GB/T35520-2017
化学品胚胎毒性胚胎干细胞试验
Chemicals—Embryotoxicity—Embryonicstemcelltest
- 中国标准分类号（CCS）A80
- 国际标准分类号（ICS）13.300;11.100
- 实施日期2018-07-01
- 文件格式PDF
- 文本页数22页
- 文件大小1.96M
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化学品胚胎毒性胚胎干细胞试验
国家标准 GB/T35520一2017 化学品胚胎毒性胚胎干细胞试验 Chemieals一Embryoosicity一Embryomiestemcelltest 2017-12-29发布 2018-07-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T35520一2017 引 言 小鼠胚胎干细胞(Embryoniestem cells,ES)在不同的培养条件下会分化为不同的胚胎组织
因 此,一些研究小组使用小鼠Es细胞进行体外胚胎毒性试验
Laschinski等比较了ES细胞和小鼠纤 维母细胞的细胞毒性,以评估致畸物的潜在胚胎毒性
Heuer等口比较了ES细胞的细胞毒性和分化 抑制
Newall和IBeedles测定了培养7d后,致畸物对ES细胞的细胞毒性和集落形成能力的影响 这适用于常规测试,因为集落形成这一终点可自动化完成
在所有这些试验中,只有一些胚胎毒性物能 够被正确分类
这可能是由于在ES试验中选择2个终点不足以评估胚胎毒性
为克服上述ES细胞试验的限制,Spielmann等确定了3个不同的试验终点(半数分化抑制浓度 D3细胞半数生长抑制浓度和3T3细胞半数生长抑制浓度)
根据这些终点可导出3个变量
所得的 3个变量作为受试物分为3个体内胚胎毒性等级的依据
这种方法有利于给出胚胎组织与成体组织之 间对化合物细胞毒性损伤的敏感性差异
事实上,利用判别分析已将16种受试化学品正确归人已知的 及[s们
这是第一个不处死妊娠动物而获得体外培养所需胚胎组织的体外胚胎毒 3种体内胚胎毒性等级 性测试
在本标准中为验证研究制定的标准操作程序克服了实验室中Es状态维持的问题,ES细胞通常倾 向于自发分化
此外,根据制定的性能标准,欧盟替代方法验证中心(EuropeanCentrefortheValidationofAlter nativeMethods,ECVAM)验证研究表明体外数据和体内数据之间具有较好的相关性(准确性78%) 据报道,强胚胎毒性化学品的预测性(100%)极好、精确度(81%)良好
据报道,无胚胎毒性物质和胚胎 毒性弱的物质的预测性(分别为72%和70%)和无胚胎毒性物质的精确度(70%)较高(>65%) 然而，一个特例出现于强胚胎毒性化学品氯化甲基汞的错误分类,在8个试验中的4个试验里,被 预测为无胚胎毒性的化学品,而不是强胚胎毒性的化学品
这种误分类出现的原因可能是用于建立预 测模型的训练集未包括具有类似细胞毒性模式的化学品
GB/35520一2017 化学品胚胎毒性胚胎干细胞试验 范围 本标准规定了化学品胚胎毒性胚胎干细胞试验的术语和定义、试验原理、试验方法、质量控制和结 果评价
本标准适用于应用胚胎干细胞试验测试化学品的胚胎毒性
术语和定义 下列术语和定义适用于本文件
2.1 medianinhibitionofdifferentiationm 半数分化抑制浓度 ID 化学品抑制50%ES细胞分化为心肌细胞的浓度
2.2 medianinhibitionofgrowthofD3 D3细胞半数生长抑制浓度 Ca 化学品抑制50%ES细胞系D3生长和活性的浓度
2.3 313细胞半数生长抑制浓度 medianinhibitioofgrwthof313 IC C0sT 化学品抑制50%3T3细胞生长和活性的浓度
试验原理 胚胎毒性测试或用妊娠动物进行体内试验,或用培养的胚胎以及取自妊娠动物的胚胎组织、细胞进 行体外试验
不管体内还是体外测试,都得处死妊娠动物时
利用胚胎干细胞体外培养无限增殖与分 化的潜能,提出了一种利用小鼠永生化细胞系的体外胚胎毒性测试,即胚胎干细胞试验可 本试验是基于胚胎毒性作用中最重要的指标,即受试物对胚胎组织和成体组织的毒性损伤存在敏 感性差异,这种差异与胚胎分化抑制密切相关
使用两个永生化小鼠细胞系,ES细胞(D3)和纤维母细 胞(3T3细胞)分别表示胚胎组织和成体组织
只有在添加小鼠白血病抑制因子(mLIF)的培养条件下 ES细胞保持在未分化阶段才可进行该试验
去除未分化状态,ES细胞会形成拟胚体(EB),并在适当 条件下分化为主要胚胎组织
细胞毒性数据表明,ES细胞比成体细胞对毒性药剂更敏感
ES细胞分化抑制和ES细胞与3T3 细胞生长抑制是EST中用于预测化学品潜在胚胎毒性的3个选用的终点
GB/T35520一2017 试验方法 4.1材料 4.1.1细胞系 BALB/c3T3细胞,细胞克隆A31号,建议使用德国,Eschewege,ICN-Flow(编号:03-465-83)或美 国典型培养物保藏中心(ATcC;编号:CCL-163)
小鼠ES细胞D3,建议使用RolfKemler教授(德国 弗莱堡马克斯普朗克研究所)或美国典型培养物保藏中心(ATCC;编号:CRL-1934)
若使用其他来 源细胞,需验证其有效性
4.1.2主要设备 细胞培养箱(37士1,5%士1%cO),层流洁净工作台,水浴槽(37C士1C),相差显微镜、 酶标仪、细胞计数器等
4.1.3化学品、培养基、血清 DMEM培养基、IL-谷氨酰胺、胎牛血清(FCS)、胰蛋白酶/EDTA溶液、青霉素/链霉素、二甲亚硕 DMSO)、非必需氨基酸(NAA)、3-硫基乙醇(3ME)、小鼠白血病抑制因子(mLIF),嚓幽蓝(MTT、 异丙醇、十二炕基磺酸钠(SDs)、不含钙镁的磷酸盐缓冲液(PBS)、5-氟尿嗜(5-FU)、青霉素G、台盼 蓝,乙醇等
4.2试剂的准备 4.2.1小鼠白血病抑制因子 产品原液(mlIF)进行ES细胞常规传代时直接加人培养板或培养瓶
LIF溶液浓度为10'U/mL -20C下分装储存
解冻后,将分装IIF溶液储存在4C(1年稳定)
如果使用浓度为10U/ml的 LIF,则在PBS(含1%sA)或细胞培养基中制备1:10稀释液,并按照厂家说明书如上进行储存
4.2.2胎牛血清 FCS解冻后在56C下30min热灭活
4.2.3B-硫基乙醇 在PBS中制备10mmol/L3-ME工作液,最长可使用1周(4储存)
4.2.4完全培养基 制备不含LF的完全培养基
完全培养基最长使用1周(4C储存). 完全培养基配方见表1
表1完全培养基配方 用途 3T3细胞 ES细胞 20%FCS,2tmnmol/I1-谷氨酰胺,50U/ml青霉 10%FCS,4mmol/LL谷氨酰胺,50U/ml 常规培养 素,504g/nml
链霉素,1%NAA,0.1mmol/18 青霉素,504g/ml链霉素 ME,1000U/mlmLIF(直接加人培养板中
GB/35520一2017 表1(续 用途 3T3细胞 ES细胞 10%FCS,4mmol/Il-谷氨酰胺,50U/ml.20%FCS,2mmol/l-谷氨酰胺,50U/ml青霉 试验 青霉素,504g/mL链霉素 索,504g/ml链霉素,1%NAA,0.1mmol/1-ME 40%FCS,2mmol/1l谷氨酰胺,50U/ml青霉 20%FCS,4tmtm0 mol/L.L谷氨酰胺,50U/n ml 素,504g/ml
链霉素,1%NAA,0.1mmol/L8 冻存 青霉素,504g/ml链霉素,10%DMSO ME,10%DMso 4.2.5T溶液 以PBS制备5mgMTT/ml
储备溶液,过滤(0.2"m),分装储存于-20C
4.2.6Mr裂解液 3.49mL20%sDS储备溶液(终浓度为0.7%),加96.51mL异丙醇
临用现配(若出现沉淀物,加 热至37C)
4.3试验步骤 4.3.1ES细胞分化试验(ID.测定) 4.3.1.1受试化学品所用溶剂及最大试验浓度选择参见附录A,浓度级数的设计参见附录B
溶剂终 浓度应保持一致,无细胞毒性,不应对细胞分化产生任何其他影响
所有化学品的最高受试溶度为 4g/ml.
不应使用完全培养基(含添加物)配制储备液,避免血清蛋白、受试化学品或其他成分反 1000" 复冻融时产生沉淀 43.1.2进行各试验前对化学品称重和溶解,包括作为阳性对照的5FU
第3天和第5天使用时(更 换培养基),可使用试验开始前制备的储备液(若在一20C分装储存)
阳性对照和阴性对照化学品盘 尼西林G可从100mg/mlPBSs冷冻储备溶液中配制,阳性对照5-FU为固定浓度
4.3.1.3由于强酸和强碱可能会影响培养基的缓冲容量,培养基稀释后需通过光学检测给出化学品最 高测试浓度的pH值
如果培养基变为紫色或金黄色(pH>8或pH<6.5),应使用0.1mol/1.NaOH 或0.1mol/儿HCl中和受试化学品的储备溶液 4.3.1.4细胞分化试验按照附录C程序进行
第0天,在测试培养基和含Es细胞的溶液3.75× 10'细胞/mL)中制备一定浓度序列的受试化学品
在培养基中制备受试化学品后,最后添加胰蛋白酶 消化ES细胞,以避免细胞在培养箱外放置时间过长
在60nmm培养中制备ES细胞悬液,防止ES 细胞粘附
在完成下列步骤时应不时轻微拍打细胞,使其悬浮,室温条件下放置时间尽可能短(将一小 份细胞悬液进行台盼蓝染色试验,检测细胞活性
活性>90%可用于试验)
注意不应超出允许的溶剂 最高浓度,保持受试化学品各浓度溶液中的溶剂浓度 致
利用移液器将20AL含有适当受试化学品 的细胞悬液(约750个细胞)分配到100mm培养皿盖内面
每盖吸移50滴80滴
每种浓度的受试 化学品使用一个培养皿作为空白对照(测试培养基)和溶剂对照
将盖子小心放回常规位置,并放在装 满5mlPBS的培养皿顶部
在37含有5%CO的潮湿空气中培养3d
4.3.1.5第3天,制备第0天时同样测试液
每种浓度的受试化学品使用一个培养皿作为空白对照(测 试培养基)和溶剂对照
用移液管将5ml含有适当浓度的受试化学品或溶剂的培养基吸移到“悬滴” 培养皿盖中
拿着盖子,使其呈约45"角,使EB冲洗到底部
使用5ml无菌移液管(避免对EB造成 损害),将整个悬液轻轻转移到60mm培养皿中
注意,“悬滴”的化学品浓度与培养皿相同
在37
GB/T35520一2017 含有5%CO，的潮湿空气中培养EB悬液2d
4.3.1.6第5天,制备第0天时相同的测试液
每种浓度的受试化学品使用一个24孔板作为空白对照 分析培养基)和溶剂对照
将1mL试液吸移至24孔组织培养板的各孔中
每个孔添加一个EB 在37含有5%co，的潮 40L).注意,源于某种特定试液的BB要转移到具有相同浓度的试液中 湿空气中培养5d
4.3.1.7试验第10天,在光学显微镜下确定其是否分化为搏动的心肌细胞
检查孔板的各个孔并记录 含有自发收缩细胞的孔数量
使用电子数据表(参见附录D)进行数据记录
4.3.2细胞毒性试验(IC卵和IC0n测定 4.3.2.1受试化学品浓度选择同4.3.1.1
最好应用倍比稀释准备一系列浓度(图1. 200l 400l200l 图1受试化学品浓度倍比稀释示意图 4.3.2.2确定浓度范围预试验使用受试化学品的最高可溶浓度和溶剂的无细胞毒性浓度作为最高测试 浓度
制备8种稀释液的稀释级数,每种稀释液的稀释倍数为1:10.
4.3.2.3主试验利用更小的稀释倍数制成7个浓度序列(参见附录B),涵盖浓度范围预试验确定的剂 量反应范围
制备1种浓度的阳性对照化学品
最小实际稀释倍数为1.5倍
4.3.2.4由于挥发性化学品在测试条件下易挥发,因此孔板应用不透挥发性化学品的cO渗透性塑料 薄膜密封,从而减少挥发
4.3.2.5细胞维护和培养按照附录E规定的操作程序进行
细胞毒性试验按照附录F规定的程序进 行
第0天,在常规培养基中制备1×10'细胞/ml.的细胞悬液
使用多通道移液管将50L培养基吸 移至96孔组织培养微孔板的外围孔中(空白孔)
在剩余的孔内,装人50Al.1×10'细胞/ml的细胞 悬液(500个细胞/孔)
将一小份细胞悬液进行台盼蓝着色试验,进行细胞活性检测
活性90%可用于 试验
在37C含有5%cO的潮湿空气中培养细胞2h
培养2h后,添加150L含有适当浓度的受 试化学品(注意,150L应包含1.333倍终浓度的化学品)的测试培养基
用移液管将150l无化学品 的测试培养基吸移至外围孔(空白孔)中
在5%cO和37C条件下培养3d
4.3.2.6第3天,使用连接到泵的巴斯德移液管或多通道移液管移出试液(外围孔除外)
注意不要破 坏孔底部的细胞层
添加200AL新鲜制备的试液(最终浓度/孔与第0天一样)
在5%CO/37C下 培养2d
第5天,使用连接到泵的巴斯德移液管或多通道移液管移出试液(外围孔除外)
再添加 4.3.2.7 200从L新鲜试液(最终浓度/孔与第0天一样)
在5%co./37C下培养5d
4.3.2.8试验第10天时,测定细胞生长抑制情况
在550nm一570nm下利用微孔板检测仪测定所得 有色溶液的吸光度值,采用630nm作为参考波长
4.4独立运行 重复试验至少1次(2次有效试验);试验开始前准备培养基与测试液;第2次实验中使用的试剂应
GB/35520一2017 独立准备
质量控制 5.1细胞质量控制 5.1.1Es细胞分化试验 分化期(10d)结束后,检查溶剂对照板
如果24个EB中至少有21个分化为自发收缩心肌细胞， 则试验合格
5.1.2细胞毒性试验 细胞的正常生长行为是生长抑制为基础的所有细胞毒性试验的先决条件
因此,进行MTT试验 后第10天,检查溶剂对照孔(96孔板第2列和第11列,见附录G)的绝对吸光度值(550nm570nm 条件下的oD值)
根据历史资料,测试值应在表2置信范围内
表2测定吸光度的置信区间 细胞系 来源 95%置信区间(550nm570nmOD值 Kemler 0,15一0,8 D3 ATCC 0.901.6 CN-Flow 0.501.3 3T3 ATCC 0.150.6 5.2检测质量控制阳性对照 复苏一批冷冻细胞后、,测试相关化学品前,使用5-FU作为阳性对照化学品检查试验的质量
通过 ES细胞确定ID值
5-FU最大测试浓度为14g/mL,从浓度为2mg/mL的PEBS储存液开始稀释 测定Es和3T3细胞的5-FU的IC值
5-FU对于EsD3细胞的IC值范围应在0.0484g/ml 0.086 /mL0.5 mL /mlL，5-FU对于3T3细胞的IC值范围应在0.124g/ g 4g/n 5.3胎牛血清质量检测 首先在不使用化学品的分化试验中测试相关的FCS批次,进行至少2次独立测试,结果应为24个 孔中至少有21个搏动的心肌
应使用已知质量较好的一批细胞进行测试
然后,应根据阳性对照浓度 测试5-FU至少2次
结果评价 6.1 -般性评价 评估结果以2个细胞系中测定的三个试验终点值D,ICo和ICmsr为基础
可采用几种方法计 算ID.,ICa和ICmsr;最简单的方法是使用概率作图法,为log,y为概率单位,其中r轴表示测试 浓度，y轴表示效应百分率
模拟浓度反应曲线的生物统计方法能更加准确地计算ID.和lIC0,并且能 够计算这些值的置信区间
GB/T35520一2017 6.2终点计算 6.2.1ES细胞分化试验 第10天时,确定24孔溶剂对照板中含有搏动心肌细胞的孔数量
设定该数为100%
确定用一 定浓度的受试化学品进行处理的各孔板中含有收缩区域的孔数量
计算溶剂对照板的分化抑制,以% 表示
使用电子数据表(参见附录D)进行数据记录
计算ID值
6.2.2ES细胞和3r3细胞的细胞毒性试验 确定空白孔的平均oD(550nm一570nm),从96孔板的所有OD值中减去这个值(这样可正确计 算关于染料对孔板塑料黏附性的所有值)
确定未经处理的溶剂对照的平均OD(550nm一570nm)
将该值设定为100%细胞活性
确定第4列到第10列(附录G)各列的平均OD(550nm570nm),各 列表示一种浓度的受试化学品
将该值表示为细胞活性(空白对照组的%)
6.3数据记录 将酶标仪产生的吸光度数据文件直接传输/复制到EXCEL电子数据表中(参见附录D)
该电子 数据表以标准格式保存数据,便于对不同实验室生成的数据进行生物统计评估
可自动计算平均OD 值、标准偏差和话性
可根据电子数据表或利用各实验室使用的酶联免疫检测仪软件计算IC,值
应 填写模板所有字段
6.4分类 为预测受试化学品的潜在胚胎毒性,预验证研究期间利用德国动物实验替代方法验证中心 ZEBET)获得的数据改进了最初提出的预测模型(PM). 6.4.1终点 试验终点包括 IC C03T3; ICR说 08; ID0
6.4.2变量 计算变量包括 Ig(IC0r); Ig(ICw); IC08T;一ID.n/IC03T3
6.4.3线性判别功能I、和皿 采用式(1),式(2),式(3)分别计算函数I、l、I 十3.500g(cam)一5.307[(can-ID.)/Ican 15.27 =5.916lg(ICnT)十 M 6.85 =3.651lgIC0srm十2.394lgIC0n 2.033[(IC0sr一Dm/IC 508T3
2 ID IC 2.67 0.125g(can)-1.9171e(Caw)+1.500[(can 一03Ts 3
GB/35520一2017 6.4.4分类标准 根据表3分类标准进行受试化学品的胚胎毒性分类
16种化学品历史对照数据参见附录H 表3化学品胚胎毒性分类标准 判定标准 分类 类;无胚胎毒性 若1>且I>m 2类胚胎毒性弱 若l>1且I>m 3类;胚胎毒性强 若业>I且川>I
GB/T35520一2017 附 录 A 资料性附录) 受试化学品溶解度预测试 受试化学品溶解度的预测试见图A.1
按3001 吧是否溶于 是 按100mgmL是否溶于 是 作为储备液用于试验！ PBS或DMEM PBS或DMEM 在加入!倍体积乙脖后易洛 按10mg'mL是否溶于 且以培养基1:100稀释后无 PBs或培养基 沉淀产生 按100mgml溶于DMSo且以培 按200mgmL易溶于DMso且 养基1:400稀释后无沉淀产生 以培养基1:400稀释后无沉淀 产生 是 按15mgml易溶于DMMSo且以 在最后两个步骤之间找到最 高溶解浓度因子3 培养基1:400稀释后无沉淀产生 按5mgml易溶于DMso且以培 养基1:400稀释后无沉淀产生 将乙醉作为溶剂进行上述 操作 不相粗落或使用另一种落剂 说明: DMEM 无添加培养基 培养基 -完全培养基; 细胞毒性和分化试验中要使用的溶剂最高终浓度应为;PBs或DMEM,1%;乙醇,0.5%;PSs中50%乙醇,1% DMSO,0,25%
图A.1受试化学品溶解度预测试方案
GB/35520一2017 附录 B 资料性附录 十进制几何浓度序列 -般情况下,剂量反应关系为非线性,但可通过工轴对数变换在一定程度上使其线性化
通过回 归分析或图解估计计算IC值需这样处理
如果采用等差法确定剂量级数,工轴变换会导致测定点分布不均
因此,建议采用几何浓度级数 固定稀释因子)
最简单的几何级数是对倍几何级数,如因子2
Hackenberg和Bartling首先在毒理学和药理学研究中使用十进制几何浓度序列稀释法,其优点是 便于比较剂量宽和剂量窄的独立试验,而且可一起计算
如图B.1所示,3.16的稀释因子将10100的一个log单位分为等距离的2级,2.15的稀释因子分 为3级,1.47稀释因子分为6级,1.21稀释因子分为12级
10 31.6 100 21.5 46.6 100 l00 14.7 21.5 31.6 46.6 68.l 17.8 21.5 26.1 l0 12.1 14.7 3l1.6 38.2 46.6 56.1l 68.1 82.2 l00 图B.1十进制几何序列设计示例 因此,为实现更简便的数据生物统计评估,建议使用十进制几何浓度级数而非对倍几何级数 十进制几何浓度级数很容易得出
以因子1.47为例,加人0.47体积的稀释液稀释1体积的最高浓 度的溶液,混合均匀,取1体积此溶液加人0.47体积的稀释液,如此类推
由于浓度数量有限,使用在标度的两端(如3.16或2.15)包含较大稀释步骤和预计IC附近(如1.4打7 或1.21)包含较小稀释步骤的浓度级数可能有用
GB/T35520一2017 附 录 规范性附录) ES细胞分化试验步骤 c.1第1步 制备含浓度梯度受试化学品和ES细胞(3.75×10'个/mL)的测试培养基,悬滴法培养细胞3d(每 个浓度的受试化学品使用一个培养m;以测试培养基为空白对照),诱导ES细胞集落形成
见图C.1
750个细胞/20山测试液 约0滴7盖-0滴厂盖 图c.1悬滴培养 C.2第2步 制备与第1步相同的测试培养基,细胞悬浮培养2d每个浓度的受试化学品使用一个培养皿;以测 试培养基为空白对照),分化形成EBs
见图C.2
每皿悬滴细胞团+5ml测试液 图c.2悬浮培养 C3第3步 制备与第1步相同的测试培养基,24孔板贴壁培养5d(每个浓度的受试化学品使用一个孔;以测 试培养基为空白对照),EB分化为心肌细胞
见图C.3
1mL测试液/孔+lEB孔 图C.3心肌细胞分化 0
GB/35520一2017 录 附 D 资料性附录 数据记录用ExCEL电子数据表 D.13T3细胞IT试验记录 示例见图D.1
代码号 血清厂家): 观察者 血清(产品编号. 试验日期开始 血清批号 试验日期结束): 溶剂 溶剂终浓度 细胞传代数 细胞系来源 储备液浓度 参考滤波器(630mm) 是/否 MT检测3T3 B C D G H 空白 溶剂阳性 溶剂空白 对照 对照对照 对照对照 5-EU 浓度(g/mL 均值 校正均值 溶剂对照均值 标准差 活性[% 图D.1313细胞毒性数据记录示例 11
GB/T35520一2017 D.2D3细胞MT试验记录 示例见图D.2
代码号: 血清(厂家) 观察者 血清(产品编号 试验日期(开始 血清批号: 试验日期(结束 溶剂 细胞传代数 溶剂终浓度: 细胞系来源 储备液浓度 参考滤波器(630nmm) M检测D3 空白 溶剂阳性 溶剂空白 对照 对照对照 对照 对照 低 高 5-FU 浓度(g/mL 均值 校正均值 溶剂对照均值 标准差 活性[%] 图D.2D3细胞毒性数据记录示例 12
GB/35520一2017 D.3D3细胞分化试验记录 示例见图D.3
代码号 血清(家, 观察者 血清(产品编号 试验日期开始).: 血清批号): 试验日期(结束 溶剂 细胞传代数 溶剂终浓度 细胞系来源: 储备液浓度 参考滤波器(630nmm) 分化试验 培养基 溶剂 对照 对照 浓度mL 含EB的孔 含心肌的孔 含心肌的孔/% 收缩% 100 剂量反应曲线 3T3D3细胞 MTTEST3T3 MTTTESTD3 10o l.0(gml 图D.3D3细胞分化数据记录示例 13
GB/T35520一2017 附 录 E 规范性附录) 细胞维护和培养程序 E.1ES细胞和Balb/e3T3细胞常规培养 E.1.1培养条件 ES细胞和Balb/c3T3细胞通常在培养皿或培养瓶内,37C/5%CO的潮湿空气中长成单细胞 层
每天在相差显微镜下检查细胞
应注意形态或其贴壁特性的变化
使用前,应在水浴器或培养器中将溶液预热至37C 当细胞达到80%融合时,用胰蛋白酶化从培养皿或培养瓶中消化下来,步骤如下 轻轻吸弃培养基,并用不含钙和镁的PBS清洗培养物2次
轻轻拍打,清洗细胞,去除可能会抑制胰蛋白酶活性的任何培养基添加剂
弃去冲洗液
E.1.2ES细胞的胰蛋白酶消化 操作如下 在单细胞层中添加1nmL2mL.预热的胰蛋白酶/EDTA溶液,保持几秒钟
在胰蛋白酶/EDTA溶液中添加6mL培养基 使培养瓶底部的剩余细胞重新悬浮
在80x些条件下用离心机分离细胞悬液10mimr E.1.3Balb/c3T3细胞的胰蛋白酶消化 操作如下 在单细胞层中添加1ml2ml预热的胰蛋白酶/EDTA溶液,保持儿秒钟 去除多余的胰蛋白酶/EDTA溶液,在37C下培养细胞
2min 到3min后,轻敲培养瓶或培养皿,使细胞分离为单个细胞悬液
E.2 细胞计数 操作如下 -用离心机分离并弃上层清液或分离细胞后,添加0.1mL0.2mL常规培养基/em
如果想 要开始分化试验,在这一步所得到的D3细胞密度不得低于1×10"细胞/mL
通过轻轻拍打使单细胞层分散
重要的是获得单个细胞悬液,以进行正确计数
使用血球计或细胞计数器计算得到的细胞悬液样品
E.3传代培养 确定细胞数量后,培养物可传代培养或者在试验中使用
通常每2d3d在细胞密度约为5× 10'细胞/ml(1×10'细胞/cm')的条件下传代ES细胞和Balb/c3T3细胞
对ES细胞使用25cm'方 14
GB/35520一2017 瓶或培养皿(601 ),对3T3细胞使用75cm'方瓶或培养皿(100mm)
mm E.4冻存 ES细胞和Balb/c3T3细胞可装人无菌冻存管,储存在液氮中
DMsO用作低温防护剂
操作 如下: 在200g下用离心机分离胰蛋白酶化细胞101 min
丢弃上层清液,使细胞在浓度为1×10”细胞/ml5×10"细胞/ml的冷冻培养基中重新悬 浮,每个冻存管装人1ml细胞悬液
以1C/min的冷冻速率冷冻细胞直到达到-70C-80C
可通过不同的技术实现
-将冻存管放人液氮进行储存
E.5复苏 按下述顺序操作 将安瓶放在37C的水浴中,使细胞解冻
时间尽可能短 使细胞在常规培养基中重新悬浮,用离心机分离,去除DMso
轻轻倒出上层清液,使细胞团 块在常规培养基中重新悬浮
使用经过明胶处理的培养可大大改善解冻后ES细胞对孔板 的附着性
对于常规培养(首次传代后),使用未经过明胶处理的培养m 在37C含5%cO的潮湿空气中培养
在细胞毒性测试中使用细胞前进行2次一3次传代 复苏后,细胞应维持25次传代以下(即2个月,每周3次传代)
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GB/T35520一2017 附录 F 规范性附录) 细胞毒性试验(ES和3T3细胞)步骤 试验步骤见图F.1
接种细胞于6孔板500个细胞/0培养基孔 37C/5%Co,培养2" 第1步，每孔加入I叫含受试化学品的培养基(8个浓度 以养为空白对照 37c/59%co,培养3d 弃去测试培养基 第2步;每孔加入200l含受试化学品的培养基浓度与第1步相同 37/5%Co,培养2d 弃去测试培养基 每孔加入20山含受试化学品的培养基(浓度与第1步和第2步相同) 第3步 37/5wco,培养5d 每孔加入20LMTT(5mgmL每孔 37C/5%CG co,培养2" 弃去MT液，每孔加入10LMTT裂解液(0.7SDs，獭.M%异丙梆 振荡15min 570mm波长测定OD值，参考波长630nm，检测MTT光吸收度 图F.1细胞毒性试验步骤 16
GB/35520一2017 附 录 G 规范性附录 细胞毒性试验孔板设置方案 在每个孔板中,对一种受试化学品使用如下所示设置方案(图G,1) 10 11 12 CO 受 试 化 学 品 溶 液 CO co C CO D co C(O E co P 度 到 浓 CO 低 用 co cO G CO CO H 说明 CO -溶剂对照; -空白孔(测试培养基); -阳性对照
注:第4列~第10列为受试化学品从低浓度到高浓度 细胞毒性试验孔板设置方案 图G.1 17
GB/T35520一2017 附 录 H 资料性附录) 历史数据 在ZEBET/BgVV测试的以下16种化学品是研发预测模型的数据依据
所有化学品均被正确分类
表H.1给出了汇总信息,有助于在其他实验室参考
表H.116种化学品历史数据 MTT试验 分化试验 C均值 ID.均值 受试化学品 美国化学文摘编号 4g/ml. 4g/ml 3T3细胞 ES细胞 ES细胞 第1组:非致畸剂 抗坏血酸 134-03-2 25.5 138 408 360 异烟阱 54-85-3 375 750 69-57-8 586 2950 3450 青霉素G 糖精 82385-42-0 3000 3498 2000 第2组:弱/中度致畸剂 阿司匹林 50-78-2 230 220 248 咖啡因 58-08-2 155 165 185 26 23 地塞米松 50-02-2 18.3 苯海拉明 147-24-0 30 29.5 6.7 630-93-3 35 20 苯妥英 27.3 53-86-1 27 29 呵嗓美辛 66 氨甲喋吟 59-05-2 0,015 0,074 0.020 第3组:强致畸剂 白消安 55-98-1 4.8 2.1 4.6 阿糖胞苷 69-74-9 0.033 0,024 0.029 5-氟脉喘唉 0.103 51-21-8 0.17 0.0289 127-07-1 2.0 羚基脉 7.2 维甲酸 302-79-4 1.0 0.005 0.000105 18
GB/35520一2017 参考文 献 [1]LaschinskiG.，VogelR.，andSpieln lmann，H.1991).Cytotoxity testusingblastoeystde rived euploidembryomalstemcelsanewapproach Reproduetive toinvitroteratogenesisscreening 5，57-64 To oxicology HeuerJ，GraeberIM，PohlI，SpielmannH1994).Culturesystemmforthedifferentiation andordevelop omurineembryonicstemcells-anewapproachtoinvitrotestingtorembryotoxicit EuropeanMedieinesResearch;PerspectivesinPharmacoto nxieoogyand mentalimmunotoxicology. Pharmmacovigilance;Serialtitle:BiommedicalandHealthResearch 134-145 HeuerJ,GraeberIM,PolI,SpielmannH(1994).Aninvitroembryotoxieityassayusing Toxicology thedifferentiationofembryonicmousestemcelsintohaematopoieticcells. inVitro8 558-587 [4]Newall，D.R.andBeedles，K.E.(1994).Thestem-celltest一Anovelinvitroassayforter Toxieoo8y )otential inVitro8，697-701 atogenlc [5]SpielmannH.，PohlI.，D6ringB,LiebschMandMoldenhauerF.1997)Theembryonic stemcelltest，aninvitroembryotoxicitytestusingtwopermanentmousecelllines:3T3ffibroblasts andembryonicstemcells.InVitroToxicology;aJournalofMolecularandCellularToxicology10(1). 119-127 GenschowE,SpielmannH,ScholzG,SeilerA，BrownN，PiersmaA，BradyM,Clemann L6 N，HuuskonenH，PailardF，BremerS，BeckerK2002)TheECVAMInternationalValidation StudyonInVitroEmbryotoxicityTests:resultsofthedefinitivephaseandevaluationofPrediction Models
Alternatives LaboratoryAnimalsATLA30，151-176 t0 Anon(2002).statementontheScdientifieValidityoftheEmbryonicstenmCellTest(EST) anInVitroTestforEmbryotoxicity.17thmeetingofEcVAMscientificAdvisoryCommittee，16-17 October2001，EcJRC ECVAM，Ispra，lItaly.In:EcVAMNews&.Views
Alternativesto LaboratoryAnimals 30，265-268 Schmidtw，KemlerR(1985).Theinvitrodevelopmentof Doetschmmann Eistetter blastocys-derivedembryonicstemcelllines:Formationofvisceralyolksac，bloodislandsandmyocar dium.JournalofEmbryologyandExperimentalMorphology87，27-45 [[9]SpielmannH.,PohlI.,D6ringBandMoldenhauerF.(1995).Invitroenmbryotoxieityassay usingtwopermanentcelllines;mouseembryoniestemcellsand3T3fbroblasts.Abstractsofthe23. ETsconference1995，Dublin.Teratology51，31A-32A
化学品胚胎毒性胚胎干细胞试验GB/T35520-2017解析
化学品可以通过多种途径进入人体，包括吸入、食入和皮肤吸收。其中，胚胎期的暴露可能会导致胚胎畸形、流产、早产、低出生体重等问题。因此，对于化学品的胚胎毒性进行评估非常必要。
GB/T35520-2017标准中的胚胎干细胞试验方法是一种替代动物实验的方法，其基本原理是使用胚胎干细胞作为模型细胞，通过检测化学品对这些细胞的影响来评估其毒性。这种方法具有高效、快速、准确等优点，且不需要动物参与，符合现代化学品评估的发展趋势。
胚胎干细胞试验方法的操作流程包括：培养胚胎干细胞、暴露化学品、观察细胞生长情况、评估细胞毒性等步骤。其中，评估细胞毒性可以通过细胞增殖率、细胞周期、凋亡率、基因表达等指标来进行。
在使用胚胎干细胞试验方法进行化学品毒性评估时，需要注意以下问题：
- 选择适当的胚胎干细胞，保证实验结果的可靠性；
- 采用正确的实验条件和检测方法，避免假阳性或假阴性结果的产生；
- 对于存在疑问的结果，进行重复试验或其他确认性实验。
总之，GB/T35520-2017标准中的胚胎干细胞试验方法为化学品胚胎毒性的评估提供了一种新的替代动物实验的方法，具有重要的意义。
