国家标准 GB/T33117一2016 小麦基腐病菌检疫鉴定方法 DeteetionandidentifieationofHelgardiaherpotriehoides 2016-10-13发布 2017-05-01实施国家质量监督检验检疫总局发布国家标准化管理委员会国家标准
GB/T33117一2016 小麦基腐病菌检疫鉴定方法范围本标准规定了小麦基腐病菌的检疫鉴定方法本标准适用于小麦属、黑麦属等禾本科寄主中小麦基腐病菌的检疫鉴定规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样 SN/T2589植物病原真菌检测规范小麦基腐病菌基本信息学名:Helgardiaherotrichoides(Fron) crous&w.Gams2003 异名:无性态CercosorellaherbotrichoideFron1912，Pseudocercosporellaherotrichoide (Fron)Deighton1973.,Ramulisoraherbotrichoides(FronArx1983;有性态Tapesiayallundae var.yallundae,Oulimaculayallundae(wallwork&.Spooner)Crous&.w.Gams2003. 传插途径;主要以病残体混于种子间进行远距离传播插小麦基腐病菌的其他信息参见附录A 方法原理病原菌的为害症状、分离培养性状,形态特征和特异性PCR检测结果等是该检疫鉴定方法的主要依据仪器设备和主要试剂 5.1仪器设备生物显微镜、电子天平(感量0.001g),离心机,普通冰箱,超低温冰箱(一80C),恒温水浴锅,涡旋振荡器、恒温光照培养箱、高压灭菌器、生物安全柜,PCR仪、电泳仪、凝胶分析成像系统,全自动DNA 提取仪 5.2主要试剂除另有规定外,所有试剂均为分析纯,实验用水应符合GB/T6682中相关规定表面活性剂吐温-20,琼脂、青霉素、链霉素,0.5%次氯酸钠NaCIO)
GB/T33117一2016 现场检疫按照SN/T2589,仔细检查寄主植物的茎、枝条、叶片等部位是否出现疑似症状(参见附录A) 对可疑植物病残体和土壤应取样送实验室做进一步检验,取样方法和步骤按照SN/T2122. 实验室检疫症状检查小麦基腐病菌主要引起鞘枯和叶枯,病斑多在地际到10cm之间的叶鞘和茎科上形成椭圆形或“眼纹”状病斑检查种子中有无附着病残体,土壤等 7.2PCR凝胶电泳初筛检测将7.1中的样品进行PCR初筛检测,PCR凝胶电泳检测见附录B 对于阳性结果进行下一步检测 7.3病原菌的分离培养 7.3.1培养基的制备马铃薯蔗糖培养基(PSA、,马铃薯葡萄糖培养基(PDA、玉米琼脂培养基(CMA)及选择性培养基的制备见附录C 7.3.2种子中病原菌的分离培养取待检的进境病原菌的寄主种子样品50g放人250mL洁净的三角瓶中,加蒸僧水100mL,再加表面活性剂吐温一201滴一2滴,用铝箔纸或培养纸将三角瓶封口,将三角瓶放在往复式振荡器上 150g振荡洗涤5min 立即取下三角瓶,将洗涤悬浮液用干净纱布过滤后注人10ml一20ml刻度离心管内,l000g离心3 n,取出离心管,倾去上清液,再加剩余洗涤悬浮液,混合离心,直至所有洗涤 min min,以悬浮液离心完毕,留沉淀物将沉淀物从离心管中全部移人2mL离心管中,12000g离心10 移液管移取上清去除水分,在常温下将沉淀风干对样品洗涤液中收集到的沉淀物在培养基上进行分离培养 7.3.3病残体中病原菌的分离培养 mm5mm 将变色的可疑材料,剪成约3 小段,用0.5%次氯酸钠表面消毒10min,再用灭菌水冲洗30min,置于玉米琼脂培养基(CMA)平板上(配方见附录C),13C15C,近紫外光照射培养,培养 7d14d开始观察菌落形态和菌丝形态特征 7.3.4土壤中病原菌的分离培养取2g土壤放人200mL灭菌水中,用磁力棒搅拌30min,使其充分混匀,悬浮液稀释10倍,取 ml土壤稀释液涂抹于选择性PDA平板上配方见附录C),每处理5~10个重复,15,全光照下培养,培养7d~14d开始观察菌落形态和菌丝形态特征 7.3.5分生抱子的诱导 7.3.2、7.3.3和7.3.4获得的菌丝,可通过以下方法获得分生弛子水琼脂培养基(wA)上2周龄菌
GB/T33117一2016 丝,9C,7d~10d产生初生抱子,由菌丝或抱子的水悬浮液置于PDA表面,18C21C,4d则产生大量分生抱子鉴定特征 8.1CR凝胶电泳初筛检测判定结果见附录B 8.2培养性状病原在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上培养,培养菌丝呈鹅绒状或细棉状培养初期的整体呈凸状菌落圆形,光滑,边缘平坦,中央有明显的气生菌丝,菌落表面灰绿色,背面暗色,22C生长迷率平均为 1.2tmm 在玉米琼脂培养基上,菌落呈墨绿色或粉红色或淡褐色在选择性培养基上,菌落呈茶褐色 8.3形态特征小麦基腐病菌有2种类型的菌丝体:一种为营养菌丝,黄褐色,线性,有分枝;一种暗色,厚壁,由膨大的多角形细胞构成,常在植株体表形成类似子座的菌丝团分生袍子梗无色,单生或罕有分枝,倒棒状,产抱细胞全壁芽生合轴式产袍,抱痕不肥厚,不发亮,呈截断状分生抱子无色,针状,直或略为弯曲分生抱子多数有3个7个隔膜,偶见超过10个,大小30Am~120m)×(1Am一3.5Am)(见附录D) 子囊盘直径0.2mm1.5nmm,无柄,密集聚生,着生于簇生的灰褐色钩状菌丝之上,呈圆形或叶状子囊托灰褐色,杯状,后变为小盘状,边缘反卷,在子囊盘未成熟时常被白色透明或浅褐色的绒毛， pm),内含8个子囊抱子,圆桶状纺锤形或棍棒状纷成熟时少见子囊(35wm一50wm)x(生am一了.4" 锤形.近顶点处渐缩呈短的杆状子囊袍子(7pm一lpm)x1.5xm一23pm)透明,细的圆幅状怖状,棍棒状纺锤形或纺锤形,末端浑圆,直或轻微的不规则,罕见弯曲油滴不明显,无隔膜或罕见1个 ,顶隔膜,子囊袍子在子囊内呈不规则的双行排列侧丝丝状,长度跟子囊相近,直径2.0m2.5 Am 端钝圆,透明,有隔膜结果判定以PCR初筛结果,病原菌培养性状,形态特征等作为鉴定依据,进行综合判定若PCR初筛为阳性，且与8.2,8.3鉴定特征吻合,鉴定为小麦基腐病菌 1 样品保存与处理样品经登记和经手人签字后妥善保存对检出小麦基腐病菌的样品应保存于4C冰箱中,以备复核该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理菌株保存与处理 11 从检测样品中分离并鉴定为小麦基腐病菌的菌株,应妥善保存将菌株接种于PsA培养基斜面上配方见附录C),存活后置于4C~8C黑暗条件下保存,定期(3个月)转接,以防止病菌死亡,至少保存6个月,必要时用病菌分生袍子作冻干菌种保存对不需要长期保存的菌株应及时高压灭菌处理
GB/T33117一2016 12 结果记录与资料保存完整的实验记录包括样品的来源,种类,时间,实验的时间,地点,方法和结果等,并要有实验人员和审核人员签字 PCR凝胶电泳检测应有电泳结果照片
GB/T33117一2016 附录A 资料性附录小麦基腐病菌其他信息 A.1名称中文名;小麦基腐病菌英文名:Eyespotofcereals FronCrous&.w 学名:Helgardiaherpotrichoides Gam、2003 曾用学名 Pseudwer/wrelaherprichoidle(Fron)Deighton 1973.,该学名分类地位;无性态属于半知菌亚门 (Deuteromycotina),丝袍菌纲(Hyphomyeetes),丝抱目(Hyphomycetales),淡色抱科(Moniliaceae e),假小尾抱属(Pe eeudrerosporella);有性态Tapesia.yaundaewallwork&.Spooner1988,属于子囊菌亚门A rellaceae scomycota),煤矣目(Capnodiales),球腔菌科(Mycosphaer e).Tapesia属 A.2寄主范围小麦属(Triicu),大麦(ordeunulgare)粮培二棱大麦(HordemdistichonL.、黑麦 (Salecereale),燕麦(Awemaxaia)以及山羊草属(Aesilops),冰草属(Agropyrom),剪股颖属 Agrowi),看麦娘属(Aopewas),雀麦属(Brwu)鸭茅属(Datsyi)翠雀属(De:/phniwm),偃友草(Elytrigiareens、羊茅属(Festuca)、落草(Koeleriacerisata)、黑麦草属L.olium、路边紫草 Lihosermmruderale),早熟不属(Poa),黑麦属(Seale),瓶刷草(sitniohytric). A.3症状描述小麦基腐病菌主要引起鞘枯和叶枯可危害基部叶鞘和茎秆(地际以上10em的叶鞘和茎秆),减低千粒重和减少穗粒数,也引起茎秆开裂、倒伏、白穗和分孽死亡开始近地面叶鞘上形成小的褐色病斑,而后逐渐扩大,圆形至长椭圆形或不规则,大的病斑长4em,轮廓不明显,边缘褐色至暗褐色,内部灰白色至淡绿色,病斑表面常有黑色子座病斑在叶鞘扩展的同时向内部扩散,当小麦开始拔节时,茎秆的近地面部位可发现同样病斑,最终环绕茎秆,产生真菌性暗色中心抽穗后期,小麦由病斑部位折断倒伏,严重时出现大面积倒伏,通常在病斑部的秆内侧中空处可见到集结成灰白或灰绿色棉絮状的菌丝体椭圆形或“眼纹”状病斑及抽穗后小麦在近地际处折断倒伏是本病最主要特征,具有诊断意义 A.4分布欧洲;奥地利、白俄罗斯、俄罗斯、比利时、波兰、丹麦,德国、法国,芬兰、荷兰、捷克,挪威、瑞典,瑞士、土耳其、西班牙,匈牙利、意大利英国、爱尔兰、保加利亚、拉脱维亚、立陶宛、罗马尼亚、乌克兰、希腊、塞尔维亚和黑山美洲:美国,加拿大非洲摩洛哥,南非,突尼斯亚洲:日本,马来西亚大洋洲:澳大利亚,新西兰
GB/T33117一2016 A.5生物学特性和传播方式本菌喜低温,0C即可产袍,5C15C为产抱适温,低于0C或高于20C都不产袍冬小麦秋苗期至春季都可发生侵染病原菌由胚芽鞘或植株近地面叶鞘直接穿透侵人或由气孔侵人饱和湿度下,6C15C时,在15min内即可侵人,4周后发病菌丝体也可直接侵染寄主病残体上产生的分生袍子和菌丝是主要的初侵染源,并可在其上存活数年病残体上的分生袍子主要靠风雨传播扩散到新枝,或通过嫩枝上菌丝生长向植株扩散此病可通过种子间混杂的病残体及土壤带菌传播
GB/T33117一2016 附录 B 规范性附录普通CR检测方法 B.1寄主植物DNA的提取将有疑似症状的样品或随机抽取的样品采用植物DNA提取试剂盒对样品进行DNA提取 B.2引物序列正向引物Tyl6F;5'-GCGCTGGAAAAAGAGGACTG-3 反向引物Tyl6R:5'-TGGAAGGG;TCTTGCAGGG-3' 扩增片段大小为1.05kb B.3CR反应体系及参数 B.3.1PCR反应体系 PCR反应体系见表B.1 表B.1CR反应体系试剂名称终浓度 10×PCR反应缓冲液 MgC 2.5mmol/1 dNTPs 0.2mmol/1 正向引物 0,2Mmol/1 反向引物 0.2umol/1 2.5U TDNA聚合除 DNA模板 0.5ng/aL 补H.(O至 50AL B.3.2阴性对照、阳性对照和空自对照的设置阴性对照;以待测健康的植株组织洗涤液中提取的DNA为模板 B.3.2.1 阳性对照;采用小友基腐病菌或含有待测基因序列的质粒 B.3.2.2 B.3.2.3空白对照;设两个;一是提取DNA时设置的提取空白对照(以H.O代替样品);二是PCR反应的空白对照(以水代替DNA模板 B.3.3PCR反应参数 94C/2min;94C/60s,60C/30s,72C/3min,35个循环;72C/4 min
GB/T33117一2016 B.3.4琼脂糖凝胶电泳检测制备1%的琼脂糖凝胶,按比例混匀电泳上样缓冲液和PCR扩增产物,用DNAMarker作为分子量标记,进行电泳分析,电泳结束后在凝胶成像仪的紫外透射光下观察是否扩增出预期的特异性DNA 条带,并拍摄记录 B.4结果判断阴性对照和空白对照在1.05kb处未出现扩增条带,待测样品与阳性对照在1.05kb处出现扩增条带,判定结果为阳性阴性对照和空自对照在1.05b处未出现扩增条带,阳性对照在1.0kb处出现扩增条带,且样品无特异性扩增,判定结果为阴性
GB/T33117一2016 附录c 规范性附录培养基的制备 C.1马铃薯蔗糖培养基(sA 马铃薯去皮后洗净,切成小块,称取200g,蒸憎水中煮30nmin,用4层纱布过滤,加人10只一20g" 蔗糖,17g一20g琼脂,加热使之完全溶解,蒸僧水定容至1000mL,121C高压灭菌15min 为抑制细菌生长,可在培养基中适当添加青霉素和链霉素 C.2马铃薯葡萄糖培养基(PDA)及选择性培养基马铃薯去皮后洗净,切成小块,称取200g,燕僧水中煮30min,用4层纱布过滤,加人10g~20g 葡萄糖、17g20g琼脂,加热使之完全溶解,蒸僧水定容至1000mL,121C高压灭菌15min. 在以上培养基中加人碗酸链霉素300mg/L..硫酸铜800mg/L 1000mg/L.,可作为选择性培养基用以分离土壤中的小麦基腐病菌 C.3玉米琼脂培养基(CMA 量取500mL蒸僧水,加热至70C,加人200g玉米,保持温度在60C左右约1h,用纱布过滤后加人适量的蒸僧水补足500ml 另取500mL蒸僧水,加人15.0g20.0g琼脂粉,加热使之慢慢融化,过滤后补足水至500ml 两液混合后分装,121C灭菌20min 或将60g玉米粉加人蒸僧水中,搅勾匀,文火煮沸1h,纱布过滤,加人15.0g一20.0g琼脂粉,加热使之慢慢融化补足水量至1000ml,分装,121C灭菌201 mln
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GB/T33117一2016 参考文献 [1巧 13yallwndae,newspeeies;theteleomorphofP seddo w.AlworkHandspoonerBM Tupesid Soc,1988,91:703-705 cercosporellaherpotrichoides.TransBrit Msycol IV.Ce" [2]DeightonFC.StudiesonCercosporaandalliec redlaSsace.Peeudocer dgenera. ercospor osporelagen nov.andPkeudocero-poridumgen novMyeologicalPapers,1973133:162 [3] CrousPw，Groenewald」乙andGamsw EyespotofcerealsrevisitedITsphylogeny re vealsnewspeciesrelationships Eur」PlantPath,2003，109:841-850. GacMetal.Comparativestudyofmorphological，culturalandmolecularmarkersforthe [4] characterizationofPseudlocercosorellaherotriehoidlesisolates，EurJPlantPath.，1996，102: 325-337 & AndradeOIdentificationofTaesiayalluundlaeWallwork Spooner，Teleomorphof [5] PseudocercosorellaherpotrichoidesFron.Deightonvar.herpotrichoides，theCausal lAgentofEye spotofWheatinSouthernChileAgriculturaTecnica，2005,65(3):306-311 Pseudocercosporellaher [6]Sopeklsw，FletcherBandLabunTJ.Firstreportofeyespot potrichoidesinwheatinthePrairieProvinces.CanadianPlantDiseaseSurvey，1990,70(2):119-121. [7]NicholsonP，RezanoorHN.ImpsonDRandJoyceD.Differentiationandquantifieationof PlantPathology,l997,40 thecerealeyespotfungiT.yallundaeandT.acuformnisusingaPCRassay 6):842-856. [8 WallworkH，SpoonerB.Tapesiayallundae-theteleomorphofPseuocercosborellaherp0 richoides.TransactionsoftheBritishMycologicalSociety,1988,91(4):703-705 [美]J.萨姆布鲁克等著,黄培堂等译.分子克隆实验指南(第三版).北京;科学出版社.2008. L9

小麦基腐病菌检疫鉴定方法GB/T33117-2016

小麦基腐病菌（学名：Gaeumannomyces graminis）是一种常见的植物病原菌，能够感染小麦、玉米、水稻等农作物，在全球范围内造成巨大的经济损失。因此，对该病原菌进行检疫工作显得尤为重要。GB/T33117-2016标准规范了小麦基腐病菌的检疫鉴定方法，下面我们来详细介绍一下。

样品采集与前处理

在进行小麦基腐病菌的检疫鉴定之前，首先需要采集样品。一般来说，可以选择小麦根、茎、叶等部位进行采样。采样时要注意保持样品的完整性和干燥状态，避免污染。

采集到的样品需要进行前处理。通常需要将样品表面的杂质去除，并在无菌条件下使用消毒液处理。如果样品含有过多的石灰或其他化学物质，还需要进行适当的缓冲和稀释等操作。

显微镜检查

经过前处理后，就可以开始显微镜检查了。主要是通过显微镜观察样品中是否存在小麦基腐病菌。正常情况下，可见小麦基腐病菌的产孢体、菌丝和分生孢子等结构，这些结构都是病原菌的重要标志。

PCR技术检测

如果显微镜检查结果不确定，还需要进行PCR技术检测。这种方法可以对样品中的基因进行扩增，并与参考标准比对以确认是否存在小麦基腐病菌。PCR技术具有高效、快速、灵敏等特点，能够提高检测准确性和效率。

总结

小麦基腐病菌是一种常见的植物病原菌，对农业生产造成了极大的威胁。GB/T33117-2016标准规范了小麦基腐病菌的检疫鉴定方法，其中包括了样品采集与前处理、显微镜检查和PCR技术检测等环节。这些方法能够提高检测准确性和效率，为保护农作物生产和维护生态平衡发挥着重要作用。