澳洲葡萄类病毒检疫鉴定方法

澳洲葡萄类病毒检疫鉴定方法

国家标准 GB/T36770一2018 澳洲葡萄类病毒检疫鉴定方法 DeteetionandidentificationofAustraliangrapevineviroid 2018-09-17发布 2019-04-01实施 国家市场监督管理总局 发布 币国国家标准化管理委员会国家标准
GB/36770一2018 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口 本标准起草单位:检验检疫科学研究院、北京出人境检验检疫局、福建省农科 院、山东出人境检验检疫局 本标准主要起草人;邓丛良、张永江、王英超、向均、赵晓丽,谢丽雪
GB/T36770一2018 澳洲葡萄类病毒检疫鉴定方法 范围 本标准规定了澳洲葡萄类病毒的检疫鉴定方法 本标准适用于可能带有澳洲葡萄类病毒的葡萄繁殖材料的检疫鉴定 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 澳洲葡萄类病毒基本信息 学名:Australiangraeineiroid 缩写AGVd 异名:澳大利亚葡萄类病毒 分类地位:马铃薯纺锤块茎类病毒科(Pospiviroidae),苹果锈果类病毒属(Apscairoid 澳洲葡萄类病毒的其他信息参见附录A 方法原理 类病毒检测主要针对其核酸序列 主要的方法有反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和核酸分子 杂交 仪器设备、主要用具和主要试剂 5.1仪器设备 电子天平(感量0.ol助),普通天平(感量01)高速冷冻离心机.小型瞬时离心机、普通冰箱,超 低温冰箱(一80C,制冰机、涡旋振荡器、磁力搅拌器、高压灭菌锅、pH计、,PCR仪、微波炉,电泳仪、电 泳槽、凝胶分析成像系统、实时荧光定量PCR仪、杂交炉、塑料薄膜封口机、紫外交联仪、暗箱、摇床、恒 温水浴锅、组织破碎仪等 5.2主要用具 可调移液器(2.5L，10AL，20HL，200AL，1000AL5000AL),无RNA酶吸头(10L. 20AL，200AL，1000l,5000L),无RNA酶离心管(1.5mL，5ml，10mL),研钵、,研棒、,磁性分 离架、PCR反应管(200AL)、实时荧光96孔反应板、杂交瓶、杂交膜,杂交袋、x光片 5.3主要试剂 除另有规定外,所有试剂均为分析纯,实验用水应符合GB/T6682中相关规定 普通RT-PCR检
GB/T36770一2018 测试剂见附录B;实时荧光RT-PCR检测试剂见附录C;斑点杂交检测试剂见附录D 检测与鉴定 6.1普通RT-PCR检测方法 普通RT-PCR检测方法见附录B. 6.2实时荧光RT-PCR检测方法 实时荧光RT-P(CR检测方法见附录C 6.3斑点杂交检测方法 斑点杂交检测方法见附录D. 结果判定 样品经普通RT-PCR检测为阳性,且实时荧光RT-PCR检测为阳性或斑点杂交检测为阳性,则判 定为检出AGvd 样品经普通RT-PCR检测为阳性,且序列测定结果与已知的AGvd序列一致,则判定为检出 AGvd 样品经实时荧光RT-PCR检测为阳性,且序列测定结果与已知的AGvd序列一致,则判定为检出 AGvd 样品保存与结果记录 8 8.1样品保存 完整的实验记录要包括;样品的来源、种类、采集时间、实验检测时间、地点、方法和结果,并有实验 人员的签字;普通RT-PCR检测结果保存电泳照片及测序结果;实时荧光RT-PCR检测结果保存荧光 曲线图及Ct值;斑点杂交检测保存照片 8.2样品保存与处理 样品经登记人和经手人签字后妥善保存3个月,种子保存在4C冰箱内,生长苗木或插条保存在隔 离温室中培养,叶片,果实等样品在一80C冰箱内保存 对检出澳洲葡萄类病毒的样品应至少保存 6个月，以备复核,谈判和仲裁 保存期满后,应灭活处理
GB/T36770一2018 录 附 A 资料性附录 澳洲葡萄类病毒相关资料 寄主范围 A.1 自然条件下侵染葡萄(Vitisini/era). A.2病害症状 寄主受AGVd侵染后,多表现隐症 A.3分布地区 澳大利亚、美国、突尼斯、 传播方式 A.4 AG;Vd主要通过嫁接传播和机械传播,也可通过种子传播 A.5基因组 AG;Vd为单链环状的RNA分子,长369个核甘酸残基
GB/T36770?2018 ? B 淶??) ?RI-PCR? B.1?? B.1.11mol/L(K,IHPO 17.42g ??100mL,0.22Mm??? B.1.22.5mol/L(K.HPo) 43.55g ??100mL.,0.224m??? B.1.33mol/L(NaAc)pH5.2 ? 40.83g mal/?H3.??10ml.? B.1.44mol/L(LiC 16.96s ??100ml0.22m???4c. B.1.5?? 4mol/I (GITC) ?? 5g/ ?X-100(TritonX-100 0.1%) ?(NaCI 0mmol/L ??(pH7.0 25mmol/I ?(PVP) 20g/I B.1.650TAE? Tris 242g 57.1ml ?EDTA)(0.5mol/LpH8.0100ml ???1I B.1.76xL.oading? ? 2.5g/I ?FF 2.5g/I ?? 400g/L
GB/T36770一2018 贮存于4C B.2引物序列 正向引物AGVdF:5'-ACCTGCAGGGAAGCTAGCTGGGTC-3' 反向引物AGVdR:5'-CCCTGCAGGTTTcGCCAGCAAGCGC-3'; 扩增片段大小为369p B.3试验步骤 B.3.1 RNA的提取 B.3.1.1方法一(LiC1方法 取lg叶片样品,加液氮研磨成粉末状,将研磨物迅速移人10mL离心管中,并加人2ml1 molL 磷酸氢二钾和8AL筑基乙醇,混匀,再加人2mL水饱和酚:氯仿(体积比为1:1),涡旋1min,充分混 匀;4C,10000离心10min 取上层液体,加人同体积的水饱和酚:氯仿(体积比为1;l),充分混 匀;4C,l0000离心10min 取上层液体,加人2.5倍体积的无水乙醇,充分混匀;一20下放置 2h~4h或-80下放置至少30min;4C,l0000g离心l0min 取沉淀,加1mL无RNA酶的水 充分溶解后,再加人1mL2.5mol/L磷酸氢二钾、1m的乙二醇单甲酥(即2-甲氧基-乙醇),充分混 匀;4C,12000r/min离心10min 取上层液体,加人无RNA酶的水至10mL,再加人100AL20g/L 的十六烧基三甲基嗅化铵(CTAB)溶液,充分混匀,冰浴3h4h;4,10000g离心10min 取沉淀 加人2mL无RNA酶的水充分溶解后， nml无水乙醉、 乙酸钠(pH5.2),充分混 人5 0.2ml3mol/I 匀，-20C下放置至少2h;4C,10000越离心10min 取沉淀,加200L无RNA酶的水反复吹打 L离心管中;加人200L4 待沉淀充分溶解后,将溶解物移人 mol/L氯化锂,充分混匀,冰浴至少 Ol.5m 人 h;4C,l0000离心10min 取上层液体于1.5ml.离心管中,加人2.5倍体积的无水乙醇,混匀 -20C下放置至少2h或一80C下放置至少30min;4 C,10000离心10min 取沉淀,70%乙醇 清洗沉淀;4C,10000片离心2 n;取沉淀,待其干燥后,加人50L~60ML无RNA酶的水充分溶 2min 解，一20C下保存备用 B.3.1.2方法二(CTAB方法》 取0.1g样品,加液氮研磨成粉末状,将研磨物迅速移人1.5mL离心管中,加人加人预热的CTAB 提取缓冲液900AL,以及2%的流基乙醇,颠倒混匀，65C孵育10min,加人等体积的氯仿异戊醉 24+1),混匀,4C,l1000g离心10 1;取上清,氯仿:异戊醉(241)再抽提一次,混匀,4C,ll000g min 离心10min;取上清,加人10mol/几的氧化锂至终浓度3mol/L,冰浴30min,4 ,4C,12000！离心 20 nmin;弃上清,加人65C预热的SSTE缓冲液500"L溶解沉淀,以及等体积的氧仿;异戊醉(24+ ),混匀;4C,11000片离心10min,取上清移人1.5mL.离心管,加人700L预冷的异丙醉,一20 沉淀30min 4C,12000g离心20min;沉淀用70%乙醇洗涤两次,4,12000离心2min;去除 上清液,沉淀自然干燥后,将其溶于30AL~50AL无RNA酶的水中 B.3.1.3方法三(纳米磁珠方法》 取0.1g叶片样品,加液氮研磨成粉末状,待研磨物温度升到室温,加人1mL的研磨缓冲液,继续
GB/T36770一2018 充分研磨,将研磨物移人1.5ml的离心管,4C,5000g,离心5min,留上清液备用 取2mg纳米磁 珠于1.5ml的离心管中,离心管置于磁性分离架上,吸附纳米磁珠,弃上清 向含有纳米磁珠的离心 管中加人200L备用上清液,用枪反复吹打至没有明显结块 再向离心管中加人200ML无水乙醇,颠 倒混匀,室温放置5 放置期间颠倒混匀几次 室温,5000g,离心10s,置于磁性分离架 minl0min 上 .,吸附纳米磁珠,弃上清 向离心管中加人150AL70%的乙醇,用枪吹打混匀,将离心管置于磁性分 离架上,吸附纳米磁珠,弃上清,并重复2次一5次,至上清没有明显颜色 室温,5000g,离心10s,置 于磁性分离架上,吸附纳米磁珠,完全弃除上清 向离心管中加人约50"lL无RNA酶的水,用枪反复 min5 吹打重新悬浮纳米磁珠,室温放置2 min 将离心管置于磁性分离架上,吸附纳米磁珠,将含有 RNA的上清液转移至一无RNA酶的离心管中,一80C冰箱保存备用 注;RNA也可使用相应市售RNA提取试剂盒提取 B.3.2RIT-PCR检测 在25L反应体系中加人2.5AL10×RT-PCR缓冲液,5LMgCl.(25mmol/L),2.5ALdNTT 混合物各10mmol/L),0.5AL RNA酶抑制剂40U/pAL),0.5"L 反转录酶(5U/L),0.5AL.Tae DNA聚合酶(5U/L),0.5L引物AFCvdr(204mol/L),0.5引物AFCvdR(204mol/L),ll RNA,无RNA酶的超纯水补至25AL 反应条件为5030min,94C2min;然后94C30s,55 30s,7230s,共35个循环;72笔5 min 注反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整 也可采用其他商业RT-PCR试 剂盒 B.3.3CR产物的琼脂糖凝胶电泳 灌制2%琼脂糖凝胶板,室温凝结30min,取5ALPCR产物与6×上样缓冲液混匀后点样,用 DNA分子量标准物质作分子量标记,在1×TAE中以5V/cm的电压电泳30min 澳化乙锭溶液 (0,54g/mL染色10min,用凝胶成像仪照相 B.3.4PCR产物测序 将电泳后有约为369bp条带的PCR产物直接送测序公司进行测序分析 B.4结果判定 阴性对照和空白对照在369bp处未出现扩增条带,待测样品与阳性对照在369bp处出现扩增条 带,测序序列比对结果为AGVd的,判定结果为阳性 阴性对照和空白对照在369bp处未出现扩增条带,阳性对照在369bp处出现扩增条带,且样品无 特异性扩增,判定结果为阴性
GB/T36770一2018 录 附 C 规范性附录 实时荧光RI-PCR检测方法 主要试剂 C.1 RNA提取试剂见B.1.1B1.5 C.2引物和探针序列 AGVd-FP 5'-TTCTTTCACTCTGTAGCTGGAATcC-3' AGVdRP 5'-GCGGGACCCAGCTAGCTT-3" AGVd-P 5'-FAM-cGCTTGCTGGcGAAACCTGCA-BHQ13 c.3实验步骤 C.3.1 RNA的提取 见B.3.1 C.3.2实时荧光Rr-PCR检测 以提取的RNA为模板进行实时荧光RT-PCR反应,即在25L反应体系中加人12.5!L2×实时 荧光RT-PCRMasterMix(含终浓度4.0mmol/L的Mg=+),0.875AL引物AGvdFP(20mol/L). 0.875L引物AGvaRP(20mol/L),0.6825L探针AGvdP(20pmol/L),0.25L实时荧光RT Mix,l"lLRRNA,无RNA酶超纯水补至25AL 反应条件为50C30min;95C15min;然后94C 15s，60C60s,共45个循环 注:反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整 也可采用其他商业实时荧光 RT-PCR试剂盒 c.4结果判定 在空白对照及阴性对照无Ct值且无扩增曲线、阳性对照Ct值<30并出现典型扩增曲线的条 件下 待测样品的Ct值=40时,判定AGVd阴性 待测样品的Ct值<35时,判定AGVd阳性 待测样品的Ct值小于40且大于35时,应重新进行测试;如果重新测试的Ct值=40,判定AGVd 阴性;如果重新测试的Ct值小于40且大于35,且扩增曲线明显时,则判定结果为阳性
GB/T36770一2018 附 录 D 规范性附录) 斑点杂交检测方法 D.1主要试剂 D.11探针 将纯化的AGVd的eDNA克隆到载体pGEMT上的启动子(T;/SP,序列的下游,将重组质粒 pGEM-AGvd转化大肠杆菌(DH5a),挑选出阳性克隆 扩大培养阳性克隆,提取质粒 使用AGvd 序列下游的具有5'粘性末端的限制性内切酶彻底消化重组质粒,使得质粒线性化 具体反应体系 如下 pGEM-AGvd重组质粒 2"g一3从g 10×缓冲液 5Al 30U 限制性内切酶(5'粘性末端 加水至 50l 37C孵育至少2h,然后吸取1l进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测 若酶切不彻底,则补加20U 的限制性内切酶继续反应,直至酶切完全;若酶切完全,则往反应产物中加人1504L灭菌水至终体积为 pH>7.8)涡旋1; 200L,加人200L酚:氯仿:异戊醉(25;24:1 min,13000r/min离心10 min 取上清,放人新的离心管(1.5mL)内,往剩余的液体中再加人200AL灭菌水,重复抽提一次 将两次上 清液混合(约400L),加人2倍体积的无水乙醇和1/10体积的醋酸钠溶液(3mol/L，pH5.2). -20c放置至少2h后,13000越,离心15mim,弃上清,加人lml75%乙醉,震荡将沉淀悬浮起来 3000尽，离心5min,弃上清,干燥沉淀后,溶于20L灭菌水中 注:也可以使用试剂盒纯化线性化的重组质粒 获得纯化的线性重组质粒后,通过AGVd序列的上游启动子进行体外转录,合成地高辛标记的 AGVd负链RNA作为探针 取14g线性化重组质粒作为模板加人到无菌的反应管中,按如下体系 线性化重组质粒pGEMAGVd 1"g 5×NTP混合液含地高辛标记的UTP) A山 4 5×转录缓冲液 生儿L 2儿 RNA 聚合酶(20U/,L) RNA酶抑制剂 lAl 无RNA酶超纯水 至20丛L 轻轻的涡旋后,瞬时离心,2C温育1h~2h 加人2AL.DNA酶I(DNase),37C温育15min: 之后加人2AL0.2mol/IEDTApH8.0终止反应 电泳,估计探针浓度 注该方法模板要求很高,要高度纯化,线性完全 被标记序列长度不能低于200bp,l000p是最佳长度 体外 转录的模板也可以通过PCR加上启动子序列的方法获得 D.1.22×CTAB缓冲液100mL Tris-CI1.0mol/L 10mL NaCl3.0mol/I 46.6ml 10mL EDTA(3.0mol/儿L,pH7.0)
GB/36770一2018 CTAB固体粉末 2g 无菌水 28.4mL.定容至100ml) 筑基乙醇 5mL使用前按比例加人) D.1.3水饱和酚-氧仿(1+1) 将水饱和酚和氯仿等体积混合后,放置4C保存备用 D.1.420×SsC(pH7.0 17.53 氯化钠(NaCl g 8.82 柠檬酸钠 g 用1mol/儿盐酸(HCI)溶液调pH至7.0,加去离子水定容至100ml,高压灭菌待用 D.1.510%十二基磺酸钠(SDS 十二烧基磺酸钠 10g 用80mL去离子水溶解,加热到68C并用磁力搅拌器搅拌 如果需要,用1mol/L盐酸溶液调 pH至7.2 用去离子水定容至100mL 室温保存 无须蒸汽高压灭菌 D.1.6马来酸缓冲液pH7.5) 马来酸 1.16g 氯化钠(NaCI) 0.8775g 用80mL去离子水溶解,然后用NaOH颗粒调节pH至7.5,加去离子水定容至100mL,灭菌 待用 D.1.71%封闭液(现用现配) 封闭剂(一20C保存) 1g 用马来酸缓冲液定容至100mL 注:此处要求马来酸pH严格,否则不溶;封闭剂很难溶,要稍加热(50左右),并用磁力搅拌子搅拌溶化 D.1.8抗体溶液(现用现配 Anti-DG-AP(4C保存) 104L 加人到100ml封闭剂中混匀 D.1.9洗涤缓冲液(现用现配 马来酸缓冲液 00ml h20) 吐温20(Tween 0.3ml D.1.10检测缓冲液(p9.5 Tris碱 1.211g 氯化钠(NaCl 0.585g 加双蒸水定容至100mL,灭菌待用 D.1.11cCSPD稀释液 将CSPD用力摇匀后,每6滴一8滴csPD加人1mL检测缓冲液,混匀
GB/T36770一2018 D.1.12其他试剂 通用显影粉和酸性定影粉 D.2试验步骤 D.2.1RNA的提取 见B,3.1 注建议将阳性对照、阴性对照样品与待检测的样品一起进行RNA的提取 D,2.2样品处理 -24g(约4pb)提取RNA加人R反应管中,6温育15mim.冰浴5mim,瞬时高心 取1g 即得到变性后的RNA样品 D.2.3点膜 将变性后的RNA样品点于杂交膜上,同时将等量的阳性对照和阴性对照样品的RNA点于相应位 置处,并做好标记 注:任何时候都不能用手直接接触杂交膜,需要戴上一次性的PE手套注 D.2.4固定 将点好的膜正面朝上放于紫外交联仪中,能量1.2×10/cm',放置3min或将点好的膜放人烘 箱中,80C放置1h2h或120C放置30min. D.2.5预杂交 将固定好的膜放人杂交瓶中,并加人杂交液(12ml/100. nmL/10o cm”15 em*,至少要保证杂交 液完全覆盖杂交膜),68C预杂交1h3h 注;加人杂交液后,要将杂交膜和杂交瓶壁之间的气泡赶出 此外,加人杂交液后,在之后的任何操作过程中都要 避免杂交膜的干燥 D.2.6杂交 预杂交结束后,取标记的RNA探针(20ng/mL100ng/mL)加人到杂交液中,68C杂交6h以上 一般过夜). D.2.7洗膜 杂交结束后,弃杂交液,加人足量的2xSsc(一般不少于30mL),室温洗膜2次,每次5min在洗 涤的过程中配制0.1×SsC和0.1%SDS的混合液,并且将其预热到68C);加人足量的68C预热的 0.1xssC和o.I%sDs混合液(一股不少于30ml),8C洗股2次,每次15 在洗涤的过程中,配 mln 制1%的封闭液 注配制0.1xssC和0.1%sDs的混合液时,建议先加人灭菌水,再加人所需的ssC和sDs溶液 不要将ssC和 sDs溶液直接混合,避免出现不易溶解的沉淀 D.2.8封闭 洗膜后,弃掉瓶内的溶液,加人配制好的1%的封闭液12mL/100cm'~15mL/100cm'),室温 10
GB/36770一2018 30min 可延长至3h). D.2.9结合抗体 弃封闭液,加人抗体溶液12mL/100cm~15mL/100cm'),37C孵育30min. D.2.10洗涤 弃抗体溶液,加人足量的洗涤缓冲液(一般大于30mL)室温洗膜2次,每次15min,弃洗涤液 D.2.11平衡 nmL/100cnmi)室温平衡10nmin. 加人检测缓冲液(12mL/100em*15 注;D2.5~D2.11步骤中用到的各种液体可根据试验具体情况进行调整,但要确保膜能浸没于液体中且不漂浮 D.2.12感光处理 将杂交膜放人一边封好的杂交袋中杂交膜点样面朝上),在点样面上加人适量的化学发光地物 (CSPD)稀释液(1mL/100cm=),然后将杂交袋封闭,用手反复轻推数次使CSPD稀释液在膜上扩散均 勾 之后,将杂交全部袋的一个角剪开,将多余的CSPD稀释液全部挤出后,封闭杂交袋 D.2.13压片 在暗室中,膜正面向上放于暗盒,将比膜稍大的X光片平整地压于膜上,封好睹盒,必要时可用胶 带固定杂交袋 暗盒内曝光约l.5h D.2.14显影和定影 曝光后,在暗室内取出感光后的胶片放于显影液内显影4 min~5min打开绿光灯一尺距离观察 显影效果,当可以清楚地看到阳性对照或检测到的阳性显影清楚后,将胶片放人清水中冲洗30s,放人 定影液中定影10min,再用流水冲洗30s,拿出暗室 注:曝光和显影时间可根据试验具体情况进行调整,以达到最佳效果 D.3结果判断 阴性对照和空白对照未出现杂交斑,待测样品与阳性对照出现杂交斑,判定结果为阳性 阴性对照和空白对照未出现杂交斑,阳性对照出现杂交斑,且待测样品无杂交斑,判定结果为阴性