玉簪属植物X病毒检疫鉴定方法

玉簪属植物X病毒检疫鉴定方法

国家标准 GB/T35330一2017 玉簪属植物X病毒检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofHostavirsXx 2017-12-29发布 2018-07-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/35330一2017 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口 本标准起草单位:检验检疫科学研究院、国家质量监督检验检疫总局信息中心、中华人民共和 国厦门出人境检验检疫局、广东出人境检验检疫局、福建出人境检验检 疫局、农业大学 本标准主要起草人:张永江、张燕平、方志鹏、辛言言、魏梅生、冯黎霞、沈建国、李桂芬、李曼、 朱水芳
GB/35330一2017 玉簪属植物X病毒检疫鉴定方法 范围 本标准规定了玉簪属植物X病毒(Hosta irus 、X)的检疫鉴定方法 本标准适用于可能携带玉簪属植物X病毒的植物及其产品的检疫鉴定 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样方法 SN/T2964植物病毒检测规范 SN/T3457植物病毒分子生物学检测规范 玉簪属植物X病毒基本信息 学名:HostauirusX 缩写;HHvX 异名;玉簪属植物病毒x,玉簪属X病毒,玉簪X病毒,玉簪属(百合科)植物病毒 分类地位;曲线病毒科(Fleriviridae),马铃薯X病毒属(Poerirus) 玉簪属植物X病毒的其他信息参见附录A 方法原理 玉簪属植物X病毒的免疫原性和基因组特征是该病毒检疫鉴定的依据 根据HVX与抗体之间的 特异性反应,对植物样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAs-ELISA)和胶体金免疫试纸条检测 依据HVX的基因组特征建立RT-PCR,实时荧光RT-PCR和RT-LAMP检测方法;通过这些方法的 有效组合,判断样品是否带有HVX 5 仪器、用具及试剂 5.1仪器 电子天平(感量0.001g)、高速冷冻离心机,小型瞬时离心机、普通冰箱、超低温冰箱(一80C)、制 冰机、涡旋振荡器、磁力搅拌器、高压灭菌锅、pH计,超净工作台、PCR仪、微波炉、电泳仪、电泳槽、凝胶 成像分析仪、酶标仪 5.2用具 酶联板,可调移液器(2.5L,10ML、20AlL100AL,200AL、1000L)和可调移液器头,离心管,研
GB/T35330一2017 钵、,微型磨杵等 5.3试剂 除另有规定外,所有试剂均为分析纯,实验用水应符合GB/T6682中相关规定 DAS-ELISA试剂 见附录B;RT-PCR检测试剂见附录C;实时荧光RT-PCR检测试剂见附录D;RT-LAMP检测试剂见 附录E 抽样和样品制备 o 6.1抽样 有病毒危害症状的植物材料单独抽样,HHVX的危害症状描述参见附录A;无症状的种子、苗木及 其产品抽样方法按照SN/T2122中的规定执行 6.2样品制备 样品制备参照SN/T2964和SN/T3457规定执行 具体如下: 种子样品制样:每份抽样中随机采集5组样品,每组1进行后续检测 苗木及其切花等产品;有明显症状的,直接取症状部位1只单独制样,用于后续检测;无明显症 状的,可5株混合采样用于后续检测 检测鉴定 7.1双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELIsA) 把制备的样品上清液加人已包被HVX抗体的酶联板中,进行DAS-ELISA检测 每个样品平行 加到两个孔中 健康的植物组织作为阴性对照,感染HVX的植物组织作为阳性对照,样品提取缓冲液 作为空白对照;其中阴性对照的种类和材料(如种子或叶片)应尽量与检测样品相一致 具体操作见附录B 7.2胶体金免疫层析试纸条检测 胶体金免疫层析试纸条检测的对照设置同7.1,具体操作见附录F 7.3RT-PCR检测 RT-PCR检测的阴性和阳性对照设置同7.1,灭菌双蒸水作为空白对照 分别提取样品和对照的总 RNA,反转录合成cDNA后进行PCR检测,具体操作见附录C 7.4实时荧光RT-PCR检测 实时荧光RT-PCR检测的阴性和阳性对照设置同7.1,灭菌双蒸水作为空白对照 分别提取样品 和对照的总RNA,反转录合成cDNA后进行实时荧光PCR检测,具体操作见附录D 如采用商品化一 步法试剂盒,则按照试剂盒说明进行 7.5RT-LAMP检测 RT-LAMP检测的阴性和阳性对照设置同7.1,灭菌双蒸水作为空白对照 分别提取样品和对照的 总RNA,反转录合成cDNA后进行LAMP检测,具体操作见附录E 如采用商品化一步法试剂盒,则
GB/35330一2017 按照试剂盒说明进行 结果判定 样品检测时,首先采用DAs-ELISA或胶体金免疫层析试纸条方法进行初步筛检,检测流程及结果 判定按下述原则进行: -筛检结果为阳性时: 用RT-PCR进行验证,若验证结果为阳性,则判定样品携带HVX;若验证结果为阴性,再用实 时荧光RT-PCR或RT-LAMP进行验证,若验证结果为阳性,则判定样品携带HVX;若验证 结果为阴性,则判定样品不携带HVX 或用实时荧光RT-PCR进行验证,若验证结果为阳性,则判定样品携带HVX;若验证结果为 阴性,则判定样品不携带HvX. 或用RT-L.AMP进行验证,若验证结果为阳性,则判定样品携带HVX;若验证结果为阴性,再 用RT-PCR或实时荧光RT-PCR进行验证,若验证结果为阳性,则判定样品携带HVX;若验 证结果为阴性,则判定样品不携带HVX -筛检结果为阴性时 用RT-PCR进行验证,若验证结果为阴性,则判定样品不携带HVX;若验证结果为阳性,则对 产物进行测序,测定的序列为HVX序列,则判定样品携带HVX 或用实时荧光RT-PCR进行验证,若验证结果为阴性,则判定样品不携带HVX;若验证结果 为阳性,则判定样品携带HVX 或用RT-LAMP进行验证,验证结果为阴性,判定样品不携带HvX;验证结果为阳性.再用 RT-PCR或实时荧光RT-PCR进行验证,若验证结果为阳性,则判定样品携带HVX;若验证 结果为阴性,则判定样品不携带HVX 样品保存与结果记录 9.1样品保存 经检测确定携带HVX的样品应保存在适合的条件下,以备复核 如种子保存在干燥室温环境中; 种苗、叶片等样品保存在一80C冰箱中;做好登记和标记工作,保存期限至少1年 9.2结果记录 记录包括样品来源、种类、检测时间、地点、方法和结果、检测人员签字 DAs-ELISA检测应有酶 联反应数值;胶体金免疫层析试纸条检测应有试纸条检测图片;RT-PCR检测应有电泳图片和测序结 果;实时荧光RT-PCR检测应有荧光曲线图;RT-LAMP检测应有反应管颜色图片
GB/T35330一2017 附 录 A 资料性附录) 玉簪属植物X病毒相关资料 寄主范围 A.1 自然寄主主要为玉簪属(Hostaspp.)植物 A.2为害症状 受侵染的玉簪属植物叶片出现花叶,斑驳、耳突、坏死环斑、褪绿同心环,畸形和皱缩等严重症状 A.3分布地区 荷兰、法国、捷克、芬兰、波兰、意大利、美国、加拿大、新西兰、韩国、 传播方式 A.4 可通过种子、苗木以及园艺工具等途径传播 A.5粒体形态 病毒粒体线状,平均长度为530n nm A.6基因组 核酸为单分子线形正义ssRNA,全长约6.5kb 单分体基因组,RNA的3'端有一个PolyA)
GB/35330?2017 ? B 淶??) ???(DAs-ELISA B.1? B.1.1 ??X塣 B.1.2?? ???X B.1.3 (pNPP) B.1.41PBST?(pH7.4) 8.0 ?(NaCI 8 (KHP(O 0.2 g (Na2HP(O 1.15g ?(KCI 0.2 -20(Tween-20 0,5ml (NaN, 0.2g 900ml??,1000ml.,4C B.1.5???(pH7.4) (Na,SO l.3g 20.0 ??PVPMw2400040000) 0g 900mL1PHBST,1000mL,4C档 B.1.6?pHg.6 ?(Na.co,) 1.59g ?(NaHcO. 2.93g 900mL??,1000mL.4C档 B.1.7?????(pH7.4 2.0g ???(IBSA)
GB/T35330一2017 20.0g" 聚乙烯基毗咯烧酮(PVP，Mw2400040000) 溶于1000mL1×PBST缓冲液中,4C储存 B1.8底物缓冲液(pH9.8) 97mL 二乙醉胶 0.1 氯化镁(Mg(Cl g 溶于800ml灭菌双蒸水,用浓盐酸(HCI)调pH至9,8,定容至1000ml,4储存 B.2实验步骤 B.2.1包被抗体 按要求的浓度和需要的体积用包被缓冲液稀释包被抗体,每孔加100AL 酶联板加盖或用保鲜膜 包好,37丫孵育2h 清空孔中溶液,用1×PBST加满各孔,3nmin后倒掉孔中溶液,在吸水纸上拍干 再重复2次上述洗板过程 B.2.2样品制备与加样 待测样品按1:10(质量;体积)加人抽提缓冲液,在研钵中研磨;2000r/min离心10min,上清液 即为制备好的检测样品 阴性对照、阳性对照作相应处理或按说明书进行 按100AL/孔分别加人制 备好的检测样品、阴性对照和阳性对照;酶联板加盖或用保鲜膜包好,4C孵育过夜 酶联板用自来水 彻底冲洗,再用1×PBST洗涤3次,每次3min B.2.3加酶标抗体 用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度,并加人到酶联板中,100AL/孔,酶联板 加盖或用保鲜膜包好,37C孵育4h 酶联板用自来水彻底冲洗,再用1×PBST洗涤3次,每次3min B.2.4加底物 将底物pNPP加人到底物缓冲液中使终浓度为1mg/mL(现配现用),100AlL/孔加人到酶联板中 室温避光孵育 B.2.5读数 在不同的时间内如30min,60min,90min、120min或更长时间,用酶联仪在405nm处读OD值 B.3结果判定 B.3.1质量控制要求 对照孔的OD值(缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔)应在质量控制范围内,即;缓冲液孔和阴性 对照孔的OD值<0.15,当阴性对照孔的OD值<0.05时,按0.05计算;阳性对照OD值/阴性对 照OD值>5;同一样品的重复性基本一致
GB/35330一2017 B.3.2结果判定 在满足B3.1的质量控制要求后，结果原则上可判断如下:样品OD值/阴性对照OD值>2,判 为阳性;样品OD值/阴性对照OD值在2左右,判为可疑样品,需重新做一次,或用其他方法加以验 证;样品OD值/阴性对照OD值<2,判为阴性 若不满足B3.1的质量控制要求,则不能进行结果判断
GB/T35330一2017 C 附 录 规范性附录 RT-PCR检测 试剂 C.1 c.1.1核酸提取试剂 Trizol或合格的RNA提取试剂盒 C.1.2电泳缓冲液TAE(50x 三羚甲基氨基甲烧(Tris) 242g 冰乙酸(C,HO 57.1ml 乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA2H.O) 37.2g 灭菌双蒸水定容至1000ml,用时稀释至1×TAE 检测步骤 C.2.1核酸提取 称取0.1g样品加液氮研磨成粉木状,迅速将其移人灭菌的1.5mL离心管中,加人1mL的TH 试剂剧烈振荡3min;4C12000r/min离心10min;将上清液移人一新离心管中,加人0.5mL三氯 甲婉,猛烈振荡15s;4C12000r/min离心15min;小心吸取上层无色水相到新离心管中;加人等体积 异丙醇,混匀;室温静置10min;4C12000r/min离心10min,弃上清液;加人1mL75%的冷乙醇洗 涤沉淀;4C10000r/min离心10min,弃乙醇;沉淀于室温下充分干燥后溶于30AILDEPC-H.O中. -20保存备用 注:此处以0.lg样品为例进行核酸提取,实际检测时如样品量有变化,加人的试剂可按比例调整;或者按照商品化 RNA提取试剂盒进行操作 C.2.2引物序列 正向引物HVX-F1:5'-ATccGTTATCTACAGGGGACCAG3'" 反向引物HVX-R1:5'-TAAGTTAGTGGAACGGTTAGCCCGAT-3 扩增片段长度:l067bp. c.2.3反转录 反应体系;20AL;在0.2ml，PCR管中加人总RNA1L,dNTPs(10mmol/L)1L,DEPC-H.O 10L,反向引物HVX-R1(204nmol/L)2nL,70C保温5min;冰上放置5min;再加人5×反转录缓冲 液4AL，RNasin(40U/AL)1AL,M-MLV(200U/L)1AL,42C保温1h,得到cDNA后用作PCR 的模板 设置阳性对照、阴性对照及空白对照 C.2.4CR扩增 反应体系:20L;在0.2ml PCR管中加人10×PCR缓冲液含Mg+)2AL,dNTPs
GB/35330一2017 10mmol/L)06AL.,正向引物HXFl及反向引物HvXR(均为20wml/L)各0.5l.,Tu秘 (2U/pL)1AL,模板2L和DEPC-H.O13.4AL 设置阳性对照阴性对照及空白对照 ;94C30s,58笔30s.72c1 反应程序:94C5min; ,30个循环;72C8 1min min 注:如采用商品化一步法RT-PCR检测试剂盒,可按照说明书进行操作,将步骤C.2.3和C.2.4合并进行 c.2.5CR产物琼脂糖凝胶电泳 制备1%的琼脂糖凝胶,按比例混匀电泳上样缓冲液和PCR扩增产物,用DNAMarker作为分子 量标记,进行电泳 电泳结束后在凝胶成像仪中观察是否扩增出预期的特异性DNA条带,并拍摄 记录 C.3结果判定 阳性对照在1067bp左右处有条带,阴性对照和空白对照无特异性条带,待测样品出现与阳性对 照一致的条带,可判定为阳性 阳性对照在1067bp左右处有条带,阴性对照、空白对照及待测样品无特异性条带,可判定结果为 阴性
GB/T35330一2017 附 录 D 规范性附录) 实时荧光Rr-PCR检测 试剂 D.1 核酸提取试剂同C.1.1 TaqManOne-stepRT-PCRMhixture D.2引物探针 上游引物HVX-F2;5'-CGATGGGCTACAAAGAAAACACG-3 下游引物HVX-R2:5'-CTcCTCCTCTGTTGGTTGTCTGAT-3 探针HVX-Probe:5'-FAM-CTTcCGACTCCATcCTCAATcCCGC-TAMRA-3' D.3核酸提取 方法同C.2.1 D.4实时荧光RT-PCR反应 反应体系:0.2mL离心管中加人2×One-stepRT-PCR缓冲液皿10L,E.rTaqHs(5U/L 04AL,PimesScrptRTEmymeMi、I0.4L.HvXF2(10me nol/L)0.4AL,HHVX-R2(10mol/L 0.4AL,HVXProbe(10mol/L)0.6AL,ROXReferenceDyeI0.4AL,模板RNA2AL,补DEPC H.0至20"lL 设置阳性对照、阴性对照及空白对照 反应程序;42C10min;95C10s;95C15s,62C1min,共45个循环 D.5结果判定 在空白对照及阴性对照无G'值且无扩增曲线.阳性对照G'值二30并出现典型扩增曲线的条 件下 待测样品的ct值>40时,判定Hvx阴性 待测样品的c'值<35时,判定HVX阳性 待测样品的ct值小于40而大于35时,应重新进行测试;如果重新测试的Ct值>40,判定 HVx阴性;如果重新测试的C值小于40而大于35,且分离曲线明显时,则判定结果为阳性 10
GB/35330一2017 附 录 规范性附录) RT-LAMIP检测 E.1试剂 核酸提取试剂同c,1.1 LoopampOne-stepMixture E.2引物 引物相关信息见表E.1 表E.1引物相关信息 引物类别 引物名称 在NC_011544.1上的位置 引物序列 ACTCCCTGAGTGTGGCTAGAGACCAG HVX-FIP5 6060-6081/6o15-6032 GCACAAcGGTCAAC 内引物 AGGTAcTTcGcccccATcATcTcTTT HVX-BIP5 6087-6108/6151-6168 GTAGCCCATCGCCG HVX-F3-5 ACCcTcATcccAGGAcTC 5994-601m 外引物 HVX-B3-5 AAAGCCGCGTACTTcGTG 6173-6190 HVX-IF-5 TGccGcGAGGGAGGTGTA 6033-6050 环引物 HVX-LB5 GCGATCGAGCACAAGATTcC 6117-6136 E.3核酸提取 方法同C.2.1 E.4RT-LAMP反应 反应体系25!L;2×反应缓冲液12.5AL,酶溶液1.0L,HVX-FIP-5和HVX-BIP5(浓度均为 0pmol/aL)各1AL,HVX-F3-5和HVX-B3-5(浓度均为10pmol/aL)各0.5AL,HVX-LF-5和HvX LB-5(浓度均为20pmol/aL)各1AL,钙黄绿素荧光染料1.0AL,RNA2.0AL,DEPC-H.O3.5AL 反应程序为63C;反应时间为30nmin E.5结果判定 在空白对照和阴性对照反应管液体为橙色,阳性对照反应管液体呈绿色的条件下 11
GB/T35330一2017 -待检样品反应管液体呈橙色,判定HVX阴性 -待检样品反应管液体呈绿色,判定HVX阳性 若与上述条件不符,则本次检测结果无效,应更换试剂按本方法重新检测 12
GB/35330一2017 附录 规范性附录 胶体金免疫层析试纸条检测 F.1试剂 样品抽提缓冲液配制方法见B.1.5 F.2试纸条保存 试纸条应在2C一8冰箱内密封干燥保存 F.3检测步骤 F.3.1样品制备 测试样品按1:10质量:体积)加样品抽提缓冲液，经研磨后,2000r/min离心取上清液(未离心 的样品中存在大颗粒物质,影响液流上行,容易导致检测效果不佳),每一样品取约250AL至1.5mL的 离心管中,以能走完试纸条为宜 F3.2样品检测 检测前将试纸条恢复至室温 将试纸条含胶体金复合物的一端垂直插人到样品液中,样品液高度不要超过胶体金试纸条上的 MAX线 测试观察的时间以10 min~20min为好 对于病毒浓度低的样品时间可适当延长 F.4结果判定 F.4.1质控C线显红色,测试T线显红色,检测结果为阳性 质控C线显红色,测试T线未显色,检测结果为阴性 F.4.2 F.4.3质控C线和测试T线均未显色,说明试纸条失效,检测结果无效 F.5试纸条是否有效的判断方法 用阳性对照进行测试,测试丁线显红色,质控C线显红色,说明整个系统工作正常 F.5.1 用阳性对照进行测试,测试丁线显红色,质控C线未显色,说明羊抗兔抗体失效 F.5.2 F.5.3用阳性对照进行测试,测试T线未显色,质控C线显红色,说明测试T线的特异性抗体失效 F.5.4用阳性对照进行测试,若测试T线未显色,质控C线也未显色,说明整个测试纸条失效 13
GB/T35330一2017 考文献 参 [1KolickovaA，adfrankoval.HolkovaLFirstreportoHotaviruXinfetingHostainthe CzechRepublie.NewDiseaseReports,201l,24:9. MIY，LeeJS.CharacterizationandseedtransmissionofHosta [[2]yuKH，ParkMH，L.ee 722 virusXisolatedfromHostaplants ActaHorticulturae,2006, 91-93. [3 ParkMH，RyuKH.MoleceularevidencesupportingtheclassifieationofhostavirusXasa Potexvirus，ArchVirol,2003,148:2039-2045. distinetspecies ofthegenls WindhamMT，MoultonJK，etal.Geneticvariability [4们FajoluOL，wenRH，windham ArchVirol,2009,154:;1909-1916. phylogenetieanalysisofhostavirus and CurrierS，IockhartBEL.CharacterizationofaPotexvirus PlantDis [[5 lnfeetingHosta spPp. ease,1996,80;1040-1043. [6 DelaTorreCM.Molecularcharacterization，differentialmovementandconstructionofin fectiouscDNAclonesofanOhioisolateofHostavirusX.Ohio，USA:OhioStateUniv PhD versity， hesis,2009. CajzaM，ZielinskaL.HostavirusX-AnewpathogenofornamentalplantsinPoland.Pro- gressinPlantProteetion,2007,47:69-72. LebasBSM，WardII.PresenceofHostavirusXinNewZealand Aus [8]TangJ，Hardy tralasianPlantDis Notes,2012,7;39-40. [9 WeiMS，Zhang GF，MaJ，IiM.FirstReportofHostavirusXInfectingHosta PlantsinChina.PlantDisease， 429. [10]LockhartBEL.DifferentialresponseofhostacultivarstoinfectionbyhostavirusXpotex virus-abasisforpracticaldiseasemanagement.ActaHorticulturae,2002，568:69-72. [11]FajoluoL，wenRH，windhamAs，windhamMT，HajimoradMR.Developmentofan RTcR/RFLPasyodetetHotavirusximhosta(Hota=pp).jJormalfHortiealturalstience 这 Biotechnology,201l,86(1):50-54. 14

玉簪属植物X病毒检疫鉴定方法GB/T35330-2017解析

首先，GB/T35330-2017标准明确了玉簪属植物X病毒检疫鉴定的目的、范围和术语定义等基本原则。

其次，该标准规定了X病毒的检测方法，包括留样、制备试样、提取RNA、RT-PCR扩增、聚合酶链式反应产物检测等步骤。特别地，在RT-PCR扩增过程中，还规定了RT-PCR反应体系的配制、RT-PCR程序和结果判定等关键环节。

此外，GB/T35330-2017标准还详细说明了X病毒检疫鉴定方法的质量控制要求，包括阳性对照、阴性对照、生物学重复和技术重复等方面。这些控制措施可以有效避免假阳性或假阴性结果的发生。

最后，该标准还列出了检疫鉴定报告所需包含的信息内容。其中，包括样品来源、检测项目、方法名称、检测结果和结论等方面。这些信息能够为玉簪属植物X病毒检疫工作提供重要参考。

玉簪属植物X病毒检疫鉴定方法的相关资料

和玉簪属植物X病毒检疫鉴定方法类似的标准

GB/T35330-2017

玉簪属植物X病毒检疫鉴定方法

2022/8/24 3:04:51 现行