猪链球菌2型多重PCR检测方法

猪链球菌2型多重PCR检测方法

国家标准 GB/T19915.5一2005 猪链球菌2型多重PCR检测方法 ProtoeolofmutiplexPrCRidentifieationofStreptoeoecussuistype 2 2005-11-01实施 2005-09-27发布 国家质量监督检验检疫总局 发布 中 国国家标准化管委员会国家标准
GB/T19915.5一2005 猪链球菌2型多重PCR检测方法 范围 本标准规定了猪链球菌2型多重PCR检测的操作方法 本标准适用于检测生猪拭子增菌培养物、疑似病料及猪组织样品(猪淋巴结、扁桃体、肉品等)中的 猪源链球菌及猪链球菌2型 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6682一1992分析实验室用水规格和试验方法 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 3.1 2 猪链球菌2型Streptoeoccussn Ssistype2 猪链球菌是属于链球菌属的一种细菌,根据其荚膜多糖抗原的差异,可分为1~34及1/2共35个 血清型 猪链球菌2型是猪链球菌的一个血清型,不仅对猪致病性很强,而且可以感染特定的人群,是 -种重要的人畜共患病病原菌 多重聚合酶链式反应(多重cR》miplespbymeaechainreetm 多重PCR又称多重引物PCR或复合CR,它是在同一PCR反应体系中加上两对以上引物,同时 扩增出多个核酸片断的PCR反应 缩略语 本标准采用下列缩略语 聚合酶链式反应 PCR DNA 脱氧核糖核酸 dNTP 脱氧核酸三磷酸 碱基对 bp 试剂和材料 5 除另有规定外,所用生化试剂均为分析纯,水为符合GB/T6682一1992的灭菌双蒸水或超纯水 5.1猪链球菌2型多重PCR反应混合物 PCR缓冲液(含Mg+),2AL;dNTP,1.6L;引物1,0.6AL;引物2,0.6AL;引物3,0.6L;引物 4,0.6L;菌液1.5L;酶0.2L;水12.3L;总体积20L 5.2TaqDNA聚合酶 5.310×PCR缓冲液 100mmol/LKCl，160mmol/LNH)gsO，20mmol/LMgSO，200mmol/LTris-HC
GB/T19915.5一2005 pH8.8)，1%TritonX-100，lmg/mlBSA 5.4dNVTP混合液(各2 5mmoalL 5.5琼脂糖;电泳级 5.6溴化乙锭 5.7DNA分子量标准 5.8TE缓冲液 10mnmol/1Tris-HCl(pH8.0),lmnmol/LEDTA 5.9核酸电泳缓冲液 Tris碱242g，冰乙酸57.1ml,0.5mol/I EDTA100nl,加燕僧水至1000ml,使用时10倍 稀释 5.10电泳加样缓冲液 0.25%澳酚蓝,40%蔗糖 5.11样品对照 猪链球菌2型菌DNA提取物分别作为阳性对照,马链球菌兽疫亚种DNA提取物为阴性对照 仪器和设备 6.1台式冷冻高速离心机(>13000r/min) 6.2DNA热循环仪 6.3核酸电泳仪和水平电泳槽 6.4凝胶成像系统(或紫外透射仪). 6.5可调移液器一套;10l,20l、200L和1000L 6.6恒温水浴箱 操作方法 7.1方法概要 取培养菌液或从组织中提取的基因组DNA作为模板,加人到扩增猪链球菌和猪链球菌2型的 PCR反应混合液中,进行PCR扩增;或直接将待检细菌培养进行PCR扩增 最后通过琼脂糖凝胶电 泳检测PCR产物,与DNA标准分子量进行比较,来确定扩增产物的大小,在此基础上判定样品的检测 结果 7.2样品采集 在实验室生物安全柜中操作,将采集的组织样本剔除包膜和其他结缔组织,选取内部实质部分,冻 存于一20C备用 7.3组织样本DNA的制备 采用商品化的组织基因组DNA提取试剂盒,按说明书进行操作 多重PCR扩增 将培养的细菌纯培养物样品(不经过离心)1.2L或者将制备的各样品DNA以及阳性和阴性对 照DNA各1.5L分别加人到含有猪链球菌2型菌的CR反应混合液的相应CR反应管中[缓冲液 含Mg+),2L;dNTP，1.6AL;引物1,0.6AL;引物2,0.6AL;引物3,0.6L;引物4,0.6L;酶 0.2L;加水至总体积20L]2000r/min离心10s,加人Tuq酵(5U/L)0.2L.2000r/min离心 0s,采用DNA热循环仪立即进行PCR扩增 94C30s,60C30s,72C1min. PCR扩增条件;94C7nmin; ,40个循环;72C101 nmin 扩增反应结
GB/T19915.5一2005 束后,取出放置于4C 7.5多重PCR扩增产物的电泳检测 称取2.0g琼脂糖加人100ml 电泳缓冲液中加热，充分溶化后加人适量的澳化乙锭 0.54g/mL),然后制成凝胶板 在电泳槽中加人电泳缓冲液,使液面刚刚没过凝胶 取5AL10L PCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合后,分别加样到凝胶孔 9V/cm恒压下电泳30 min一 35 min 将电泳好的凝胶放到紫外透射仪或凝胶成像系统上观察结果,进行判定并做好试验记录 结果判定 8.1试验结果成立条件 猪链球菌2型阳性对照的PCR产物,经电泳后在305p和460bp位置同时出现特异性条带,同时 阴性对照PCR产物电泳后没有任何条带,则检测试验结果成立,否则结果不成立 8.2阳性判定 在试验结果成立的前提下,如果样品中PR产物电泳后在305p和460p的位置上同时出现特 异性条带,判定为猪链球菌2型检测阳性;若305p位置出现特异条带面460bp位置无特异条带,刻 定为猪源链球菌阳性,但不是2型菌 8.3阴性判定 如果在305bp和460bp的位置上均未出现特异性条带,判定为猪链球菌检测阴性
GB/T19915.5一2005 附录 A 规范性附录》 检测过程中防止交叉污染的措施 样品处理和DNA制备 A.1 样品处理过程中,应防止不同样本之间的交叉污染,特别避免通过器具,手套、移液器等的污染 A.2PCR检测过程 A.2.1实验前后,要把超净工作台的紫外灯打开,以破坏可能残留的DNA， A.2.2抽样和制样工具必须清洁干净,且用于试验的器皿和离心管,PCR管等必须经过121C、15min 高压灭菌后才可使用 A.2.3PCR反应液配制、模板DNA提取、,PCR扩增,电泳和结果观察等应分区或分室进行,实验室运 作应从洁净区到污染区单方向进行 A.2.4实验过程中,必须穿实验服,戴一次性手套,而且要及时更换 A.2.5所有的试剂、器材、仪器都应专用.不得交叉使用