马痘诊断技术

马痘诊断技术

国家标准 GB/T27640一2011 痘诊断技术 Diagn0stictechniquesforhorsepoxdisease 2011-12-30发布 2012-04-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T27640一2011 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009的规则起草 本标准由农业部提出 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/Tc181)归口 本标准起草单位;山东出人境检验检疫局、动物卫生与流行病学中心 本标准主要起草人:梁成珠、朱来华、肖西志,郑小龙、邓明俊、岳志芹、毕道荣,梁君妮、徐彪
GB/T27640一2011 马痘诊断技术 范围 本标准规定了马痘临床诊断,病毒分离与鉴定等诊断技术要求 本标准适用于马痘的诊断 临床检查 2.1临床特征 病马于系部和球节处的皮肤上出现丘疹,随后变为水疤,最后为脓疤,并干澜而结痂 由于局部疼 痛,可引起跛行,病马一般不显全身症状;有的病马于唇内侧、齿龈、舌、舌系带、颊部等粘膜上发生痘疹 也是先发丘疹,继而水庖和脓庖,脓庖破裂形成浅的溃疡;母畜外生殖器水肿,并在皮肤和粘膜上形成水 庖、脓庖和溃疡,公畜的病变表现为阴茎,包皮和龟头上的痘疹样病变 2.2初步判定 2.2.1根据临床特征可作出病马感染马痘的初步判定 2.2.2最终判定应进行病毒分离鉴定 病毒分离 3.1样品采集和运送要求 采取病变部位的渗出液、水庖液和溃疡部位组织作为采集对象,尽量无菌采集,采集后低温送实验 室进行病毒分离 3.2病毒分离试验 3.2.1所需仪器设备 3.2.1.1cO培养箱 3 2. .1.2I级生物安全柜 3.2. 1. 3 倒置显微镜 3.2.1.4带冷冻功能的离心机 3.2.2材料准备 3.2.2.1细胞培养基DMEM. 3.2.2. 2 Hela细胞 3.2.2 3 Hanks液(Hank、液,见A.1;含抗生素,见A.4). 3.2.2.4小牛血清 3.2.2.5待检马组织;采取病变部渗出液、水庖液或丘疹和溃疡部组织作为标本,用Hanks液配制成 :10悬液,以1500r/min离心10 ,取上清备用 min，
GB/T27640一2011 3.2.2.6接种方法;用含10%小牛血清的DMEM培养液培养Hela细胞,待细胞长成单层后弃去培养 液 将3.2.2.5中的待检组织接种Hela细胞,然后加人含5%小牛血清的DMEM培养液 cO，培养 箱内37C,48h后观察细胞病变 3.3判定 如果48h后出现明显的细胞病变,如细胞圆缩,聚集,可进一步做病毒鉴定 正常的Hela细胞为 多角形,贴壁生长 电子显微镜检查 4.1材料准备 戊二醛,碳网膜，三羟甲基氨基甲熔-乙二胺四乙酸(Tris-EDTA),磷钨酸(pH7.2),滤纸,载 4.1.1 玻片 4.1.2病毒液或待检病料,如病变部位的渗出液或水庖液 4.2负染操作方法 4.2.1用戊二醛固定待检病料 4.2.2负染方法为:取一滴待检病料于载玻片上,将碳网膜漂浮于液滴上1min,再置于一滴三羚甲基 氨基甲烧-乙二胺四乙酸(Tris-EDTA)缓冲液中浸泡20s,然后用一滴1%的磷钨酸(pH7.2)染色10s 取出碳网膜,用滤纸吸干膜上液体,待自然干燥后镜检 4.3判定 电镜下见到砖形或大卵圆形,有一个双凹面的核心体,同时具有包膜 观察到上述结果,可判定为 马痘感染 分子生物学检测 5.1材料准备 待检样品材料 5.1.1 分离的病毒、病毒感染的细胞或所采集的病料,如病变部位的渗出液或水庖液 5.1.2仪器设备 PCR仪,恒温水浴锅,电泳仪,冷冻离心机,凝胶成像系统或其他类似设备观察电泳结果),微波炉 或相关仪器(琼脂糖凝胶的制备),超声波破碎仪,一20C冰箱 5.1.3试剂 0.25%胰蛋白酶溶液(见A.2),RNase,70%乙醇,TaqDNA聚合酶,PBS缓冲液,酚三氯甲婉,引 物,dNTPs,去离子水,加样缓冲液,电泳缓冲液,澳化乙锭溶液(见B.3)或相关染料(现在已经有澳化乙 锭的替代产品,而且无致癌性,如GelRed) 缓冲液的配方见附录B 5.2病毒基因组DNA的制备 用0.25%的胰酶消化感染病毒的Hela细胞,3000r/min离心5min,收集的细胞沉淀用PBS缓冲
GB/T27640一2011 液重悬,于95C水浴灭活30min 重复离心,收集沉淀 再用2mLPBS缓冲液重悬细胞 将细胞至 于冰浴,超声波粉醉,输出功率为40w,时间3nmin,每5、暂停5s 细胞经破碎后加人10LRNase, 7C反应30mmin 待溶液温度降至室温后,加人400L酌三氧甲扁,混匀后于冰浴中放置5min,然后 13000r/min离心5min,收集DNA沉淀 用70%乙醇洗沉淀一次 空气干燥沉淀,加人100L去离 子水溶解DNA.分装保存于一20C冰箱中备用 本步骤也可采取相关商品化的病毒DNA提取试剂 盒 采集的病料可采取同样的方法或用商品化试剂盒进行病毒DNA的提取 3 55 tinin，HA)基因的PCR扩增 痘苗病毒血细胞凝集素A(Hemgelut 5.3.1引物序列 上游引物;5’-ATGACAcGATTGcCAATAC-3'; 下游引物5'-CTAGACTTTGTTTTCTG3’ 5.3.2各反应物浓度 引物25pmol/AL.dNTP2.5mmol/L.TaqDNA聚合酶5U/AL反应体系为25L. 5.3.3扩增条件 93C,5min.92C,30s;55C,30s;72C,1min 共35个循环 预扩增片段大小为940bp 5.3.4电泳 制备1%琼脂糖凝胶板,加样6L8AL,电压80V100V,电流40mA50mA,电泳30min~ 40min 5.4马痘病毒的PCR检测 5.4.1引物序列 上游引物:5'-GAAAATcCAGATACAGCCAcC-3'; 下游引物5'-ACGCTGAAACGGAACCTGTAT-3’ 5.4.2各反应物浓度 引物25pmol/AL,dNTP2.5mmol/AL,TaqDNVA聚合酶5U/L反应体系为25AL. 5.4.3扩增条件 93C,5min,93C，30s，53C,30s,72C,30s,35个循环 预片段大小为637bp 5. .4.4电泳 制备1%琼脂糖凝胶板,加样6l8l,电压80V100V,电流40mA一50mA,电泳30min~ 40min 5.4.5结果判定 如果不出现940bp和637bp大小的片段,判定为阴性;如果出现940bp和637bp中的任何一个片 段则判定为阳性,并对PCR产物进行测序,与参考毒株进行序列比对
GB/27640一2011 结果的综合判定 根据2.2,可作出初步判定 确诊需要根据4.3,5.4.5进行最终判定,如果电子显微镜检查发现特 征性病毒粒子可判为马痘阳性,否则为阴性;如果PCR检测结果为阳性,可判为马痘阳性,否则为马痘 阴性 当4.3和5.4.5结果不一致时,以5.4.5结果为准
GB/T27640?2011 ?A 淶?? ?? A.1?(IHanks)(10?? A.1.1 ? A.1.1.1?? ? 80.0g 4.0g ? ? 1.4 ?(MgSo.7H.O) 2.0g A.1.1.2? (Na,HPO12H.(o) 1.52g 0.6g 10.0g 1%? 16ml A.1.2? ??????450mL,???,????, ??衣??1000mL??,?2mL,2C8C档 1.3?÷ A ??,???10,107.6kPa15min,4C汸á?7.5%? ?pH?7.27.4 A.20.25%??? A.2.1? ? 8.0g ? 0.2g (Na.C,H.O5H,o) 1.12g (NaH,PO2H,O) 0.056g ? 1.0g ??(1:250 2.5g ?? 1000mL A.2.2? 28C?,??,??pH?7.4?7.60.2Am?
GB/27640一2011 孔膜或G6型玻璃滤器滤过除菌 分装于小瓶中,-20C保存 A.3EDTA-胰蛋白酶分散液(10倍浓缩液 A.3.1成分 氯化钠 80,0g 氯化钾 4.0g 葡萄糖 10.0" 5.8g 碳酸氢钠 胰蛋白酶(1:250 5. .0g 乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na 2. 0g 按顺序溶于双蒸水900mL中,然后加人下列各液 1%盼红溶液 2.0ml 青霉素(10万IU/mL 10.0ml 链霉素(10万4g/mL 10.0ml 补足双燕水至 1000mL A.3.2过滤除菌 用0.2丝m的微孔膜或G6型玻璃滤器滤过除菌 分装小瓶，一20C保存 A.3.3分装 临用前,用双燕水稀释10倍,适量分装于试管中,一20C冻存备用 A.3.4使用方法 分散细胞时,将细胞分散液取出融化后,再置35C一37C热水中预热,并用7.5%碳酸氢钠调pH 为7.68.0 A.4抗生素溶液(1万IU/mL A.4.110倍浓缩液 青霉素 400万IU(80万单位/瓶×5瓶 链霉素 pg(I0万单位/瓶×4瓶 400万" 双蒸水 40mL 游液充分混合后,分装小瓶,放一20C保存 A.4.2工作溶液 取上述浓缩液适量,用双蒸水稀释10倍,分装后放于一20C保存备用 A.5Iris-EDTA缓冲液 10mmol/LTrisCl,pH7.5 mmmmol/LEDTA,pH8.0
GB/T27640一2011 A.65%乳汉液 水解乳蛋白 5g 1000 )ml 汉克氏液 完全溶解后适量分装,经107.6kPa灭菌15min,放2C8保存备用,用时以7.5%碳酸氢钠溶 液调pH到7.2一7.4
GB/T27640一2011 附录 B 规范性附录 电泳用试剂的配制 10×加样缓冲液 B.1 20%(质量浓度Ficoll400 0.1mol/LNaeEDTA，pH8.0 1.0%(质量浓度)SDs 0.25%(质量浓度潦酚蓝 0.25%(质量浓度二甲苯青 B.250×TAE电泳缓冲液 Tris碱 242g 冰乙酸 57.1ml NaeEDTA2H.O 37.2g" 加H.0至1L 1000×澳化乙锭溶液 B.3 澳化乙锭 50mg H,(O 100mL 按1;1000稀释配制凝胶和染色液,溶液应避光 小心;潦化乙锭是一种诱变剂,必须小心操作 B.4PIs缓冲液 NaCI 8g KCI 0.2g NaHPo 1.42g KHPO 0.27g 溶于1L去离子水中,调节pH至7.4 高温高压灭菌,室温保存

马痘诊断技术GB/T27640-2011

马痘是一种非常严重的传染病，由马痘病毒引起。为了及早发现和治疗马痘，需要对该病进行准确的诊断。GB/T27640-2011是中国国家标准中规定的马痘诊断技术标准。

该标准基于酶联免疫吸附试验（ELISA）原理，开发出了多种检测方法，包括直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和夹心ELISA等，可用于血清、组织和病毒分离物等样品的检测。此外，标准还要求检测时应该使用经过认证的抗原和抗体，以确保检测结果的准确性。

该标准下的马痘诊断技术具有以下优点：

• 高灵敏度：能够检测到非常低浓度的马痘病毒抗体或抗原。
• 高特异性：能够区分马痘病毒和其他相关病毒。
• 快速和可靠：在2-3小时内就能获得检测结果，并且结果准确可靠。

GB/T27640-2011标准下的马痘诊断技术已经在中国被广泛应用。这种技术可以提高马痘的诊断准确率和治疗效果，是一种非常有效的诊断技术。

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2022/10/28 3:13:38 现行