动物源性I型胶原蛋白成分测定聚丙烯酰胺凝胶电泳法

动物源性I型胶原蛋白成分测定聚丙烯酰胺凝胶电泳法

国家标准 GB/T38482一2021 动物源性I型胶原蛋白成分测定 聚丙烯酰胺凝胶电泳法 DeterminationofanimaltypeIcollagen- Polyaerylamidegelelectrophoresis 2021-12-31发布 2022-07-01实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标涯花管理委员会国家标准
GB/38482一2021 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由标准化研究院提出并归口 本标准起草单位;科学院烟台海岸带研究所、标准化研究院、上海海祥大学、海洋大 学、山东弘博标准化服务事务所、科学院过程工程研究所 本标准主要起草人;秦松、李杰,吴文惠,侯虎、马爱进,崔玉琳、陈军、韩春梅、黄永东
GB/38482一2021 动物源性I型胶原蛋白成分测定 聚丙烯酰胺凝胶电泳法 范围 本标准规定了用聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDSPAGE)测定动物源性I型胶原蛋白成分的方法 本标准适用于动物源性胶原蛋白产品中I型胶原蛋白成分的测定 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 药典(2015年版 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 胶原蛋白eoleen 以纯化的(非交联的)I型胶原蛋白为原料制备的左手螺旋的重复Gly-X-Y序列的3条肽链相互 盘绕成右手超螺旋结构特征的结构蛋白 注:Gly是甘氨酸,X通常是脯氨酸,Y通常是羚脯氨酸或胫赖氨酸 3.2 I型胶原蛋白typeIcolagen 由2条al链和1条a2肽链组成的具有完整三螺旋结构的胶原蛋白 原理 利用I型胶原蛋白具有其他蛋白质所没有的三股螺旋结构,配合特异性的胶原酶作用,通过考马斯 亮蓝对牛血清白蛋白(EBSA)染色极限的确定,利用SDS-PAGE法测定I型胶原蛋白的成分 试剂或材料 除非另有规定,仅使用分析纯试剂 5.1细菌胶原酶 5.2牛血清白蛋白(EBSA)标准品 5.3水 应符合GB/T6682中的一级水规定 5.420mma nol/L.磷酸二氢钠溶液,pH7.4
GB/T38482一202 称取无水磷酸二氢钠0.54g,加水,搅拌,定容至1L 测试pH值,微调至pH7.4即可 5.53%(体积分数)的乙酸溶液 量取3mL的冰乙酸,注人50.00mL水中,定容至100.00mL,混匀 5.60.5mg/mL的盐酸溶液 取1nmol/L盐酸溶液65.00mL,加水定容至1000mL 5.7胃蛋白酶溶液 用20mmol/L磷酸二氢钠溶液(pH7.4,内含0.1mmol/I氯化钙)溶解胃蛋白酶,配成含适当活性 单位的胃蛋白酶溶液(例如1.25U/mL) 5.8胶原酶溶液 用20mmol/几磷酸二氧钠溶液(pH7.4,内含0.1mmol/儿氯化钙)溶解胶原酶,配成含适当活性单 位的胶原酶溶液(例如1.25U/mL). 5.9牛血清白蛋白(BSA)溶液 用水将BSA稀释成梯度浓度,质量浓度在0.001nmg/ml0.025mg/mL 5.101mg/mlI型胶原蛋白标准溶液 用3%的乙酸将I型胶原蛋白标准品(Sigma-Aldrieh,纯度>99%)稀释成质量浓度为1mg/mL的 溶液 5.11 1 nmol/L浓缩胶缓冲液贮备液pH6.8 称取6.06g三胫甲基氨基甲烧,加适量水溶解,用0.5mg/mL的盐酸溶液调节pH值至6.8,用水 定容至50.00ml,4C下保存 5.121.5mol/儿分离胶缓冲液贮备液,pH为8.8 取9.08g三胫甲基氨基甲烧,加适量水溶解,用0.5mg/mL的盐酸溶液调节pH值至8.8,用水定 容至50.00mL,4C下保存 5.13电泳缓冲液(5×),pH8.3 称取15.1g三羚甲基氨基甲熔,72.0g甘氨酸,加人十二烧基碱酸钠5g.溶解,用盐酸调pH值至 8.3,加水定容至1000.00ml,使用前稀释5倍 5.14样品缓冲液(5× 取5mL ！mol/儿浓缩胶(pH6.8)缓冲液贮备液、2gSDS,1.2mL8筑基乙醇,8ml甘油,0.02g 澳酚蓝加人水中溶解,加水定容至40ml 5.151.00g/儿考马斯亮蓝染色液 称取1.00只考马斯亮蓝R-250,加人450.00m甲醇、,100.00ml冰醋酸、450.00ml蒸僧水 考马斯亮蓝脱色液 5.16 量取400mL甲醇、100mL冰醋酸,500mL蒸僧水,配制成1L的脱色液 仪器设备 6 6.1分析天平;感量0.0001g 6.2冷冻离心机:12000r/min,4C 6.3磁力搅排器 6.4具塞离心试管 6.5电泳仪 6.6凝胶成像系统
GB/38482一2021 测定步骤 7.1试样制备 7.1.1液体样品 取10mL样品，4C磁力搅拌4h,形成匀浆,10000r/min离心30min,上清液即为酸溶性胶原蛋 白 随后,用3%的乙酸将酸溶性胶原蛋白稀释成体积浓度为1%的溶液 7.1.2固体样品 称取1g样品,精确到0.1mg,加适量3%的乙酸溶解,封口后于4笔磁力搅拌器搅拌4h,定容至 10mL,再按液体样品操作 7.1.3凝胶状样品 用3%的乙酸将酸溶性胶原蛋白稀释成胶原蛋白质量浓度为1mg/mL一2mg/mL的溶液 7.2I型胶原蛋白成分的测定 7.2.1考马斯亮蓝对BsA的染色极限分析 取各浓度sA亲液20L上样 按照《药典(2015年版)054电泳法第四法规定 的方法进行sIsPAGE电汰,电冰结束后用凝胶成像系统对脱色后的胶片进行分析,确定考马斯亮蓝 对BSA的染色极限 7.2.2样品中I型胶原蛋白成分测定 样品a:用3%的乙酸溶解样品,使样品质量浓度为1mg/ml 样品b;用胶原酶溶液溶解样品,配制成样品质量浓度和样品a相同,于37C水浴中加热4h 样品c:取超纯水加胶原酶溶液,使胶原酶的质量浓度与样品b的质量浓度相同 上样分析将上述样品与2×的样品缓冲液等体积混合后,置于100C水浴中1min一2min,取出 进行sDsPNGE电泳 待测样品.IsA(取染色极眼量)和分子量标准品上样体积均为20L.,电泳电 压1l10V 电泳结束后用凝胶成像系统对脱色后的胶片进行分析,记录条带光密度 结果计算 8.1当样品b中所有条带光密度之和与样品e中所有条带光密度之和不相同时,按式(1)计算 X=A一B一C 式中 待测样品中I型胶原蛋白成分含量,%; 样品a中所有条带光密度之和,% A 样品b中所有条带光密度之和,% B C -样品c中所有条带光密度之和,% 8.2当样品b中所有条带光密度之和与样品c中所有条带光密度之和相同时,按式(2)计算 10000一M X ×100 10000
GB/T38482一2021 式中: X 待测样品中I型胶原蛋白成分含量,%; M BSA极限值 重复性 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的20%

GB/T38482-2021 动物源性I型胶原蛋白成分测定聚丙烯酰胺凝胶电泳法

I型胶原蛋白是一种重要的结缔组织蛋白，广泛存在于人体和其他动物的皮肤、骨骼、肌腱等组织中。其功能主要包括保持组织结构完整、提供机械强度、促进伤口愈合等。因此，在医学、食品、化妆品等领域，对I型胶原蛋白的成分测定具有重要意义。

目前，常用的I型胶原蛋白成分测定方法包括高效液相色谱法、氨基酸分析法、酶联免疫吸附法等。但这些方法存在成本高、操作复杂、检测时间长等缺点，限制了其在实际应用中的推广和普及。

针对以上问题，国家质量监督检验检疫总局和标准化管理委员会联合发布了 GB/T38482-2021 动物源性I型胶原蛋白成分测定聚丙烯酰胺凝胶电泳法标准。该标准采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，通过比较与标准品的相对蛋白含量，快速、准确地测定动物源性I型胶原蛋白中α1(I)链、α2(I)链和β(I)链的含量，具有以下优点：

• 简单易行：样品制备过程简单，不需要复杂的仪器设备。
• 准确可靠：测定结果具有高度的准确性和可重复性。
• 快速高效：检测时间短，一次可以同时测定多个样品。

需要注意的是，由于该方法仅适用于动物源性I型胶原蛋白的成分测定，对于其他类型的胶原蛋白或组织蛋白的分析需要选择其他适合的方法。

总的来说，GB/T38482-2021 动物源性I型胶原蛋白成分测定聚丙烯酰胺凝胶电泳法标准的发布，为相关行业提供了一种快速、准确、可靠的I型胶原蛋白成分测定方法，将极大地促进该领域的发展和应用。

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