GB/T36820-2018
甘蔗条纹花叶病毒实时荧光反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测方法
DetectionmethodofSugarcanestreakmosaicvirusbyreal-timereversetranscriptionpolymerasechainreaction（RT-PCR）
- 中国标准分类号（CCS）B16
- 国际标准分类号（ICS）65.020.01
- 实施日期2019-04-01
- 文件格式PDF
- 文本页数9页
- 文件大小662.80KB
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甘蔗条纹花叶病毒实时荧光反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测方法
国家标准 GB/T36820一2018 甘蔗条纹花叶病毒实时荧光反转录聚合酶 链式反应(RT-PCR)检测方法 Deteetionmethodofsugarane" streakmosaievirusbyreal-timereverse transeriptionpolymerasechainreaection(RI-PCR 2018-09-17发布 2019-04-01实施 国家市场监督管理总局 发布 币国国家标准化管理委员会国家标准
GB/36820一2018 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草
本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口
本标准起草单位:福建农林大学国家甘蔗工程技术研究中心、农业部甘蔗及制品质量监督检验测试 中心、农业部福建甘蔗生物学与遗传育种重点实验室
本标准主要起草人;高三基、黄美婷、傅华英、孙生仁、张慧丽、王锦达、陈如凯
GB/36820一2018 甘蔗条纹花叶病毒实时荧光反转录聚合酶 链式反应(RI-PCR)检测方法 范围 本标准规定了甘蔗条纹花叶病毒(Sugarcanestreakmosaicirus)实时荧光反转录聚合酶链式反 应(RT-PCR)检测方法的仪器与设备、试剂与材料、样品的采集与前处理、检测以及结果判断与表述等
本标准适用于可能带有甘蔗条纹花叶病毒的活体寄主植物的快速检测、诊断
缩略语 下列缩略语适用于本文件
CP;外壳蛋白(eoatprotein) Ct值:实时荧光PCR反应中,每个反应管内的荧光信号达到设定的闵值时所经历的循环数(cycle hreshold DNA:与RNA链互补的单链DNA(complementaryDNA ExTaqHS酶:热启动DNA聚合酶(hotstartDNApolymerase FAM:6-基荧光素6-carboxy-fluorescein PCR;聚合酶链式反应(polymerasechainreaction) RNA:核糖核酸(ribonucleicacid RT-PCR;反转录聚合酶链式反应(reversetranscriptionpolymeraseehainreaetion scsMV;甘蔗条纹花叶病毒(Sugaraestreakmosaicvirus TAMRA:6-羚基四甲基罗丹明(6-carboxytetramethylrhodamine) Tip;吸头 方法原理 根据甘蔗条纹花叶病毒CP基因序列设计一对仅在该病毒CP基因间保守的特异性引物和一条特 异性的荧光双标记水解型寡核苷酸探针TaqMan探针)
首先利用反转录酶将病毒RNA反转成 DNA,再以cDNA为模板在同一反应管内连续进行实时荧光PCR扩增反应,水解型寡核苷酸探针 TaqMan探针)的荧光信号强度伴随着目标序列PCR扩增产物的增加呈正比关系,通过收集PCR扩 增过程的荧光信号值,即可判断试样是否带有目标序列
甘蔗条纹花叶病信息参见附录A
仪器与设备 4.1实时荧光PCR检测仪;激发/检测波长范围350nm750nm;可用荧光染料(SYBRGreenI)和水 解型寡核苷酸探针(TaqMan探针);升降温速度>2.0C/s;均一性十/一0.5C;准确性十/一0.3C;温 度范围4100c 4.2核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计
4.3电子天平:感量0.01g
GB/T36820一2018 4.4高速台式冷冻离心机;离心力12000g以上 4.5微量加样器;0.1AL2.5ML,0.5AlL~10AL、2AL20AL、10L~l004L,20AL一200L 50L10001 Al
4.6无核酸酶(Nuclease)的1.5mL、2.0ml离心管,PCR反应管、带滤芯Tip头,实时荧光PCR反 应管
4.7恒温水浴锅
4.8鼓风干燥箱
449冰箱;2C~8C、一20C、一-80 4.10生物安全柜
4.11采样工具;砍刀、剪刀、子,带槽钻子
试剂与材料 S 5.1试剂 除非另有规定外,在分析中仅使用分析纯试剂,实验用水符合GB/T6682的二级水指标,其中涉及 PCR的用水要求达到一级水指标
5.1.1氯仿
5.1.2异丙醇
5.1.3无水乙醇
5.1.4无核酸酶(Nueease)水
5.1.5裂解液;主要成分为异硫氮酸呱和苯盼,为RNA提取试剂
5.1.675%乙醇
5.1.7定量荧光PCR检测引物 5'-引物;5'-cGGGAAAccCATAATAccAcC-3'
8'-引物;5'-GTcGATTTCTGcTGGTGAGA-3'
扩增片段大小为130bp 5.1.8水解型寡核苷酸探针TaqMan探针 5'-FAM-TGCTGCATTGATTTcGTGATGGTGTAMRA-3'
5.1.9用于一步法的荧光反转录聚合酶链式反应混合液 包插一步法反转浸聚合酶链式反应缓冲液、-引物.了'引物、水解型享核苷酸探针(TaMhn探 针)、逆转录酶混合液、ErTaHHsDNA聚合酶等,具体配制方法见附录B 5.2材料 5.2.1阳性对照,用已知含甘蔗条纹花叶病毒的甘蔗样品作阳性对照 5.2.2阴性对照:用已知不含甘蔗条纹花叶病毒的甘蔗样品作阴性对照
5.2.3空白对照:;用无核酸酶的无菌一级水代替样品
6 样品的采集与前处理 6.1取样工具准备 砍刀,剪刀、锻子等取样工具应经121C士2、1.1×10Pa高压灭菌15min或经160C干热灭菌 2h
GB/36820一2018 6.2采样方法 6.2.1采样过程中应避免样本交叉污染,采样及样品前处理过程中应戴一次性手套,每采一个样品后， 采样工具用75%乙醉进行消毒
6.2.2叶片样品:用剪刀取甘蔗植株或种苗最高可见肥厚带叶上一叶(一1叶)叶片,编号备用
6.2.3蔗茎样品:用带槽钻子钻取甘蔗植株上部蔗茎蔗汁1mL于1.5mL离心管,若为甘蔗蔗种,取中 部种茎,编号备用 6.3存放与运送 采集或处理的样本在2C一8条件下保存应不超过24h;若需长期保存,要求放置一80C冰箱， 但应避免反复冻融
采集的样品密封后,采用保温壶或保温桶加冰密封,或用液氮处理,尽快运送到实 验室
检测 7.1RNA提取 7.1.1RNA提取应在样品处理区进行
取1.5mL无核酸酶(Nuclease)离心管,并对每个管进行编号
7.1.2称取0.1g0.2g样品材料,并用液氮研磨成粉未状(要保持液氮不挥发干净. 7.1.3向1.5ml离心管中加人粉末,等液氮刚挥发完立即加人1ml裂解液,充分混匀,室温下静置 10min.
7.1.4加人0.2ml氧仿,盖住管盖,剧烈振荡混匀约15s,室温静置5min后,于4,12000g离心 10min
取上清液转人另一新的1.5mL离心管,加人等体积异两腺,窒温静置10min,于4c,120g 7.1.5 离心10min
.1.6弃上清液,加人1mL.75%乙醉洗涤.于4C.,12000g离心10min,重复该步骤洗涤两次
7.1.7弃上清液,加人1ml无水乙醇洗涨,于4C,12000离心10min,洗涤沉淀一次,室温晾干 10min
7.1.8加人50l无核酸酶的水溶解,提取的NA应在2h内进行检测;若需长期保存,应放置 -80C冰箱备用
7.1.9使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计上测260nm和280nm处的吸光值A和Am,并估算 提取的RNA浓度
RNA浓度按式(1)计算 c=A×N×40/1000 式中 -RNA浓度,单位为微克每微升("g/L); 260nm 处的吸光值; 2o0 RNA稀释倍数
N 当A/A比值在为1.8一2.0之间时,适合于实时荧光反转录聚合酶链式反应扩增
7.2实时荧光反转录聚合酶链式反应 7.2.1实时荧光反转录聚合酶链式反应应在核酸检验区进行
从试剂盒中取出荧光反转录聚合酶链 式反应反应液,在冰上融化后,2000离心5s
每个测试样本反应体系见附录B 7.2.2根据测试样品的数量计算好各试剂的使用量,全部加完后,充分混合均匀,向每个实时荧光PCR 管中各分装18.0L
GB/T36820一2018 7.2.3在各设定的实时荧光PCR管中分别加人待测的RNA样品2.0AL(RNA约1o0ng),盖紧管盖 后,500片离心30s
7.2.4将7.2.3中加样后的实时荧光PCR反应管放人荧光PCR检测仪内,记录样本摆放顺序
实时荧 光PCR反应条件随不同仪器略有改变,一般的反应程序为;第一阶段为RRNA样品反转录反应;42C 5min 反转录,95C10s终止反转录;第二阶段为PCR反应:95C10s,60C34s,40个循环
在每次 循环的退火时收集荧光
8 结果判断与表述 8.1 结果分析条件设定 实时荧光PCR反应结束后,设置荧光信号闵值,阔值设定原则根据仪器噪音情况进行调整,以值 线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点为准
8.2对照结果 检测过程中分别设阳性对照、,阴性对照和空白对照
采用感染了甘蔗条纹花叶病毒的甘蔗叶片总 RNA作为阳性样品;采用无甘蔗条纹花叶病毒感染的甘蔗叶片总RNA为阴性对照;用等体积的无核 酸酶的无菌一级水代替模板RNVA作空白对照
空白对照,无Ct值且无扩增曲线;阴性对照,无Ct值且无扩增曲线;阳性对照,Ct值应小于或等于 30.0,并出现典型的扩增曲线
否则,此次实验视为无效,需要查明原因重新检测
8.3检测结果的判定 8.3.1阴性 C值大于或等于40.0,且无典型的扩增曲线,表示样品中不含甘蔗条纹花叶病毒
8.3.2阳性 Ct值小于或等于35.0,且出现典型的扩增曲线,表示样品中含甘蔗条纹花叶病毒
8.3.3有效原则 C值大于35.0且小于40.0,并出现典型的扩增曲线的样本应进行重做检测实验
重复实验的结 果C值仍然大于35.0且小于40.0,并出现典型的扩增曲线,则判定样本检测结果为阳性;Ct值大于或 等于40.0,则判定样本检测结果为阴性
8.4结果表述 该试样中检出甘蔗条纹花叶病毒
该试样中未检出甘蔗条纹花叶病毒
GB/36820一2018 附 录 A 资料性附录 甘蔗条纹花叶病信息 甘蔗条纹花叶病毒基本信息 A.1 甘蔗条纹花叶病毒属于马铃薯Y病毒科(Poyoiridae)禾本科病毒属(Poacewuirus)成员,英文名称 为Sugarcanestreakmnosaiccirus,缩写为SCSMV
A.2病毒粒子形态特征 甘蔗条纹花叶病毒粒子为弯曲线状,大小约890nm×15nm,为单链正义RNA病毒,基因组大小 约10kb
寄主范围 甘蔗条纹花叶病毒自然寄主为甘蔗属中的热带种(Saccharwnoffieiarwm),大茎野生种(Sacchat ),种(Sau ),剐手密(Saccharumspontanewm)和甘蔗栽培种(Su rrobustu acc/harunsine7sis accha- ruu1 spp.hybrid)以及高粱,实验寄主包括其他禾本科植物如玉米,小米,苏丹草,石茅、高等 A.4病害症状 甘蔗条纹花叶病毒主要为害叶片,以新叶基部症状最为明显
病叶上有许多不规则的黄绿色或浅 黄色的纵短条纹,此条纹与叶脉平行,但其宽度不受叶脉的限制
条纹的形状有长圆形,卵圆形或条形 有时成短小针状,或沿叶脉作放射状
褪绿条纹与正常绿色相间成花叶症状
A.5分布地区 由甘蔗条纹花叶病毒引起的甘蔗花叶病于1998年最早发生在印度,随后陆续在巴基斯坦、孟加拉、 斯里兰卡、泰国,越南、印度尼西亚、缅甸、等亚洲国家也有发现
A.6传播途径 主要通过感病的无性繁殖材料(种质)传播,也可通过收获机械和摩擦接种方式传播,昆虫传播媒介 尚不清楚
GB/T36820一2018 附录 B 规范性附录) 每个测试样本荧光反转录聚合酶链式反应体系 每个测试样本荧光反转录聚合酶链式反应扩增体系见表B.1
表B.1每个测试样本荧光反转录聚合酶链式反应扩增体系 试剂 使用量 体系终浓度 反转录聚合酶链式反应缓冲液 10,0AL 5'-引物(l0mmol/1 0.4l 0.2mmol/几 3'-引物(I0mol/L) 0,4Al 0.2mol/1 An探针0pml/L TaO 0.4Al 0.2Amol/1 0.4l 反转录酶混合液 ErTaHsDNA聚合酶(5U/L 0.4L 0,.25U/L 模板RNA 2.0L 无核酸酶的无菌水 补无核酸酶的无菌水至20L 注1R反应体系中各种试M的便用量可根蜗其具体信悦进行透当调整 注2:可采用商品化试剂盒进行样本荧光反转录聚合酶链式反应
GB/36820?2018 ο [1]FuwL,SunSR,FuHY,ChenRK,SuJw,GaoS.A real-timeRT-PCRassayfor onestep thedetectionand lquantitationoSu bugaranestreakmosaicvirus.IBioMedResearchlnternational,2015 2015),ArticleID569131 [2 HalJS,AdamsB,ParsonsT,FrenchR,LaneIC,.JensensG.Moleeularcloning,sequeneing relationshipsofanewpotyvirus;sugarcanestreakmosaicvirus,andareevaluationof phylogenetie and theclassificationofthePotyiridae.MolecularPhylogeneticsandEvolution,1998,10;323-332 HemaM,Joseph HS.Molecularcharacterizationand Gopinath interviralrelationships filamentousviruscausingmosaicdiseaseofsugarcane(Saceharum1 officinarumn inlndia.ArciveofVirology,1999,144:479-490. Yasaka w,LiS,OhshimaK.Geneticstructureof He ulationmsofsSugarn cane" pop streakmosaicuirusinChina:Comparisonwiththepopulationsinlndia.VirusResearch,2016,21l 103-116. LiangSS,AlabiOJ,DamajMB,FuwI,SunSR,FuHY,ChenRK,MirkovTE,Gaos.Ge- nomicvariabilityandmolecularevolutionofAsianisolatesofSugarcanestreakmosaicuir4s.Archive ofVirology,2016,l61:l493-503. L6 ViswanathanR,BalamuralikrishnanM,KaruppaiahR.Characterizationandgeneticdiversity ofSugarcanestreakmosaicuir4scausingmosaicinsugarcane.VirusGenes,2008,36;553-564 XuDL.ZhouGH.XieYJ,MockR,LiR.Completenucleotidesequenceandtaxonomy of Sugarcanestreakmnosaicirus,memberofanovelgenusinthefamilyPotyviridae.VirusGenes,2010 40:432-439.
甘蔗条纹花叶病毒实时荧光反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测方法GB/T36820-2018
甘蔗是我国一种重要的经济作物，但是条纹花叶病毒的感染会导致甘蔗的减产和品质下降。因此，及早发现并控制该病毒的传播至关重要。
实时荧光反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术介绍
实时荧光反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术是一种快速、高灵敏度、高特异性的核酸检测方法，已经成为病原微生物检测、基因表达分析、病毒定量等领域中最常用的方法之一。
RT-PCR方法包括以下步骤：
- 1. RNA提取：从样本中提取RNA。
- 2. 反转录：将RNA转录成cDNA。
- 3. PCR扩增：对cDNA进行PCR扩增。
- 4. 实时荧光检测：在PCR扩增过程中，通过检测实时荧光信号来确定反应体系中的靶标序列含量。
GB/T36820-2018检测方法介绍
GB/T36820-2018是我国甘蔗条纹花叶病毒实时荧光反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测方法的标准规范。该标准规范了该方法的样品采集、RNA提取、反转录、PCR扩增以及实时荧光检测等各个环节的操作流程和要求，保证了检测结果的准确性和可靠性。
检测方法的优点
甘蔗条纹花叶病毒实时荧光反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测方法GB/T36820-2018相对于传统的病毒检测方法具有如下优点：
- 1. 高灵敏度：能够在极低的病毒载量下进行检测。
- 2. 高特异性：能够区分不同的病原体，并排除其他干扰因素的影响。
- 3. 操作简便：样品采集和操作流程简便，能够快速获得准确结果。
- 4. 安全可靠：不需要复杂的培养条件和特殊试剂，操作过程安全可靠。
结论
甘蔗条纹花叶病毒实时荧光反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测方法GB/T36820-2018是一种快速、准确、可靠的甘蔗条纹花叶病毒检测方法。在甘蔗防疫中具有重要意义，可以有效地控制病毒的传播和发生。随着技术的不断进步，相信未来该方法还将得到更广泛的应用和推广。
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