国家标准 GB/T40455一2021 蓝莓休克病毒检疫鉴定方法 DetectionandlidentificationorBlueberry sh0ckirs 2021-08-20发布 2022-03-01实施国家市场监督管理总局发布国家标涯花警理委员会国家标准
GB/40455一2021 前言本文件按照GB/T1.1一2020<标准化工作导则第1部分;标准化文件的结构和起草规则》的规定起草请注意本文件的某些内容可能涉及专利本文件的发布机构不承担识别专利的责任本文件由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口本文件起草单位;福州海关、福建省农业科学院果树研究所、检验检疫科学研究院、福建农林大学、厦门海关本文件主要起草人:沈建国、谢丽雪、张永江、蔡伟、陈细红、李韬、高芳銮、李敏、廖富荣
GB/40455一2021 蓝莓休克病毒检疫鉴定方法范围本文件规定了蓝莓休克病毒Blueberryshockcirus as)的检疫鉴定方法本文件适用于可能携带蓝莓休克病毒的蓝莓检疫鉴定规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样方法术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义蓝莓休克病毒分类信息中文名;蓝莓休克病毒学名;B/ueberryshockvirws,缩写BIShV 分类地位;雀麦花叶病毒科(Bromoviridae),等轴不稳环斑病毒属(larvirus). 蓝莓休克病毒的寄主范围、病害症状,分布地区、传播途径、粒体形态、基因组等其他信息参见附录A 5 方法原理蓝莓休克病毒的血清学、分子生物学特性是制定本检疫鉴定方法的主要依据根据BShV与抗体之间的特异性反应,对样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAs-ELIsA,免疫层析试纸条检测;根据BShV基因组特征进行巢式RT-PCR,免疫捕获巢式RT-PCR,实时荧光RT-PCR检测;通过这些方法的有效组合,判断样品是否携带BIshV 仪器、用具及试剂 6.1仪器高速冷冻离心机、高压灭菌锅电子天平(感量0.001g)、酶标仪,PCR仪,实时荧光PCR仪、水平电泳系统、常规冰箱、超低温冰箱、凝胶成像分析系统、pH计、恒温水浴锅等 6.2用具研钵、酶联板,离心管、PCR反应管,各种量程的可调移液器(2.5L,10AL,20AlL,100ML,200L
GB/T40455一2021 1 000AL)和可调移液器枪头等 6.3试剂除另有规定外,所有试剂均为分析纯,实验用水应符合GB/T6682中相关规定 DAsEILISA检测试剂应符合附录B的要求;免疫层析试纸条检测试剂应符合附录c的要求;巢式RT-PCR检测试剂应符合附录D的要求;免疫捕获巢式RT-PCR检测试剂应符合附录E的要求;实时荧光RT-PCR检测试剂应符合附录F的要求抽样和样品制备 7.1抽样尽量抽取有病毒危害症状的植物材料,BIShV的危害症状描述参见附录A;抽样方法按照 SN/T2122中规定执行 7.2样品制备称取0.5g一1.0g待测样品按1:10(w/V)加人抽提缓冲液研磨,4C下8000从离心10min,上清即为样品提取液,用于DAs-ELISA、免疫层析试纸条、巢式RT-P(CR、免疫捕获巢式RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测检测鉴定 8 8.1DAS-EL.ISA检测以含BISh材料作为阳性对照,以不含BIShV的健康植物组织(其种类和材料应尽量与检测样品 -致)作为阴性对照,同时以样品抽提缓冲液作为空白对照,具体检测方法见附录B 8.2免疫层析试纸条检测免疫层析试纸条检测的对照设置同8.1,具体检测方法见附录c 8.3巢式RT-CR检测巢式RT-PCR检测的阳性对照、阴性对照设置同8.1,同时以ddH,O代替模板作为空白对照,具体检测方法见附录D 如采用商品化一步法试剂盒,则cDNA合成和第1轮PCR按照试剂盒说明进行 8.4免疫捕获巢式RT-CR检测免疫捕获巢式RT-PCR检测的对照设置同8.1,具体检测方法见附录E 如采用商品化一步法试剂盒,则cDNA合成和第1轮PCR按照试剂盒说明进行 8.5实时荧光RT-PCR检测实时荧光RT-PCR检测的阳性对照、阴性对照设置同8.1,同时以ddH.,o代替模板作为空白对照具体检测方法见附录F 如采用商品化一步法试剂盒,则按照试剂盒说明进行 8.6序列测定与比对 PCR产物纯化后,直接测序或者克隆测序,利用NCB网站上的BLAST软件把测序所得到的核苷酸序列与已知BIShV序列进行比对
GB/40455一2021 结果判定样品检测时,检测结果判定按下述原则进行样品血清学检测(DAS-ELISA或免疫层析试纸条)初筛结果为阳性,且任一种分子生物学方法(巢式RT-PCR,免疫捕获巢式RT-PCR或实时荧光RT-PCR)检测结果为阳性,则判定为检出BHShV 一样品巢式RT-PCR或免疫捕获巢式RT-PCR检测结果为阳性,且序列测定结果经比对分析为 BIShV,则判定为检出BIShV 一样品巢式RT-PCR或免疫捕获巢式RT-PCR检测结果为阳性,且实时荧光RT-PCR检测结果为阳性,则判定为检出BIShV 10样品保存与结果记录 10.1样品保存经检测确定检出BIshV的样品应保存在适合的条件下以备复核活的种苗在隔离温室或光照培养箱中培养,组织、叶片等样品保存在一80C冰箱中,做好登记和标记工作,保存期限至少1年 10.2结果记录记录包括样品来源、种类、检测时间、地点、方法和结果、检测人员签字 DAS-ELISA检测应有反应原始数值;免疫层析试纸条应有试纸条检测图片;巢式RT-PCR和免疫捕获巢式RT-PCR检测应有电泳图片;实时荧光RT-PCR检测应有实时荧光结果图片;序列测定应有测序报告
GB/T40455一2021 附录 A 资料性) 蓝莓休克病毒相关资料寄主范围 A.1 已报道的自然寄主为越橘属的蓝莓(Vacciniumspp.). A.2病害症状典型症状是花和叶片在开花期时突然完全坏死,导致不结果据统计,该病毒侵染蓝莓造成的损失可达34%90% BIShV几乎可侵染所有的蓝莓品种,并表现相似的症状(见图A.1) 图A.1BIShV侵染蓝莓后引起的症状 (引自https;//neipmc.bugwoodeloud.org/projgects/pestalertsl/blueberryshockvirus-bromoviridaeharvirus) A.3分布地区主要分布于美国、加拿大等国家 A.4传播途径主要通过蜜蜂携带感染的花粉传播 A.5粒体形态病毒粒体呈等轴对称球状,直径约27" nm A.6病毒基因组正义单链RNA
GB/40455?2021 ?B 淶) ???(DAS-ELIsA B.1? B.1.1 ????塣 B.1.2?? ?????塣 B.1.3 (pNPp. B.1.41PBST?(pl7.4) 8.0 ?(NaCI g 0.2 (KHPO g 1.15g (NaeHPO ?(KCI 0.2g ween-20 0.5 -20(Tw nL 900ml??,1000mL,4C档 B.1.5??(pH7.4 (Na,SO 1.3g ??(PVP,Mw24000-40000) 20.0g 900ml1PBST,1PBST1000mL,4C档 B.1.6?(pH9.6 ?(Na,CO 1.59g ?(NaHcO.) 2.93g 900ml??,1000ml,4C档 B.1.7?????pH7.4 2.08 ???(BSA ??(PvP,Mw24000-40000 20.0g 900ml.1PBST,1PBST1000ml4C档 B.1.8??plH9.8 ? 97.0ml 0.1 ??(MgCl g
GB/T40455一202 溶于800ml灭菌双燕水中,用浓盐酸(HC)调pH至9.8,定容至1000mL,4C储存 B.2程序 B.2.1包被抗体用包被缓冲液将抗体按说明稀释,加人到酶联板的孔中,100L/孔,加盖,37笔孵育2h或4冰箱孵育过夜,倒去酶联板孔中溶液,按每孔100L.的量用PBST洗涤46次,每次1 min B.2.2加样加人制备好的检测样品、阴性对照,阳性对照和空白对照,并且至少一个重复,l00L/孔加盖 37笔孵育2h或4C冰箱孵育过夜,倒去酶联板孔中溶液,按每孔100L的量用PBST洗涤46次每次1 min B.2.3加酶标抗体用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度,并加人到酶联板的孔中,l00AL/孔,加盖,37孵育2h,倒去酶联板孔中溶液,按每孔100L的量用PBST洗涤4~6次,每次1 mln B.2.4加底物将底物pNPP加人到底物缓冲液中使终浓度为1mg/ml(现配现用),按100l/孔,加人到酶联板的孔中,室温避光孵育 B.2.5读数在不同的时间如30min,60min,90min、120nmin或更长时间,用酶标仪在405nm处读OD值 B.3结果判定 B.3.1质量控制要求满足阴性对照孔的OD值<0.15、阳性对照孔的OD值/阴性对照孔的OD值>5;同一样品的重复性基本一致,数值差别<0.05 B.3.2结果判定在满足B.3.1的质量控制要求下,若样品oD值/阴性对照oD值>2,判定为阳性;样品OD 值/阴性对照oD值在阔值附近,判定为可疑样品,需重新做一次,或用其他方法加以验证;样品oD 值/阴性对照OD值一2,判定为阴性注若不满足B.3.1的质量控制要求,则不能进行结果判定
GB/40455一2021 录附 C 规范性) 免疫层析试纸条检测方法 c.1试剂样品抽提缓冲液配制方法见B,1.5 C.2试纸条保存试纸条应密封干燥保存于2C8C冰箱内 C.3检测步骤 c3.1样品准备待测样品按6.2步骤制备,取300L样品提取液至1.5m的离心管中 c.3.2样品检测检测前先将试纸条恢复至室温将试纸条T线一端垂直插人到样品液中,样品液高度不要超过试纸条上的MAX线测试观察的时间以51 min~10min为宜对于病毒浓度低的样品,测试观察的时间可适当延长 C.4结果判定质控C线显红色,测试T线显红色,则判定为阳性; -质控C线显红色，测试T线未显色,则判定为阴性 -质控C线和测试T线均未显色,说明试纸条失效,检测结果无效 C.5试纸条是否有效的判断方法用阳性对照进行测试,测试T线显红色,质控C线显红色,说明整个系统工作正常; 用阳性对照进行测试,测试丁线显红色,质控C线未显色,说明羊抗兔失效; 用阳性对照进行测试,测试T线未显色,质控C线显红色说明测试T线的特异性抗体失效用阳性对照进行测试,测试T线未显色,质控C线也未显色,说明整个测试纸条失效
GB/T40455一2021 附录 D 规范性) 巢式RI-PCR检测方法 D.1试剂 D.11IrizoL试剂 D.1.25×TBE缓冲液 Tris碱 54.0g 27.5 碉酸(H.BO g 20.0mL 0.5mol/儿 EDTApH8.0) 补充蒸僧水至1000mL 用时加蒸僧水稀释至0.5×TBE. D.1.36×加样缓冲液 0.25%溴酚蓝 40%W/V)蔗糖水溶液 D.1.4引物序列根据GenBank已报道的BISh基因序列,设计2对用于特异性扩增的巢式引物,引物序列见表D.1 表D.1引物序列引物名称引物序列目的片段/bp 5'-CGAGTAATCATGGTTTGCAAG3 外侧正向引物BShV-F 746 外侧反向引物BShV-R 5'-GACCGGTATCGAACCTTCAC-3 5GTcGTcAGTGTAAGAAGT ;C3 内侧正向引物BHshV-1 486 5'-(C(GTACTcCAAATc(G;GATG(G3" 内侧反向引物BIShV-2 D.2巢式RT-PCR检测 D.2.1总RNA提取取样品提取液200L放人1.5mL离心管中,再加人1mLTrizoL试剂,剧烈振荡摇匀3 min; 4C,12000g离心10min,取上清;加人氧仿300AL剧烈振荡15s,室温静置5min,4,12000g离心15min,取上层水相;加人等体积的异丙醇,颠倒混匀后室温下静置15min,4 C,12000离心 10min,弃上清;加人ml75%的乙醇洗涤沉淀2次,每次4`C,7500！离心3min,弃上清;RNA沉淀干燥后,用20L一40L经DEPc(焦碳酸二乙酯)处理过的ddH.O溶解，一80C保存备用注:总RNA的提取也可以采用等效的其他提取方法或商品化试剂盒 D.2.2eDNA合成在PCR管中加人3AL.总RNA、lpL外侧反向引物BISshV-R(10mol/L)、7AL.ddH.O,70水
GB/40455一2021 浴10min,迅速冰浴5min,再加人下列试剂;5×RT缓冲液5L,dNTPs(10mmol/L)2MlLM-MLV RT200U/AL)1AL,RNasin(40U/AL)1L 42C水浴60 1,70C水浴10min,自然冷却至室温 min -20C保存备用 D.2.3第1轮PCR扩增第1轮PCR反应体系见表D.2,每个反应设置2个重复 min;94C30s,51C45s,72C1min. PCR反应条件:94C5n ,35个循环,最后一个循环结束后 72C延伸10 min 表D.2PCR反应体系名称加样量/p儿 eDNA 3.0 外侧正向引物BShV-F(10mol/L) 1.0 外侧反向引物BIShV-R(104mol/ 1.0 2×TaqPCRmix 12.5 dadH.O 7.5 总体积 25.0 D.2.4第2轮CR扩增取第1轮PCR产物0.5作为模板,进行第2轮PCR扩增 PCR反应体系为:内侧正向引物 BHShV-1(10Mmol/L)1AL、内侧反向引物BHShV-2(10Mmol/L)1AL、2×TaPCRmix12.5ML、 3min;94"C30s,52C45s,72C1 ddH.,O10AL PCR反应条件;94C3 !min,共30个循环,最后一轮循环结束后72C延伸10min. D.2.5琼脂糖凝胶电泳制备1.5%的琼脂糖凝胶,对PCR产物进行电泳,电压3V/em5V/enm,缓冲液0.5×TBE 电泳结束后,在溴化乙锭(EB,质量浓度为0.54g/mL)溶液染色10min后,再在凝胶成像分析系统中观察是否扩增出预期的特异性DNA电泳带,拍照并做记录注:也可以采用其他核酸染料替代EB D.3结果判定如果阴性对照和空白对照无特异性扩增,待测样品第1轮PCR扩增出与阳性对照一致的目的片段 (746bp)或第2轮PCR扩增出与阳性对照一致的目的片段(486bp),则判定为阳性如果阳性对照、阴性对照和空白对照正常,待测样品第1轮CR,第2轮PCR均未扩增出与阳性对照一致的目的片段(746bp、486bp),则判定为阴性
GB/T40455一2021 录附规范性) 免疫捕获巢式RT-CR检测方法 E.1试剂 E.1.1BshV抗体;见B.1.1 E.1.2抽提缓冲液(pH7.4);见B1.5 E.1.3包被缓冲液(pH9.6);见B.1.6 E.1.4引物序列:见D.1.4 E.2免疫捕获巢式RT-PCR检测 E.2.1免疫捕获将BShV抗体用包被缓冲液按说明稀释,取100AL 加人PCR管中,37C孵育2h;倒去PCR管中溶液,用PBST洗涤3次;待测样品按6.2步骤制备,取100ML样品提取液加人PCR管中,4C包被过夜或37C孵育2h E.2.2eDNA合成倒去PCR管中溶液,先后用PBST洗涤3次,DEPC-H,O洗涤2次,短暂离心后吸去管底余液,在 PCR管中进行反转录先向PCR管中加人外侧反向引物BIShV-R(104mol/L)1LddH.O10L， 70C水浴10min后立即冰浴5min,再加人下列试剂5×RT缓冲液5AL,dNTPs(10mmol/L)2L、 M-MLVRT(200U/L)1MlLRNasin(40U/AL)1AL 42C水浴60min,70C水浴10min E.2.3第1轮CR扩增见D.2.3 E.2.4第2轮PCR扩增见D.2.4 E.2.5琼脂糖凝胶电泳见D.2.5 E.3结果判定如果阴性对照和空白对照无特异性扩增,待测样品第1轮PCR扩增出与阳性对照一致的目的片段 746bp)或第2轮PCR扩增出与阳性对照一致的目的片段(486bp),则判定为阳性如果阳性对照,阴性对照和空白对照正常,待测样品第1轮RCR,第2轮CR均未扩增出与阳性对 -致的目的片段7146lp.48Gtp),则判定为朋性照一 10
GB/40455一2021 附录！规范性实时荧光Rr-CR检测方法 F.1试剂核酸提取试剂;见D.1.1 F.1.1 F.1.2TaqManPCRmix F.1.3引物及探针序列根据已报道的BISshV外壳蛋白(CP)和依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp)基因序列设计特异性引物及探针,引物和探针序列见表F.1 表F.1引物和探针序列引物/探针名称序列 BIShV-n 5'-CRTCCGATTTGGAGTACGATAAGTT-3 BshV- r 5'-TcGGGTAGTcAGAcTTAAATTcGA3" BIShV-P1 5'-(FAMTCcGAAGAATAcGAATTA(GTA(MGB)-3 BIShV-2 5'-TGccTCTAGCGAGTTTTTGCA-3" BIShV-r2 5'-cCACAAGGTccGTCAcCTAATRTGT-3' BIShV-P2 5'-(FAM)ATGTGGTTTGGTTCTCAC(MGB)-3" 注:R=A/G F.2实时荧光RT-PCR检测 F.2.1总RNA提取见D.2.1. F.2.2eDNA合成在CR管中加人3L总RNA、1AL随机引物(100mol/L)、7LdH,O,70C水浴10min,迅速冰浴5nmin,再加人下列试剂:5×RT缓冲液5L、dlNTPs(10mmol/L)2Al,M-MIVRT(200U/L)1AL RNasin(40U/L)1L 42C水浴60min,70C水浴10min F.2.3实时荧光PCR反应反应体系:在荧光定量PCR管中加人eDNA2L、BShV-n(10mol/L1L、BShV-rl a10molL)1LIBshV-PI(10mol/L)1ALBIshV-2(I0pmol/L)1L、BIsihV-r2(104mol/L) lL、,BIShV-P2(104mol/L)1L,2×TaoManP(CRmix12.5L,ddH,o4.5uL 每个反应设置2个重复反应程序:952min;95C15s.60C1min,共40个循环 F3结果判定如果阳性对照Ct值<35,且出现典型的扩增曲线,阴性对照和空白对照的Ct值>40,且无扩增 11
GB/T40455一2021 曲线: 待测样品Ct值<35时,且出现典型的扩增曲线,则判定为阳性待测样品Ct值之>40时,且无扩增曲线,则判定为阴性待测样品Ct值介于35和40之间时,应重新提取样品RNA进行测试,若重新测试的Ct值>40,且无扩增曲线,则判定为阴性;否则判定为阳性 12
GB/40455一2021 参考文献 Adkar-PurushothamaCR,MaheshwarPK,SanoT,JanardhanaGR，Asensitiveand [1] reliableRT-nestedPCR assayfordetectionofCitrustristezavirusfromnaturallyinfectedcitrus CurrentMicrobiology,201l,62(5):1455-1459 plants. MacDonaldSG,MartinRR,BristowPR.Characterizationofanilarvirusassociatedwitha 1991,81(2):210-214. necroticshockreactioninlueberry Phytopatholo logy， Pscheidt W,Harper ProgressionofsymptomsonblueberryinfectedwithBlueberry shockvirus PlantHealthProgress,2014 78-79. [4]SchilderA.Blueberryshockvirus,PestAlertFactsheet，MichiganStateUniversityExten sion,EastIansing,MI,USA,2009 SedeguM.,OstetbauerNK.Evaluationofahueh-ThrougehputprotocolordetetingBue- [5 berryshockvirusinVacciniumusingELISA.PlantHealthProgress,2009. [[6]SpakJ,PribylovaJ,KubellkovaD,PetrikK,SpakovaV Detectionofvirusesandphytoplas- mainVacciniumsp.intheCzechRepublicActaHorticulturae,2012,926:631-635. 宋震,周常勇,刘科宏,等柑橘碎叶病毒巢式RT-PCR检测方法建立及应用果树学报， 201l,28(3):458-462. [[8]谢丽雪,郑姗,张立杰,等蓝莓休克病毒IC-RT-nestedPCR检测技术农业科学,2016， 4922 4366-4374. 13

蓝莓休克病毒检疫鉴定方法GB/T40455-2021

蓝莓休克病毒是一种常见的病毒病害，能够导致蓝莓生长发育不良、萎缩、死亡等严重后果。为了保障蓝莓产业的健康发展，我国制定并发布了《蓝莓休克病毒检疫鉴定方法GB/T40455-2021》标准。

该标准主要针对蓝莓中的休克病毒进行检测，采用RT-PCR技术实现，具有高效、快速、准确的特点。下面我们来详细了解一下这个方法的具体步骤：

1. 样品的采集和处理

首先需要从蓝莓叶片、茎、果实等部位采集样品，并进行初步处理，包括去除杂质、切碎、磨成细粉等。

2. RNA提取

将样品加入试剂盒中，经过高速离心、洗涤等步骤，最终得到纯化的RNA。

3. RT-PCR扩增

将RNA转录为cDNA，再进行PCR扩增，最终通过电泳等方法检测扩增产物是否符合休克病毒的特异性。

4. 结果分析

根据扩增产物的大小和电泳图谱，可以确定样品中是否存在休克病毒。同时，还可以通过阳性对照、阴性对照等手段进一步验证结果的准确性。

总的来说，该标准规定了严格的操作程序和技术要求，能够有效防控蓝莓休克病毒的传播和侵害，保障蓝莓产业的健康发展。