国家标准 GB/T40447一2021 鸭茅蜜穗病菌检疫鉴定方法 DetectionamdidentfeatfonofRatheyibaeterratheyi(Smith)zgurskaya etal. 2021-08-20发布 2022-03-01实施国家市场监督管理总局发布国家标涯花管理委员会国家标准
GB/40447一2021 前言本文件按照GB/T1.1一2020<标准化工作导则第1部分;标准化文件的结构和起草规则》的规定起草请注意本文件的某些内容可能涉及专利本文件的发布机构不承担识别专利的责任本文件由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口本文件起草单位;浙江省检验检疫科学技术研究院、杭州海关、浙江大学、计量大学本文件主要起草人:吴志毅、李可、任琐、黄凌哲、李斌、张蓬军、田红伟、程帆、方文渊、吴颖、陈鹏程
GB/40447一2021 鸭茅蜜穗病菌检疫鉴定方法范围本文件描述了鸭茅蜜穗病菌的症状观察、分离培养及分子生物学等检疫鉴定方法本文件适用于鸭茅草、黑麦、黑麦草、小麦等种子和植株上鸭茅蜜穗病菌的检疫鉴定规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样方法术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义病菌基本信息中文名:鸭茅蜜穗病菌学名Rathayibacterrathayi(Smith1913)Zgurskayaetal.1993 异名:Clavibacte厂rathayi(Smith1913Davisetal.1984;Pseudobacteriumrathayi(Smith1913) Krasil'nikov1949; robacleriurathayiSmith1913Savulescu1947;Corynehacteriurathayi Ag" Smith1913Dowson1942;Erwinia rathayiSmith1913)Gramet al.1929;Phy ytoo7nasrathaym Smith1913Ber ergeyetal.1923;BacteriumrathayiSmith1913Aujeszky1914;Aplanoacer Smith1913 rathayi 分类地位;病菌属细菌域Baeteria,放线菌门Aetinobacteria,放线菌纲Actinobe ,放线菌目 )acteria Actinomycetales,微杆菌科Mieroba e,拉氏杆菌属Rathayibacter acteriaceae，鸭茅蜜穗病菌的其他基本信息参见附录A 方法原理根据鸭茅蜜穗病菌的为害症状、培养性状和生理生化特性对病原菌进行分离培养及致病性测试,根据鸭茅蜜穗病菌的特异性DNA序列进行分子生物学检测仪器设备超净工作台、高压灭菌锅、显微镜、培养箱、电子天平、离心机、冰箱、实时荧光PCR仪、EBIOLOG微生物鉴定系统等
GB/T40447一2021 主要试剂 0%乙醉,1%次氯酸钠,生理盐水,3%氢氧化钾(KOH. BH、BHIA和D2NAX培养基配方按照附录B执行实时荧光PCR检测试剂按照附录C的C.1,C.2执行 8 检疫鉴定流程检测样品的鸭茅蜜穗病菌检疫鉴定步骤按图1进行检测样品初检实时荧光PCR 阴性阳性无疑似菌落病菌分肉疑似菌落阴性实时荧光PCR 阳性阴性生理生化签定阳性阴性致病性测试阳性未检出检出检疫鉴定流程图 9 检疫鉴定方法 9.1现场检疫现场检疫中,如植株样品发现疑似症状(参见A.4),取样带回实验室作进一步显微镜检查和病菌分离鉴定种子样品进行隔离种植观察或病菌直接分离鉴定取样方法按照sN/T2122执行 9.2病菌分离 9.2.1种子浸提液制备取种子样品100g,置于1%次氯酸钠溶液中表面消毒10min;无菌水洗涤3次后加人200ml无菌生理盐水,4冰箱浸泡过夜;纱布过滤,滤液14000g离心20min,lmlL无菌水悬浮沉淀,制成种子浸出液可取部分浸出液离心沉淀提取DNA进行PCR初检,部分浸出液用于分离培养
GB/40447一2021 9.2.2种子中病菌分离将种子浸出液进行10倍系列稀释,分别取10倍、10'倍、10倍、10倍稀释液100涂布D2.ANX 平板,每个稀释度涂布10个平板 26C培养3d后开始观察,检查是否有圆形、中等大小,淡黄色,边缘规则,光滑突起,表面湿润的疑似菌落产生疑似菌落培养3d~5d后转移至BHI平板上培养2d~3d进行纯化,纯化3次后进行实时荧光 PCR、生理生化鉴定等后续试验 9.2.3植株中病菌分离取病健交界处植株组织,切成5mm×5mm小块,70%乙醇表面消毒60s,无菌水清洗3次后移至灭菌培养皿中,加200!L无菌水,捣碎后静置15min,即制成组织处理液,可取部分组织处理液离心沉淀提取DNA,进行PCR初检,部分组织处理液在D2ANX平板上划线分离,划线5个10个平板 6笔下培养,3d后观察,培养3d~5d后,疑似菌落转移至BH平板上培养2d3d进行纯化,纯化 3次后进行实时荧光PCR,生理生化鉴定等后续试验 9.3实时荧光PCR检测疑似分离物纯化后提取DNA,进行实时荧光PCR检测,检测方法按照附录C执行 9.4生理生化鉴定疑似分离物用革兰氏染色法或KoH反应法进行革兰氏阴阳性判定取3%KoH溶液1滴,滴在载玻片上,用移菌环移取1环待测菌昔于玻片上KOH溶液中,用牙签搅动30s,再将菌液向上提起,观察有无粘丝,如无粘丝即判定为革兰民阳性菌,同时用已知革兰民阴性菌作对照用BIOL0G鉴定系统(GEN皿)或细菌微量生化鉴定管对上述判定为革兰氏阳性的疑似分离物进行相关生理生化指标测定 9.5致病性测试疑似分离物转移至BH平板上26C培养2d,取菌落用无菌水配成10'CFU/mL菌悬液,针刺法接种5株10株寄主幼苗叶片,接种后放置于26C一28C光照培养箱中,在相对湿度80%,光暗比例为16:8的条件下培养,7d后观察是否有症状产生阳性分离物接种后,植物可在2周内出现典型症状;叶片出现水遗状晕斑,茎秆萎缩出现症状后取症状组织分离其中病菌,并用实时荧光PCR检测分离物是否为阳性,完成致病性测试 10结果判定按9.2分离到的疑似分离物在培养基上的菌落特征符合9.2.2特征.,生理生化特征符合9.4阳性实时荧光PCR检测结果符合C.2.4阳性判定,且致病性测试为阳性时,判定为检出鸭茅蜜穗病菌否则判定为未检出鸭茅蜜穗病菌样品及检测结果保存 1.1样品保存与处理阳性样品经登记和经手人签字后妥善保存6个月以上保存期满后应经高压灭菌后方可处理
GB/T40447一2021 11.2菌株保存与处理分离并鉴定为鸭茅蜜穗病菌菌株,应妥善保存可用甘油冷冻保存法或冻干保存法保存对不需要长期保存的其他菌株应及时灭菌处理
GB/40447一2021 附录 A 资料性) 鸭茅蜜穗病菌其他信息 A.1分布亚洲印度、伊朗以色列、日本,黎巴嫩;非洲;埃及、肯尼亚、摩洛哥,南非,多哥,突尼斯,乌干达、赞比亚、津巴布韦;欧洲;土耳其、奥地利,比利时,保加利亚,芬兰、法国,德国,希腊、匈牙利,爱尔兰,意大利、立陶宛、荷兰、挪威、波兰、葡萄牙、罗马尼亚、西班牙、瑞士、英国、乌克兰、俄罗斯;大洋洲:澳大利亚新西兰;美洲;美国、墨西哥,加拿大,伯利兹,哥斯达黎加、古巴,巴拿马、多米尼加,巴西、哥伦比亚、阿根廷、智利、秘鲁等 A.2寄主范围自然寄主是鸭茅草(Dactyisglamerata、狗芽根草(Cynodon n daylom)、多花黑麦草(Lalin ae);利用人工接种可侵染小麦属植物,普通 mutifn loru ecalecerreal ),瑞士黑麦草(L.rgidom)、黑麦(Sse 小麦(Tritie 二粒小麦(T.dicoe ,硬小麦(T.durum)等 7aetin ccn A.3生物学特性革兰氏阳性棒状杆菌,大小为(0.4m一0.6m)x(0.5m一1.m),菌体为不规则,多型性的知杆状,通常单生,常排列成V形或短链状,无明显的杆,球循环,不运动不抗酸,专性好氧,化能有机营养,氧化型代谢,接触酶阳性对营养要求苛刻,需氨基酸菌株适宜生长温度为24C一28C 最高生长温度29C一32C.,最高耐盐力3% 在大多数培养基上生长级慢且弱,菌落圆形、全缘、光滑、凸起.不透明.外加葡萄糖或蔗糖可增进生长,在复合培养基上蔗落颜色因培养条件而异 A.4侵染循环病菌可在种子内越冬,潜伏期较长,通常可存活8个月以上,翌年播种后,侵染幼苗病菌由气孔及其他孔口侵人,也可通过伤口和根部侵人寄主全部生长期内病菌均可感染,以幼苗最易感病,幼苗感染后生长受阻,扭曲,甚至死苗病菌侵人植株维管束,产生黏性颗粒状沉淀物和细菌团块,致使输导系统阻塞,造成寄主生长衰弱有时植株上部,特别是花序,会产生黄色细菌黏液,出现菌壑或流胶现象穗和种子上可见橙黄色黏性物该病菌在鸭茅草上的为害症状见图A.1 图A.1鸭茅草上为害症状来源;http://sites.seience.oregonstate.edu/bpp/Plant_Cinie/im images/orchardgrass,%20bacterialheadlbight,jpg hup:/www.scene.anrwnsaeehu/w/Pa.Chmt/immgs/ orchardgrass,%20bacterialheadblight4.jpg)
GB/T40447一202 A.5传播方式病菌主要通过带菌种子随国际贸易进行远距离传播;小麦粒线虫可作为传播媒介
GB/40447?2021 ? B 淶 ? B.1??(BHn) ??10.0g;5.0g;(12H.)2.5g;2.0g;???500mL pH?7.4?0.2,121C?15min B.2???(BHIA ??10.0g;?5.0g;(12H,(O)2.5g;2.0g;???500mL;? ?20gipH?7.4?0.2.121C?15mn 15g B.3D2NAx ?2.0g;??4.0;10.0g;?(7HO)0.3g;1.0g:;Tizm 1.2g;?18g;??1000mL,121C?15min,?50C?2.8mL? 10mg/mlL,?0.1mol/LNaoH),0.5mL??(200mg/mL,???),1ml ?(10mg/ml,??)
GB/T40447一2021 附录 C 规范性) 实时荧光CR方法 C.1DNA提取菌悬液12000r/min离心5nmin,弃上清沉淀中加人TE缓冲液5mL,10%SDS溶液300AL. 20mg/mL蛋白酶K30AL,混匀,37C水浴孵育1h 加人等体积的三氧甲烧-异戊醇(24:1),混匀 2000r/min离心5min,将上清液移至一个新离心管中加人等体积酚-三氯甲烧-异戊醇(25:24:1). 12 混匀,12000r/min离心5nmin,将上清液移至一新离心管加人0.6倍体积的异丙醇,轻轻混匀 12000r r/min离心5min,弃上清液,管中加人70%乙醇洗涤沉淀,晾干,加人50MlLTE缓冲液溶解 DNA沉淀，一20C长期保存采用商品化DNA提取试剂盒时,按试剂盒操作说明进行 C.2实时荧光PCR检测 C.2.1 引物及探针特异性引物和探针来源于GenlBank中鸭茅蜜穗病菌的gyrB基因序列,见表C.1 表C.1引物和探针序列名称引物/探针序列(5'-3' 引物RrF cctatgcgaacacgatcaaca 引物Rr-R ggttctcgtccttctccctga 探针RrP FAMcctcgctggtcaacegttacg-TAMRA c.2.2CR反应体系反应体系(表C.2)应先在试剂准备间进行PCR反应体系的配制和分装,然后移至加样间顺次加人阴性对照、样品、阳性对照的模板DNA溶液和水(试剂空白),以防止DNA模板的交叉污染表C.2实时荧光PC反应体系试剂名称反应体系/Al MIXbufer 10 ROX 0,4 探针(10pmol/pL 0,8 正向引物(20pmol/pL 0.4 反向引物(20pmol/L 0.4 模板DNA 0.5l2.0AL(10ng50ng ddH.O 使反应体系至20l 注，可根据不同仪器/试剂盒要求将反应参数作适当调整
GB/40447一2021 C.2.3反应参数 9510min,l个循环;9515s,60C1min,40个循环注:可根据不同仪器/试剂盒要求将反应参数作适当调整 C.2.4检测结果判定与表述实时荧光PCR反应结束后,根据仪器操作规定设置基线和闽值线,读取样品、阴性对照和阳性对照的Ct值在阳性对照阴性对照和空白对照均正常的前提下疑似分离物出现典型扩增曲线判定为阳性;无典型扩增曲线判定为阴性检测样品,出现典型扩增曲线,且C值<35时,则判定为阳性;35GB/T40447?2021 [1]AdermansC,OambCM,MelbyeME.Quantitative assesSment tofAnguinp.andRahay yceddos ss.PlantDisease, bacterrathayiinDae hetyi fieldsinOregonandeestimatesof sglomerataseedproductionl 2005,89(12):;1313-1316 LeeIM,BartoszykIM,GundersenRindalDE,etal.Phylo andclassificationofbacteria logeny inthe generaClavibacterandRathayibacteronthebasisof16srRNA genesequenceanalyses. & EnvironmentalMierobiolog ogy,1997,63(7):2631-2636. Applied B Murray Schroeder KSchneiderWLetal.Rathayibacterto.ricusother Rathayibacterspeeies BacterialHeadBlightofGrassesandthePotentialforLivestockPoi sonings.Phytopathology,2017,l07:804-815 [4]Rathayibacter gd.eppo.int/taxon/CORBRA [5 Brenda Schroeder yrinonO'Gara,1916comb. .etalRathayibacer4gropy Pascopyrun1smmithii).lnternationalJournalofSys- nOVnOm,reV.1solatedtrOmwesSternwheatgrasS tematicandEvolutionaryMierobiology,2018,8(5):1519-1525. ZgurskayaH1,EvtushenkoIl,Akimov N,etal.Rathayi/acergen,nov.,Includingthe SpeciesRathayibacterrathayicomb.nov.,Rathayibactertriticicomb.nov.,Rathayibacteriranicus comb.nov.andSixStrainsfromAnnualGrasses.InternationalJournalofSystematicBacteriology 1993,43(1):l43-149. 0

鸭茅蜜穗病菌检疫鉴定方法GB/T40447-2021

植物病害是造成农业生产损失的主要原因之一，其中鸭茅蜜穗病是一种常见的危害性较大的病害。为了防止该病害的扩散和传播，鸭茅蜜穗病菌检疫鉴定方法GB/T40447-2021应运而生。该标准有效地规范了鉴定方法的实施，使得植物病理学研究更加科学化、规范化。

GB/T40447-2021标准概述

GB/T40447-2021标准主要针对鸭茅蜜穗病菌进行鉴定，包括病原菌的分离、培养、形态特征观察、生理生化特性检测等内容。通过对病原菌进行综合鉴定，判断其是否为鸭茅蜜穗病菌，从而避免类似病害的误诊。

该标准详细阐述了鉴定方法的实施步骤、检测指标和评价标准等内容。同时，也对于可能影响鉴定结果的因素进行了说明，如样品处理、环境条件等等。

GB/T40447-2021标准在植物病理学领域中的应用

鸭茅蜜穗病菌检疫鉴定方法GB/T40447-2021在植物病理学领域中具有重要意义。首先，该标准规范了鉴定方法的实施，使得鉴定结果更加准确可靠。对于植物病理学研究人员来说，这无疑是一个重要的保障。

其次，GB/T40447-2021标准的发布，为植物检疫提供了有效手段。病原菌的检测结果能够直接影响到植物产品的出口，因此准确的鉴定方法是非常必要的。该标准的实施，将为植物检疫部门提供有力的技术支持。

同时，GB/T40447-2021标准的建立也促进了植物病理学领域的发展。标准的实施将推动科学家们在鸭茅蜜穗病菌鉴定方面的探索和研究，进一步提高我国植物病理学领域的学术水平。

结论

总之，鸭茅蜜穗病菌检疫鉴定方法GB/T40447-2021对于植物病理学领域具有重要意义。该标准的发布不仅提高了鸭茅蜜穗病菌鉴定的准确性，也为植物病害的防控提供了有效手段。我们希望该标准能够得到广泛应用，为我国农业生产健康发展贡献力量。