海湾扇贝

海湾扇贝

国家标准 GB/T21443一2008 海湾 扇 贝 Bayscalop 2008-02-15发布 2008-05-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管蹬委员会国家标准
GB/T21443一2008 前 言 本标准的附录A、附录B,附录C为规范性附录 本标准由农业部提出 本标准由全国水产标准化技术委员会海水养殖分技术委员会归口 本标准起草单位:科学院海洋研究所 本标准主要起草人:刘保忠、张国范、董波、阙华勇、尤锋、张晓军
GB/T21443一2008 海湾扇 贝 范围 本标准给出了海湾扇贝(ArgopectenirradiansLamar arck)主要形态构造特征、生长与繁殖习性、遗 传学特征以及检测方法 本标准适用于海湾扇贝的种质监测和鉴定 名称与分类 2.1学名 海湾扇贝ArgopeelenirrdiansL.amarck 2.2分类位置 软体动物门(Molusca),瓣钯纲(L.amelibranchia),珍珠贝目(Pterioida)，扇贝科(Peetinmidae),海 湾扇贝属(Argp" ec'te7 主要生物学性状 3.1外部形态特征 3.1.1外形 贝壳扇形,两壳几乎相等,右壳稍高后耳大于前耳 前耳下方生有足丝孔,成体无足丝,绞合部相 连且平直,胁较宽而高起,肋上无棘 生长纹较明显 壳面有放射胁17条一18条,壳面呈黑褐色、褐 色、黄色或灰白色 成贝壳高6cm左右 海湾扇贝的外部形态见图1 图1海湾扇贝外部形态 3.1.2可数性状 壳面有放射肋17条18条 3.1.3可量性状 mm68.70mm， 对于壳长49.40 体重16.43g~36.52g的55个成体进行数量性状的测量,统计 数据见表1
GB/T21443一2008 表1海湾扇贝数量性状统计值 性状 壳长L/mm 壳宽" 壳高 /mm H/mm 体重w7/g 55,93 23,67 53.82 25.37 平均值 标准差 士4.41 士2.07 士3.86 土5.23 3.1.4体重、壳长生长关系式 海湾扇贝在自然条件下体长与体重关系见式(1) w=0.0032×1高1 式中: w海湾扇贝体长L时的体重,单位为克(g); -海湾扇贝体重W时的壳长,单位为毫米(m mm 3.2内部构造特征 3.2.1外套膜 简单型外套膜,具外套眼和外套触手 3.2.2生殖系统 雕雄同体,精巢位于腹鳍外周缘,卵巢位于精巢内侧 生长与繁殖特征 4.1生长 在适宜生长条件下,8个月平均壳长可达5cm,寿命12个月16个月 繁殖习性 -年有春秋两次繁殖期 黄劲海区春季繁殖期在5月下旬至G月,秋季为9月至10月 海湾扇贝繁殖力强，一只壳长5cm以上的成贝一次产卵量为50×10粒一60×10'粒，一个产卵 期产卵量150×10'粒200×10'粒 细胞遗传学特征 体细胞染色体2倍数:2n=32,核型表达式:2n=2sm+12st+18t,NF=34 即亚中部着丝粒染色体(sm组1对,亚端部着丝粒染色体(st组)6对,端部着丝粒染色体(t组 9对,染色体臂数(NF)34,见图2 sm AaA AAAa》!Aan 图2海湾扇贝染色体核型 6 生化遗传学特征 肌肉中苹果酸脱氢酶(MDH)同工酶为单态,酶谱见图3
GB/T21443一2008 图3苹果酸脱氢酶(NMIDH)酶谱 分子遗传学特征 16SrDNA序列(547bp):5'’一3’ CGCCTGTTTATCAAAAACATGGCTcCCCTTGAATAACCATAAGGAGTcGGT GCCTTCCCGGTGAGTTTAAACTTAAACGGATGC(GGTAAAGCGTGCTAAGG TAGCTTAAGTTATGGCCTAGTTAATTGTAGGcccCTGTGAATGGTTTGAcG AGTTTTCTTCTGTCTcTAGCTTGTTTAAGTGAACTTGAGTTGGATGTGCA TGGTAAAGAAAGAcGAGAAGACcccGTGAGGTTAGAAATT ATAGTGGGAG cTGccTTATAGTTTTGGcTG GGGCAGCAAGGGGGCAAAAGTAGAcccCcT！ AAAATTTAATTCTGGTG.AGT AATGAccCATAAGGTTTAAGGGTATGATTAGTAGAAGAAGTTAcTccGGG GATAACAGCGTAATccGccCTTGACAGTccTTATAGATGGGTGGGTTTGcG ACcTcCGATGTTGGcTcTGGATGTcCTGAAGcTGTAGGCGGTTTCAAGGGT TGGTTcGTTcGccCATTAAAATcCAAcGTGATcTGAGTTcAGAccGG 检测方法 染色体和核型检测 8.1.1染色体标本的制备 nmin40min; a 剪取活体扇贝钯组织,置于0.04%秋水仙素溶液中处理15" min50min: b)从秋水仙素溶液中取出后,置于25%低渗海水中处理40" 从低渗海水中取出后,置于Carnoy's固定液中固定4次,每次15min; 固定完毕后,置于0C4C冰箱中过夜; 从冰箱中取出,在距玻片20cm30cm处滴下,玻片温度56C60C; 0%Giemsa染液染色10min~20min(Giemsa染液配制见附录A); g流水冲洗显微镜下观察 8.1.2染色体计数 在显微镜下观察,计数100个以上清晰、分散良好的中期分裂相,测定染色体数目,统计得出二倍体 染色体条数 8.1.3核型分析 选取7套一10套染色体分裂相进行拍照,放大,测量染色体及其长臂、短臂的长度,计算其相对长 度、臂比、臂指数,着丝粒指数 根据二倍体染色体相对长度、臂比、着丝粒指数,参照Levan的分类标 准,得出二倍体的染色体核型公式 同工酶分析 8.2.1样品制备 样本活体,解剖取其闭壳肌0.lg0.2g,加2倍体积的Tis-HC缓冲液(0.01mol/L,pH=7.0),并
GB/T21443一2008 加适量处理过的石英砂冰上匀浆,然后在4C,12000r/min离心20nmin,取上清液分装后用于电泳 8.2.2电泳方法 采用淀粉凝胶TC缓冲系统Tris-柠檬酸,pH=6.9进行电泳分析 凝胶浓度为13%质量分数). 胶制好后,样品加在靠阴极一侧,用滤纸蘸样品液插人孔中 电泳在4C冰箱内进行,电压120V,电流 22mA/板(TC). 电泳结束后进行染色,染色液配方见附录B 8.3DNA特征标记分析 8.3.1DNA的提取 取闭壳肌300mg剪碎后,放人600AL裂解液,55C水浴消化至组织碎块完全裂解 裂解液分别用 等体积的饱和酚、酚;三氯甲炕(1;1)、三氯甲烧;异戊醉(2A;1)抽提,加人2倍体积的无水乙醉和终 浓度10%的乙酸钠离心沉淀DNA,最后用70%的乙醇洗2次后晾干 裂解液配方见附录C 8.3.2片段克隆和纯化 以提取的DNA为模板,利用两个特异性引物进行PCR扩增 8.3.2.1引物序列 f:5'-CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3’r;5'-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT3” 8.3.2.2反应条件 94C变性2min,1个循环;94C变性30s,55C退火1min,72C延伸1min,35个循环;72C延伸 10min,1个循环 反应液配方见附录c 8.3.3序列测定 用基因自动分析仪测序,反应程序按照所使用的测序试剂盒说明书给出的规程操作,最后读出 16srDNA的序列
GB/T21443一2008 附 录A 规范性附录 吉姆萨(Giemsa)染色液配制 A.1Giemmsa染色母液的配制 称取0.5gGiemsa粉,量取甘油33mL.,在研钵中先用少量甘油与Giermsa粉混合,研磨至无颗粒 时再将剩余甘油加人,在56C条件下保温2h后,再加33mL甲醉,混匀,保存于棕色瓶内 A.2磷酸缓冲液(0.2mol/L,pH7.2)的配制 磷酸缓冲液由A液和B液按比例混合而成 A液(0.2mol/L,NaHPO.)配制 取36.61只含1个结晶水的磷酸氢二钠(NaHPOH.,O)定容于1000m燕僧水中,或取 71.64g含2个结晶水的磷酸氢二钠(NaHPO2H.O)定容于1000mL蒸馏水中,即可 B液(0.2mol/L,NaH.PO)配制 取27.6g含1个结晶水的磷酸二氢钠(NaH,PO H,O)定容于1000ml燕僧水中,或取31.21g 含2个结晶水的磷酸二氢钠(NaH,PO2H.O)定容于1000mL燕榴水中即可 取A液720ml.,加上B液28.0ml,混合即成所需的磷酸缓冲液 A.3Giemsa工作染色液的配制 取l00n磷酸缓冲液,加人3mLGiemsa aa染色母液即可 B 录 规范性附录) 同工酶染液配方 苹果酸脱氢酶(MDH);DL-苹果酸钠,392mg;0.1mol/LTris-HCl缓冲液(pHH值8.0),2mL; 1 15mol/LMgC十0.05nmol/LNaCI,0.4mL;MTT(嚓幽盐),4mg;PMs(N-甲基盼嗦甲基硫酸 盐),2.5mg;辅酶I,5mg
GB/T21443一2008 c 附 录 规范性附录 DNA提取裂解液和PCR扩增反应液组成 C.1NA提取裂解液 HB(10mmol/LTris-HCl.pH8.0;100mmol/1EDTA) 540L SDs(十二婉基磺酸钠)(10% 60l 蛋白酶K 1004g C.2扩增CR反应液 200 DNA模板 50ng~ ng 10倍扩增缓冲液 2.5A山 MgCl.(25mmol/L) 0 2. dNTP(10mmol/L) 0.5AL 引物f(50pmol/L 5 L 心 引物r(50pmol/L) 0. 5 AL Taq酶(5U/L 0.2l 加超纯水配制成25L的反应体系