国家标准 GB/T31793一2015 油菜茎基溃疡病菌检疫鉴定方法 aculansFuckelCes.etDeNot Deteetonanidentifieaton.ofLeptosphaeria 2015-07-03发布 2015-11-27实施国家质量监督检验检疫总局发布国家标准化管理委员会国家标准
GB/T31793一2015 前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/Tc271)提出并归口本标准起草单位;检验检疫科学研究院、上海出人境检验检疫局本标准主要起草人:吴品珊、易建平周国梁、杜洪忠
GB/T31793一2015 油菜茎基溃疡病菌检疫鉴定方法范围本标准规定了油菜茎基溃疡病菌的检疫鉴定方法本标准适用于油菜和油菜茎基溃疡病菌其他十字花科寄主种子和植株中油菜茎基溃疡病菌的检疫和鉴定仪器和用具 2.1仪器电子天平(感量0.o1g>),生物显微镜、体视显微镜,高速冷冻离心机、纯水仪,超净工作台、高压灭菌锅、制冰机、PCR仪、凝胶成像系统、电泳仪、实时荧光PCR仪、培养箱,冰箱 2.2用具烧杯、,三角瓶、量简、培养皿、,酒精灯、慑子,剪刀、解剖刀、接种针,载玻片、盖玻片,研钵、移液器、移液器吸头、离心管、液氮罐、孔径2.5mm和1.5mm的网筛试剂和培养基 3.1试剂 1.0%次氨酸销(NacIo),琼脂粉,马铃薯,葡萄糖,乳酸,琼脂糖,无菌双燕水.,液氮,蛋白陈,磷酸二氢钾,硕酸镁,链霉素,新霉素,五氧硝基苯,氯四环素,利福平,TrisHCl,MMgCl,,HCl,EDTA,NaOH. NOAe,KC,Ts,cTAB.TAE,无水乙醉(eham),举附(heml),澳化乙能(EB),三叙甲烧(chlor orm),异丙醉(isopropanol),异戊醉(isoamylaloho),蛋白酶K,TueDNA聚合酶,dNTP,DNA相对分子质量标准物,PCR特异性引物和实时荧光PCR特异性引物及探针 3.2培养基马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA),酸性马铃薯葡萄糖琼脂培养基(APDA) 具体配方参见附录A 检疫鉴定方法 4.1种子检测未带有种衣剂的种子,解剖镜下挑取皱缩、干瘪、变色、畸形、残缺或有霉变的种子1g一2g;带有种衣剂的种子,先用自来水浸泡洗去种衣剂,或用纱布包裹浸泡搓洗种子,自来水冲洗去种衣剂,待风干后挑取异常种子,做分离培养商用油菜籽样品取1kg,用孔径2.5mm和1.5mm的网筛过筛,孔径2.5mm筛上物多为豆荚和茎等植株残体,孔径1.5 mm 筛下物多为碎屑和细小油菜籽筛上物和筛下物混匀后,取1g一2g制样,进行PCR初检,初检如果阳性,再挑取异常种子做分离培养
GB/I31793一2015 4.2植株症状检查检查植物的根、茎和叶片等部位,对茎部溃疡黑斑,根部变色黑腐、叶上有灰色斑点的植物,取样送实验室做进一步检验油菜茎基溃疡病菌为害症状参见附录A 4.3分离培养种子样品用无菌水室温浸泡0.5h1h;无菌水洗涤3次后加人无菌水浸泡,置于20C25笔培养1d;无菌水洗涤3次后转人一20C下冷冻处理过夜;1%次氯酸钠消毒10min,无菌水3次洗涤后置于APDA培养基上.30粒/皿一40粒/;20C下黑暗培养10d 取可疑症状的根、茎、叶的病健交界处,剪成5mm×5mm小块,1%的次氯酸钠溶液消毒5min,无菌水冲洗3次,吸干水分,置APDA培养基上,20C下黑暗培养10d 4.4形态学鉴定在APD培养基上,从第3天开始观察分离样品周围是否有菌丝产生,挑出菌丝转接到PDA培养基上,20C下黑暗纯化培养，5d7d后开始观察记录病菌的培养性状,显微镜下观察记录分生袍子和分生袍子器的形态和大小 4.5分子生物学鉴定 4.5.1DNA提取将制备的商用油菜籽初检样品用液氮研磨后,取样0.1g0.2g,采用cTAB方法提取DNA(参见附录B) 将分离到的真菌菌丝收集,放人1.5mL浸在液氮里的离心管中,用塑料竹碾碎,采用cTAB方法提取DNA(参见附录B) 4.5.2PCR检测常规PCR方法一;特异性引物lnm3(5'-GCcCCAcCAATTGGATcccCTA-3'和Lm4(5'-AG .cR反应总体俱为30L包含10 GCGAGTCCCAAGTGGAACA-3') mmol/LTris-HCl,50mmol/1 KCl(pH8.3),2.5mmol/L.MgCl,dATP,dGTP,dCTP,dTTP浓度均为100mol/L,引物浓度各为 100nmol/儿L2AL模板DNA,1.5UTaqDNA聚合酶反应循环程序为;94C3min;9430s,67C 30s,72C30s,35个循环;最后72C5min 取10L扩增产物与3l的6×上样缓冲液混匀,在 1.5%琼脂糖凝胶1×TAE缓冲液中,4V/em一6v/cem电泳30min,潦化乙锭(EB)染色后在成像系统中成像分析 cF(5'-CTTGcccAcCAATTGGATccccTA-3'和LmacR 常规PCR方法二;特异性引物Lmacl (5'-GCAAAATGTGCTGcGCTcCAGG-3') PCR反应总体积为30AL,包含10mmol/几Tris-HCl. 50mmol/LKc(pHH8.3),2.5mmol/LMgCl,dATP,dGTP,dCTP,drTP浓度均为100umol/L,引物 min;94C 浓度各为l00nmol/L,2L模板DNA,1.5UTaqDNA聚合酶反应循环程序为;94C3 s,63C30、 30s s.72C40s,35个循环;最后72C5min 取10L扩增产物与3L的6×上样缓冲液混匀,在1.5%琼脂糖凝散1XTAE缓冲液中,4v/cm一6v/cem电泳3min.,澳化乙键(EB)染色后在成像系统中成像分析套式PCR,第一轮扩增引物L.m2(5'-TcAGTGGCGGCcAGTCTAcTT-3')和Lm6(5'-GCCGGCT GCCAATTGTTTCA-3')，第二轮扩增引物Lm3(5'-GCCCACCAATTGGATcCCCTA-3')和Lm4(5'"
GB/T31793一2015 AGGcG.AGTccCAAGTGG.AACA-3') PCR反应总体积为30A，包含10mmol/L TrisHcl mmol/1KCl(pH8.3),1.5mmol/LMgCl,dATP,dGTP,dCTP,dTTP浓度均为100Amol/L,引物 0 浓度各为100nmol/L,模板DNA为2AL,1.5UTaqDNA聚合酶反应循环程序为94C3nmin; 94C30s,67c(引物Lm2/6为60)30s,72C30s,35个循环(引物Lm2/Lm6第一轮扩增25个循环);最后72笔5min 第一轮扩增产物1L用作第二轮扩增的模板取10AL扩增产物与3L的 6×上样缓冲液混匀,在1.5%琼脂糖凝胶1×TAE缓冲液中,4V/cm一6V/cm 电泳30min,澳化乙锭 EB)染色后在成像系统中成像分析实时荧光PCR;引物Lm3(5'-GCcCAcCAATTGGATcCccTA-3')/R25'-GGcCGCAAAAT GTGCTGcCGcT-3')探针Probe-M5'-FAM-CAcTTGGGAcTcGC-MGB3') PCR反应体系为 25AlL，包括12.5AL2×PremixExTaq、上下游引物(5mol/L)和探针(54mol/I)各lAl2l模板 eDyeI,加无菌水补至25L 反应程序为;95笔10s;95亡15 DNA,0,5Al50×ROXRee ference 60"C1 min,40个循环鉴定特征 5.1 病菌形态初生菌丝无色,有分隔;菌丝呈白色放射状,初期可见结节状菌丝结,后期菌丝结形成黑色至褐色分生袍子器;分生袍子器球形至扁球形,褐色至深黑褐色,散生、埋生或半埋生于菌丝中,直径1004m一 400 04m,顶部具孔口,周围有浅粉色、红色或紫色的黏性分生抱子团溢出,内含大量的分生袍子;分生袍子无色透明,椭圆形至纺锤形,内含2个油球,袍子大小(3.3Am一6.1Am)X(1.44mm~2.44m) 假囊壳在感病的木质化部位上产生黑色,球形埋生或爆裂,具孔口,直径360wm一500pm;子类棍棒形到圆柱形.双层壁,大小(70pm一120m)x(10pm一17pm)内含8个双列的子囊抱子;子囊袍子长椭圆形,黄褐色,具5个隔膜,大小30m一704m)X(4 一9Am) 人工培养条件下未见有 Am 性型的形成病菌形态图参见附录C中图C.1,与其近似种的形态比较参见附录D中表D.1 5.2CR检测如常规PCR引物Lm3/Lm4扩增产物为279bp,或引物LmaceF/LmacR扩增产物为331bp,视为油菜茎基溃疡病菌阳性如套式PCR引物Lm2/Lnm6和Lm3/Lm4扩增产物为279bp,视为油菜茎基溃疡病菌阳性实时荧光PCR检测,在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下 Ct值小于或等于36,判定油菜茎基溃疡病菌阳性; -Ct值大于或等于40,判定油菜茎基溃疡病菌阴性; -Ct值在3640之间,应重做实时荧光PCR,再次扩增后如Ct值小于或等于36,或者Ct值大于或等于40,判定同上结果判定分离菌形态特征与5.1描述一致,且常规PCR,套式PCR或实时荧光PCR检测为阳性,可判定为油菜茎基溃疡病菌(Lebtoshaeriamaculans)
GB/I31793一2015 材料保存与处理 7.1样品保存与处理样品经登记和经手人签字后妥善保存对检出油菜茎基溃疡病菌的样品应保存于4C冰箱中,以备复核样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理 7.2菌株保存与处理分离鉴定的菌株应妥善保存,菌株在PDA平板培养后可于4冰箱保存,每90d定期继代,或将带有菌丝的培养基块转人30%灭菌甘油中于一80C保存保存期满后高压灭菌处理 7.3结果记录与资料保存完整的实验记录包括样品的来源、种类.时间,实验的时间、地点、方法和结果等,并有实验人员和审核人员签字
GB/T31793一2015 附录A 资料性附录油菜茎基溃疡病菌相关信息 A.1背景资料 A.1.1病菌基本信息 cifers ,Crucifers 英文名:Crucifers stemcanker,Crueifers、blackleg,Phomaleafspot,Cruei canker, dryrot,Blacklegofcabbage 学名;LeptosphaeriamaculansFuckel)Ces，etDeNot. 无性态:Phomalingam(Tode)Desm. 分类地位;真菌界(Fungi),子囊菌门(Ascomycota),座囊菌纲(Dothideomycetes),格抱腔菌目 Pleoorale),小球腔菌科Lepophaeriecee),小球腔菌属(Lepphlaeria) 传播途径;病菌以子囊壳和菌丝体在病残株中越夏和越冬菌丝体在土中可存活2年一3年,在种子内可存活3年,子囊壳在残株中可存活5年以上病菌分生抱子可借风雨作短距离传播,病残体和带菌种子是远距离传播的主要方式 sphaeriabiglobosa 近似种与油菜茎基遗疡病菌形态上较为近似的种类为浦粟黑胫病菌(L.epn A.1.2方法原理根据油菜茎基溃疡病菌为害症状、病菌形态学特征、PCR反应目标片段的特征为鉴定依据 A.2基本情况油菜茎基溃疡病也称十字花科蔬菜黑胫病,主要为害油菜等十字花科作物,其致病力强,可引起产量损失10%一20%,我国多次在加拿大和澳大利亚进口的榨油用油菜籽上截获过该菌其近似种 Leptosphaeriabiglobosa(我国有分布)也在油菜等十字花科作物上引起茎秆部位的变黑,称油菜黑胫病(blackleg),但其致病力较弱,一般为害植株茎的中上部 A.3寄主范围主要寄主是油菜以及其他十字花科蔬菜,包括芸苔属(Brassica)的一些种,例如油菜(B.campes ris)、大白菜(B.raa iunceavar.tumida、芜菁甘蓝(B.nabusvar na subsp pkinensi).榨菜(B. ns)黑并(B.nigra),甘蓝(B.aleruca)花椰菜(B.oleruedvar.buryuis),结球甘蓝(B.lraca var.capilala),芜菁(B. estri);野生寄主有葱芥(Aliariaetiolala),菊科(Asteraceae),龙胆目 cam e Gentianales),屈曲花属(Iheris),香雪球(L.obwlariamarilima),紫罗兰属(Mahiola),柳叶菜科(On agraceae),萝卜属(Raphanus),野芥(Sin is)和薪聋(Thaspi 4rUeSe， napisarvuensi3 病害症状病菌对幼苗和成株都引起为害,主要症状是叶部损坏、变色,茎部溃疡受害的茎、叶上有灰色斑 5
GB/I31793一2015 点,茎基部有凹陷的溃疡斑,上有黑色小点,根部病斑长条形,易腐朽发病严重时,茎溃疡环绕茎基部导致茎部变弱、植株倒伏,甚至死亡油菜茎基溃疡病症状参见图A.1 2mm 说明: 子叶接种症状(标尺=2mm); 叶片症状; 茎基部症状 cd 图A.1油菜茎基溃疡病症状 A.5分布 51 无分布.广泛分布亚洲、非洲、美洲、欧洲和大洋洲等地欧洲;奥地利、比利时、保加利亚、捷克、丹麦、爱沙尼亚、芬兰、法国、德国匈牙利,爱尔兰、意大利拉脱维亚、立陶宛、马耳他、荷兰、挪威、波兰、葡萄牙、罗马尼亚、俄罗斯、斯洛伐克、西班牙,瑞典、瑞士、乌克兰英国亚洲;亚美尼亚、印度,伊朗,以色列、日本,哈萨克斯坦,韩国,朝鲜将吉尔吉斯斯坦,巴基斯坦、马来西亚、菲律宾、泰国、土耳其非洲;埃及、埃塞俄比亚、肯尼亚,莫桑比克、尼日利亚、赞比亚、津巴布韦,南非美洲:美国、,加拿大、墨西哥、哥斯达黎加、萨尔瓦多、巴拿马、波多黎各、阿根廷、巴西大洋洲;澳大利亚、,新西兰、新喀里多尼亚,巴布亚新几内亚 A.6培养基马铃薯葡萄糖培养基(PDA);去皮马铃薯200g,切碎,加适量蒸僧水煮沸20min左右,双层纱布过滤,在滤汁中加人葡萄糖20g,琼脂18g,继续煮至琼脂完全溶化后,加蒸僧水补足10001 mL,121C高压灭菌20 min 酸性马铃薯葡萄糖琼脂培养基(APDA:去皮马铃薯200g,切碎,加适量蒸僧水煮沸20min左右双层纱布过滤,在滤汁中加人葡萄糖20g、琼脂18g,继续煮至琼脂完全溶化后,加蒸榴水补足 1000mL，121C高压灭菌20min 培养基冷却至50左右时,无菌操作条件下,加人85%乳酸 0.6mL，摇匀,倒皿备用
GB/T31793一2015 附录 B 资料性附录 DNA提取方法离心管加人300AL一500ALCTAB缓冲液(其中含0.1g蛋白酶K)混匀.65C水浴1h;13000g 离心5min10nmin,保留上清液;加500AL三氯甲烧:异戊醇(体积比为24:1)混匀,13000g离心 5min10min，保留上清液;再加500al三氧甲烧:异戊醇(体积比为24:1)混匀.13000离心 5min~10min，保留上清液;加人1ml异丙醇混匀,一70C下放置1h,或一20C过夜;13000g离心 30min，可见DNA沉淀;70%乙醉洗DNA沉淀,室温干燥;用30AL~50lTris-EDTA缓冲液溶解 DNA,待用
GB/I31793一2015 附录 c 资料性附录菌落培养性状和病菌形态特征图 1Om 说明: 菌落形态; 菌落和分生袍子器(标尺=1mm) 分生抱子器及分生抱子团(标尺=100m); 分生袍子(标尺=10m) 图C.1菌落培养性状和病菌形态特征图
GB/T31793一2015 附录D 资料性附录 Leptosphaeriamaeulans与其近似种L..biglobosa的形态比较表D.1Leptosphaerimaewlans与其近似种Lbiglobosa的形态比较项目 Leptosphaeriamaculans Leptosphaeriabigloosa 菌落(PDA上无色素产生黄色色素气生菌丝发达白或微黄色,老龄有浅淡黄棕色的菌丝气生菌丝白色、多而致密,分枝较多油状液滴分泌 )×(o. 分生袍子 3.3m~6.l4m)X(1.44m2.4Am (2.5m~3.0Am) ),8Am~l.l4m) 子囊抱子萌发速度慢,萌发芽管短萌发速度快,萌发芽管长
GB/I31793一2015 参考文献 [1]周国梁,尚琳琳,林泌,等.油菜茎基溃疡病菌的实时荧光PCR检测[J].植物病理学报,201l， 411);l0-17. aA stemcankerLe [2]FittBBH，BarbettiM，etal.worldwidei ofphoma importance -eptospha ofPlantPa andL.igon oilseedrapeBrassicnap4s)[] European eria7qcula7n Osqon lOurnal 2006，114:3-15 hoogy [3]LiuSY，LiuZ，FittBDL，etal.ResistancetoLeptoshaeriamaculansphomastemcan ker)inBrasicdnapusoilseedrape)inducedbyL.bigobosaandchemicaldefenseactivatorsinfield andcontrolledenvironments[J].PlantPatholo 2006，55;401-412. ogy [4们 TaylorJL A simple，sensitive，andrapidmethodfordetectingseedcontaminatedwith higehlyvirlentLepshaeriamaeulan].AppliedandEnviromentalMlierobioloey 1993，59(l1): 3681-3685. Epdemiology WestJS，KharbandaPD，BarbettiMJ，etal andmanagementofLepto shaeriamaculans(Phomastem.canker)onoilseedrapeinAustralia.CanadaandEurope].Plant Patholog 2001，50:l0-27 [6]ZhouY，FittBDL，WelhamSJ，etal.Effectsofseverityandtimingofstemcanker(Le ophaeriamaculans)symptomsonyieldofwinteroilseedrape(BrassicaapusintheUK[CJ] Eu ropeanJournalofPlantPathology，1999，105:715-728. 10o

油菜茎基溃疡病菌检疫鉴定方法GB/T31793-2015

油菜茎基溃疡病是一种常见的植物病害，会导致油菜茎部出现坑状溃疡，从而影响油菜的正常生长和发育。为防止该病传播，需要对携带茎基溃疡病菌的材料进行检疫鉴定。下面将介绍GB/T31793-2015标准中规定的油菜茎基溃疡病菌检疫鉴定方法。

样品处理

样品应从疑似感染的油菜株或其它植物器材中采集，每个样品重量不应少于100g。在采集过程中，应选择健康、无斑点和病损的部位作为样品。

分离鉴定

将样品表面消毒后，取样品1g，加入10mL生理盐水中，振荡25分钟。倒出液体，留下细菌沉淀，加入5mL无菌蒸馏水再次振荡25分钟，制备10倍稀释液。将100μL的10倍稀释液均匀涂布在KMB（King's B Agar）平板上，培养28℃存放48小时。

鉴定结果根据病菌形态、生理特性和分子生物学鉴定等方面确定。其中，油菜茎基溃疡病菌为假单胞菌属杆菌，培养基上呈圆形、直径1-3mm、黄色至橘黄色的小半透明菌落。产生氧化亚铁反应、可利用半乳糖和甘露糖为碳源，而不能利用葡萄糖、蔗糖和果糖等特点。

检测限

本方法对油菜茎基溃疡病菌的最低检测限为10 CFU/ml。

结论

GB/T31793-2015标准中规定的油菜茎基溃疡病菌检疫鉴定方法可以有效地检测到该病害，并为保障国内油菜生产提供了可靠的技术支持。