致病性嗜水气单胞菌检验方法

致病性嗜水气单胞菌检验方法

国家标准 GB/T186522002 致病性嗜水气单胞菌检验方法 Methodsfordetectionofpathogenicaeromonashydrophila 2002-02-19发布 2002-05-01实施 中华 民共，和国 发布 国家质量监昏检验检疫总篇国家标准
GB/T186522002 前 言 嗜水气单胞菌在自然界中广泛分布,有致病性菌株和非致病性菌株之分 致病性菌株可感染鱼类、 两栖类、爬行类、鸟类和哺乳类等动物,包括鲫、团头鱿,雏、、鲤、鲛、草鱼、香鱼、狼鲈、虹鳟、尼罗罗非 鱼、斑点叉尾、黄鳍、日本鳗、欧洲鳗、翘嘴皈,牛蛙,美洲鳄,中华瞥,貂、骆,兔、猪、牛等,临床上以急性出 血性败血症为主要特征 慢性感染则主要表现为皮肤溃疡或肠炎 人亦可因致病性嗜水气单胞菌感染 而发生腹泻及食物中毒 本标准在嗜水气单胞菌的鉴定中,参考了《伯杰氏鉴定细菌学手册第九版,1994)中有关嗜水气单 胞菌的内容 在嗜水气单胞菌的分离鉴定中,除采用选择培养基RS培养基及鉴别培养基嗜水气单胞菌(AHM 培养基外,还应借助一些生化反应将其与假单胞菌、邻单胞菌、肠杆菌、弧菌及其他气单胞菌进行区分 蛋白酶是嗜水气单胞菌重要的毒力决定因子,与该菌的致病性密切相关,凡蛋白酶阳性的嗜水气单胞菌 均具致病性 蛋白酶的检测除采用脱脂奶平板法外,还可采用斑点酶联免疫试验 本标准可用于嗜水气单胞菌的分离鉴定,而且可区分致病性菌株和非致病性菌株,有助于致病性嗜 水气单胞菌感染的确切诊断 本标准的附录A、附录B是标准的附录,附录C是提示的附录 本标准由农业部提出 本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口 本标准起体单位;南京农业大学动物医学院 本标准主要起草人;陆承平,陈怀青
国家标准 GB/T186522002 致病性嗜水气单胞菌检验方法 Methodsfordeteectionofpathogenieaeromonas hydrophiln 范围 本标准规定了致病性嗜水气单胞菌的检验方法 本标准适用于患病鱼类等易感动物及水样中致病性嗜水气单胞菌的分离、鉴定,也可用于送检菌 的鉴定 致病性嗜水气单胞菌检验程序 检验程序的流程示意图见附录c(提示的附录) 2.1嗜水气单胞菌的分离 2.1.1准备 2.1.1.1各种培养的制备方法见附录A(标准的附录). 2.1.1.2各种试剂的制备方法见附录B(标准的附录 2.1.2待检样本 待检样本可包括病料、水样及送检菌株,病料既可是无菌采取的易感动物的肾、肝、脾等未污染病 料,也可是粪便或病变皮肤等污染病料,如样本为菌株,应先接种于普通肉汤(见附录A中A1),28C培 养24h,再划线接种于普通琼脂平板(见附录A中A2),使之形成单个菌落,以供鉴定用 2.13分离 2.1.3.1未污染病料的分离 213.11接种环(铂金耳)火焰灭菌冷却 2131.2用接种环蘸取病料 213.1.3划线接种于普通琼脂平板 2.13.1.428C培养24h 213.2污染病料的分离 2.1.321接种环(铂金耳)火焰菌,冷却 213.2.2用接种环蘸取病料 21323接种于Rs琼脂平板(见附录A中A3). 2.13.2.428C培养24h 2133水样的分离 2.133.1用孔径为0.2m的硝酸纤维素微孔滤膜过滤水样 2133.2取出滤膜,置含有灭菌碱性蛋白胯水(见附录A中A4)的试管中 2.1.3.3.328C培养24h 2.1.3.3.4划线接种于普通琼脂平板 2.1.3.3.528C培养24h 国家质量监督检验检疫总局2002-02-19批准 2002-05-01实施
GB/T186522002 2.2嗜水气单胞菌的鉴定 2.2.1菌落形态 嗜水气单胞菌在普通琼脂平板上,28C培养24h后的菌落为光滑、微凸,圆整,无色或淡黄色有特 殊芳香气味 22.2氧化酶试验 2221用铂金耳挑取普通琼脂平板上单个菌落少许 2222涂布于浸有1%盐酸四甲基对苯胶(见附录B中B1)的滤纸片上 222310s内观察细菌涂布处的颜色 22.2.4若细菌涂布处出现红色判为阳性 2.2.25嘴水气单胞菌应为阳性 223 AHM鉴别培养 22.3.1用铂金耳挑取普通琼脂平板上氧化酶试验阳性的单个菌落少许 22.3.2穿刺接种AHM整别培养基(见附录A中A5) 223.337C培养24h 22.3.4嗜水气单胞菌的表现为顶部仍为紫色,底部为谈黄色;细菌沿穿刺线呈刷状生长,即运动力 阳性;部分菌株顶部呈黑色 2.2.4咧噪试验 2.2.4.1在长有细菌的AHM鉴别培养基顶部.滴加34滴Kovacs试剂(见附录B中B1) 2.2.42若沿试管内壁出现红色环者,表明产生咧嗓,判为阳性 2243嗜水气单胞菌应为阳性 2.2.5革兰氏染色 2251在一干净载玻片上滴加一滴寨僧水 2.2.5.2用舶金耳取.AHNI鉴别培养基表面菌落少许 225.3在载玻片上与燕溜水混合并均匀涂布 22.5.4自然干燥,火焰固定 22.5.5加草酸铃结晶紫染液(见附录B中2)染 1min2min 225.6流水冲洗 2.2.57加革兰氏碘液(见附录B中B3)作用1 min2min 225.8流水冲洗 2259加复红酒精染液(见附录B中)束30一o 225.10流水冲洗 2.2.5.11干燥,镜检 2.25.12暗水气单胞菌应为革兰氏阴性短杆菌 22.6糖发脖试验 22.8.1用雉金耳取.AHM鉴别培养基表面岚落少许 226.2分别接种葡萄糖、蔗糖,阿拉伯糖,七叶苷及水畅苷等5种糖发醉试验管(见附录B中B5) 2.2.6.328C培养24h 22.6.4凡试验管颜色从紫色变为黄色,表明细菌可发脖该种糖类,判为阳性 22.6.5嗜水气单胞菌可发酵以上5种糖类 23嗜水气单胞菌致病性鉴定 231脱脂奶平板试验 2311用铂金耳取AHM鉴别培养基表面菌落少许 231.2接种划线于1%脱脂奶蔗糖胰蛋白陈平板(见附录A中AG).
GB/T186522002 2.3.1328C培养24h 2.3.1.4若菌落周围出现清晰,透明的溶蛋白圈,判为阳性 232 斑点酶联免疫试验 23.21用铂金耳取AH鉴别培养基表面菌落少许 232.2接种蔗糖胰蛋白陈肉汤(见附录A中A7). 23.2328C摇床(30r/min)培养48h 10000r/min离心10min,取上清 23.24 23.2.5用微量加样器取5L点样于硝酸纤微素膜光面 2.32.6 37C烘干 2.3.2.7置20%脱脂奶中37C封闭1h 23.2.8用含吐温-20的磷酸盐缓冲液(见附录B中B6)洗5次每次2mmin. 2.3.29置1:50兔抗嗜水气单胞菌蛋白酶抗血清中37C作用1h 2.3.210用含吐温-20的磷酸盐缓冲液洗5次,每次2min 23.211置110酶标羊抗兔抗血清中.37C作用1h. 2.3.212用含吐温-20的磷酸盐缓冲液洗5次,每次2min. 2.3.213加3.3-二氨基联苯胶-过氧化氢(见附录B中B7)中显色 2.3.214待斑点明显后,用去离子水终止显色 2.3.2.15设无菌肉汤作阴性对照 23.2.16以出现明显棕色斑点者判为阳性 试验结果分析判定 符合以下特性者应判为致病性嗜水气单胞菌 a在普通琼脂平板上,28C培养24h后的菌落为光滑、微凸、圆整、无色或淡黄色,有特殊芳香 气味; b在AHM鉴别培养基中,顶部仍为紫色底部为淡黄色;细菌沿穿刺线呈刷状生长,即运动力阳 性;部分菌株顶部呈黑色 c 氧化酶试验阳性,革兰氏染色为阴性短杆菌 d咧嗓试验阳性,发酵葡萄糖,蔗糖,阿拉伯糖、七叶苷及水杨苷等5种糖类 e 脱脂奶平板试验阳性或斑点酶联免疫试验阳性
GB/T186522002 A ? ???) ? ? A1 ? 3.0g 10.0g ?(NaCI 5.0g (KH,PO 1.0g ?? 1000ml ,?,pH7.6,?,112kPa?15min A2??? ? 3.0g ? 10.og (NaCI 5.0g (KH,PO l.0g ? 15.0 ?? 1000ml ,?,pH7.6,?,l12kPa?15min,?45C??塣 A3Rs?? 1- 6.g L- 5.0 g L-? 0.s ? 3.5 " 6 (Na,S.(O.5H(O) 8 g 0.8 g 1.0 5.0 ?(NaCl " ?? 3.0g 0.005 ù g 0.03 ? g ? 13.5g 1000m ? ?,pH7.0,1min,?45C,??塣 A4??? l10.0 ? g 8.5 (NaCI g 1000ml ??
GB/T18652-2002 ,?,pH9.0,?,l12kPa?15min. A5AHHM 5.0g ?? 3.0g ?? 10.0g 1- 5.0g ? 1.0g 10.0g (Na,S,(O.5H,(O) 0.4 g" 0.5g ?? 0.02g ? 3.0g ?? 1000ml ,?,pH6.7,?,112kPa?15min A6???? (KHPO. 10.0g ?(Kcl)y l.5 g 5.0g ?? 5.0g ?? 10.0 g ? 15.0g ?? 1000ml ,?,pH7.0,?,112kPa?15min,?45C,??塣 ?? A7 (KH,PO 10.0g (KC 1.5g 5.0g ?? 5.0g ?? 10.0g ?? l000ml ,?,pH7.0?,112kPa?15min
GB/T186522002 B ? ??? ?? B1Kovacs? ??? 5.0g ? 75g ? 25ml B2???? ? ? 2.0g 95%?20ml ? 0.8g ??80mL ????? B3?? (I) l.0g ?(K,I 2.0g ?? 100ml ??? B4 ? 0.4g 95%? l00ml B5? ???(?5.0g,??1000ml.,pH7.4,?,??100mL) ?100ml??з???????1.0g?.? ,106.44kPa?10min B6-20λ?(PBST) ?(NaCIl 8.0g ?(KCI 0.2g (Na,HPO l44g (KH,PO 0.24g ?? 800ml pH7.4,?980mL;-80(ween-80)20mL
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