖及凋亡、基因表达等指标来进行。
在使用植入后大鼠全胚胎培养法进行化学品毒性评估时，需要注意以下问题：
- 选择适当的胚胎阶段，保证实验结果的可靠性；
- 采用正确的实验条件和检测方法，避免假阳性或假阴性结果的产生；
- 对于存在疑问的结果，进行重复试验或其他确认性实验。
总之，GB/T35521-2017标准中的植入后大鼠全胚胎培养法为化学品胚胎毒性的评估提供了一种新的替代动物实验的方法，具有重要的意义。
