猪肉、猪肝和猪肾中杆菌肽残留量的测定液相色谱-串联质谱法

猪肉、猪肝和猪肾中杆菌肽残留量的测定液相色谱-串联质谱法

国家标准 GB/T20743一2006 猪肉、猪肝和猪肾中杆菌肽残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Methodforthedeterminationofbaeitraeinresidues inporecimeliver，kidneyandmuscletissues LC-MS-MSmethod 2007-03-01实施 2006-12-31发布 国家质量监督检验检疫总局 发布 中 国国家标准化管委员会国家标准
GB/T20743一2006 前 言 本标准的附录A和附录B为资料性附录 本标准由秦皇岛出人境检验检疫局提出 本标准由国家质量监督检验检疫总局归口 本标准起草单位:秦皇岛出人境检验检疫局,山东农业大学 本标准主要起草人:庞国芳、范春林,连玉晶、李岩,郑军红、曹彦忠、张进杰,李学民、刘永明 本标准系首次发布的国家标准
GB/T20743一2006 猪肉、猪肝和猪肾中杆菌肽残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 范围 本标准规定了猪肉、猪肝和猪肾中杆菌肽残留量的液相色谱-串联质谱测定方法 本标准适用于猪肉、猪肝和猪肾中杆菌肽残留量的测定(本方法测定杆菌肽中主要成分杆菌肽A). 本标准的方法检出限50.0ug/kg 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度正确度与精密度第1部分:总则与定义 (GB/T6379.1一2004,Iso5725-l:1994,IDT) GB/T6379.2测量方法与结果的准确度(正确度与精密度第2部分确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法(GB/T6379.2一2004,IsO5725-2;1994,IDT) GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T66821992,neqISO3696;1987) 原理 试样中杆菌肽残留用酸化的甲醇水匀浆提取,经双硫脉三氯甲婉溶液进行液液分配净化后,再经固 相萃取柱净化,液相色谱-串联质谱仪测定,外标法定量 试剂和材料 除另有说明外,所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水 甲醇;色谱纯 4.1 三氧甲婉,色谱纯 4.2 甲酸 双硫脉优级纯 杆菌肽标准物质纯度92.0% 甲醉十水(l十1),;量取250mL甲醉(d.1)与250mL水混合 0.3%甲酸溶液移取3ml甲酸(4.3)于装有约800ml.水的11容量瓶中,用水定容至刻度并混匀 4.80.1%甲酸甲醇溶液:移取1mL甲酸于装有约800mL甲醇的1L容量瓶中,用甲醇定容至刻度 并混匀 0.0025%双硫朦三氯甲婉溶液称取0.025g双硫院(4.4于装有约800mL三氯甲烧(4.2)的 L容量瓶中,用三氯甲婉定容至刻度并混匀 4.10饱和双硫腺三氯甲婉溶液移取适量的0.0025%双硫腺三氯甲烧溶液于盛有约100ml甲醇十 水(1十1)的250mL分液漏斗中,振摇1min,静置分层,取下层溶液备用 4.11杆菌肽标准储备溶液准确称取适量的杆菌肽于50ml容量瓶中,用0.1%甲酸甲醇溶液配制成 浓度为0.1mg/mL的标准储备溶液 储备液在2C一4C保存,可用3个月
GB/T20743一2006 4.12杆菌肽标准工作溶液;移取杆菌肽标准储备溶液1.0m于10ml容量瓶中,用0.1%甲酸甲醇 溶液定容,配制成浓度为10.0mg/儿的标准工作溶液,在2C一4C保存,可用1周 4.13杆菌肽基质标准工作溶液;根据需要吸取适量的杆菌肽标准工作溶液,用空白样品提取液稀释成 适当浓度的基质标准工作溶液,当天配制 4.14OasisHLB固相萃取柱或相当者:60mg,3ml 使用前分别用3mL甲醇和3mL.水预处理,并 保持柱体湿润 仪器 5.1液相色谱-串联四极杆质谱仪,配有电喷雾离子源 5.2分析天平;感量0.1mg和0.01g 5.3高速组织捣醉机,转速不低于100o01 r/min .4振荡器 5.5离心机转速不低于4000r/min. 5.6离心管,10mL和60mL具塞 57贮微器.0m 5.8固相萃取真空装置 5.9氮气吹干仪 5.10微量注射器;25L,l00L 试样的制备与保存 试样的制备 6. 猪肝脏、肾脏要去除脂肪和其他的非肝脏、肾脏组织,猪肉要去皮和骨头,将其搅碎拌匀,分出 0.5kg作为试样,将制备好的试样密封,并做上标记 6.2试样保存 将试样置于一18C条件下保存 测定步骤 提取 称取10g试样(精确到0.01g)置于60mL离心管中,加人0.1mL甲酸和20ml 甲醇十水 1十1),于高速组织捣碎机上匀浆提取1min,然后加人20mL经甲醉十水(1十1)饱和的0.0025%双 硫脖三氯甲烧溶液.于振荡器上剧烈振荡10min.以4000r/min离心10nmin.取上清液10mL于 50mL试管中,弃去其余上清液 往上述双硫脉三氯甲婉溶液中加人30mL水,捣碎残渣,置于振荡器上剧烈振荡10min,移取全部 上清液于另一60mL离心管中 重复提取一次,合并上清液,混匀,以4000r/min离心10nmin,取上清 液30mL与50m试管中的提取液合并,混匀 7.2净化 在预处理过的固相萃取柱顶部连接贮液器,移人上述试管中样液,待样液全部通过萃取柱后,加人 mL水,弃去全部流出液 然后将固相萃取柱在50kPa一55kPa的负压下抽干1h.最后用2mL甲 22 醇洗脱,收集洗脱液于10mL试管中,洗脱液在35C水浴中用氮气吹干,用0.5m甲醉重新溶解残 渣,再加人0.5mL.0.3%甲酸溶液,摇匀后,供液相色谱-串联质谱仪测定 7.3测定 液相色谱条件 ,150 ×2. 色谱柱:InertsilODS3,5.0Am. mm(内径)或相当者; mm
GB/T20743一2006 液相色谱梯度洗脱条件见表1 bb 柱温:40C; c 进样量;20L d 表1液相色谱梯度洗脱条件 时间/min 流速(L/min) 水(含0.3%甲酸)/(% 甲醇/%) 0.00 400 95.0 5.0 5,00 400 50.0 50.o 20.00 400 50.0 50.o 2010 400 95.0 5.0 25.00 400 95,0 5.0 7.3.2质谱条件 离子源电喷雾离子源; aa b)扫描方式;正离子扫描 检测方式:多反应监测; c 电喷雾电压;5500V; d 碰撞气压力;410kPa 雾化气压力690kPa; 气帘气压力;410kPa; g 辅助加热气压力:690kPa h 离子源温度:700C; 定性离子对,定量离子对和去簇电压(DP)、聚焦电压(FP),碰撞气能量(CE)及碰撞室出口电 压(CXP)见表2 表2杆菌肽的定性离子对、定量离子对,去簇电压、聚焦电压、碰撞气能量和碰撞室出口电压 定性 定量 去簇 聚焦 碰撞气 碰撞室 称 离子对 离子对 电压(DP)/ 电压(FP)7 能量(CE 出口电压(CXP) n/这 n/2 738 712.3/227.2 杆菌肽 712.3/199.2 48 52 90 712.3/356.2 43 7.3.3液相色谱-串联质谐测定 用5个不同浓度的杆菌肽基质标准工作溶液分别进样,以标准工作溶液浓度为横坐标,以峰面积为 纵坐标,绘制标准工作曲线 用标准工作曲线对样品进行定量,样品溶液中杆菌肽的响应值均应在仪器 测定的线性范围内 在上述色谱条件下,杆菌肽的总离子流图参见图A.1 杆菌肽的保留时间为 8.49min 本方法的添加回收率数据参见表B.1 平行试验 按上述步骤,对同一试样进行平行试验 7.5空白试验 除不称取试样外,均按上述分析步骤进行
GB/T20743一2006 结果计算 杆菌肽残留量按式(1)计算: 1000 x=cx'x O 式中 -试样中杆菌肽残留量.单位为微克每千克(4起/ke) 从标准工作曲线得到的试样溶液中被测组分的浓度,单位为纳克每毫升(ng/mL); 试样溶液定容体积,单位为毫升(mL); 最终试样溶液所代表的试样质量,单位为克(g) m 注，计算结果需将空白值扣除 精密度 本标准的精密度数据是按照GB/T6379.1和GB/T6379.2的规定确定的,其重复性和再现性的 值以95%的可信度来计算 9.1重复性 在重复性测定的条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r 样品中杆菌肽 含量范围及重复性方程见表3 表3含量范围及重复性和再现性方程 重复性限" 名称 含量范围/(n 再现性限R mg/kg 杆菌肽 0.05~1.0o lgr=0.9193lgm-0.9203 lgR=0.9596lgm-0.6402" 注:m为两次测定结果的算术平均值 如果两次测定值的差值超过重复性限(r),应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定 9.2再现性 在再现性条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R 样品中杆菌肽含量范 围及重复性方程见表3
GB/T20743一2006 附 录A 资料性附录 杆菌肽标准物质的总离子流图 杆菌肽标准物质的总离子流图,见图A.1 8.49 1160 140 l120 0o I080 io60 o 1020 Ioo0 8.17 10111213141516171819202122232425 /min 图A.1杆菌肽标准物质的总离子流图
GB/T20743一2006 附录 B 资料性附录 收率 本标准中杆菌肽添加浓度及平均回收率的试验数据见表B.1 表B.1杆菌肽添加浓度及其平均回收率的试验数据 样品名称 添加浓度/mg/kg 回收率/% 83.3 0,05 0.20 92.8 猪肉 0,50 86.7 1.00 98.9 86.9 0.05 0.20 85.3 猪肝 00 .50 84.2 1.00 82.2 0.05 84.2 0.20 82.0 猪肾 0.50 83.8 1.00 83.l