工业微生物菌株生长表型测定微液滴浊度法

工业微生物菌株生长表型测定微液滴浊度法

国家标准 GB/T38568一2020 工业微生物菌株生长表型测定 微液滴浊度法 Determinationfgrowthpheotypeforindstrialmierobialstrain- Microdropletturbidity 2020-03-31发布 2020-03-31实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标涯花管理委员会国家标准
GB/38568一2020 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由标准化研究院提出并归口 本标准起草单位:科学院青岛生物能源与过程研究所、标准化研究院 本标准主要起草人:马波、葛安乐、王喜先、籍月彤、徐健、马爱进
GB/T38568一2020 工业微生物菌株生长表型测定 微液滴浊度法 范围 本标准规定了用微液滴浊度法测定工业微生物菌株生长表型的方法 本标准适用于工业发酵用细菌、真菌和微藻菌株生长表型测定 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 凡是不注日期的引用文件,其最新版木(包括所有的修改单)适用手本文件 件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14926.43实验动物细菌学检测染色法、培养基和试剂 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 参考菌株refereneestrainm 发酵性能明确,用于发酵生产的经过鉴定的保存菌株 原理 通过微流控芯片产生单细胞包裹液滴.并培养,根据液滴中的菌体面积,进行生长速率的计算 试剂或材料 5 除非另有规定,所用试剂均为分析纯 5.1 水 符合GB/T6682规定的二级水 5.2基础培养基 按GB/T14926.43给出的方法配制 或选用商品化的预制培养基,严格按照商品说明书加水 配制 5.3PBS缓冲液,pH7.4 称取磷酸二氢钾(KH,PO)0.27g、磷酸氢二钠(NaegHPO1.42g、氯化钠(NaCI)8g、氧化钾 KCl)0.2g,将上述各成分加去离子水约800ml充分搅拌溶解,然后加人浓盐酸调pH至7.4,最后定
GB/T38568一2020 容到1L 5.4超低融点琼脂糖 凝胶点为8C~17C 5.5氟碳油 含有表面活性剂 6 仪器设备 6.1恒温箱:士1C 6.2离心机:500片4000A 6.3倒置显微镜:带成像模块 6.4聚四氟乙烯导管:内径0.5mm. 6.5PDMS微流控芯片;高度为100m,后面连接有至少50个培养腔室结构,每个腔室尺寸为1.5mm ×1mm 油相两侧线性结构相同，每一侧长为29.2nmm,宽度为40Am;水相的线性结构长为 4.54mm,宽度为60m 6.6分光光度计 6.7热板 测定步骤 7.1菌株活化 7.1.1按GB/T14926.43给出的方法配制工业微生物相应的固体平板和液体培养基,用无菌接种环分 别蘸取参考菌株和待评价菌株保种菌液,在固体平板上划线,根据生产工艺参数选择相应的温度和 DH值,进行培养,直至长出单菌落;分别挑取3个参考菌株和3个待评价菌株单菌落,接种至含有5ml 液体培养基的试管中,根据生产工艺参数选择相应的温度和转迷,培养至对数期 从活化的平板培养皿挑取微生物菌株单克隆于5m液体培养基的容器中,根据生产工艺参数 7.1.2 选择相应的温度和转速,培养至稳定期,去除上清后加人PBS溶液,重复清洗3次 7.2微生物菌液浓度选取 用基础培养基稀释得到细胞悬液浓度约为6×10CFU/mL 7.3琼脂糖溶液制备 用分析天平称取0.02其超低熔点琼脂糖置于无菌EP管中,并向其中加人1ml已灭菌的基础培养 基,加热溶解,配制成2%(质量浓度)的溶液 趁热用0.224m的无菌滤头过滤,现用现配 7.4单细胞液滴发生 各取500L微生物菌液和琼脂糖溶液等体积混匀 7.4.1 7.4.2取一块芯片,分别在芯片的油相人口加人200L氟碳油和水相人口加人100Al低熔点琼脂糖 菌液,将注射器与芯片出口相连 7.43将芯片放在热板上(温度稳定性士1C,范围在30C37),将注射器的活塞固定在2ml.刻
GB/T38568一2020 度处,通过注射器内的负压使液体进人芯片,开始发生液滴 液滴发生需要2min左右 7.4.4取另一块芯片重复上述步骤,一为待鉴定菌株,另一为参考菌株 此步骤重复三次 7.5单细胞液滴培养 液滴发生结束后,移除芯片上的枪头和聚四氟乙烯管,将两芯片放人4C冰箱凝固20min后再置 人盛有水的培养皿中于37恒温箱进行培养6h 7.6芯片成像 将芯片置于倒置显微镜,在10×物镜下进行成像,获取至少20个图片,不少于2000个液滴,并保 存为bmp格式 7.7数据处理 用软件进行图片处理,统计每张图片内液滴的个数以及每个液滴的直径,并计算图片中菌斑的平面 面积 结果分析 8.1结果计算 菌斑面积相对差值按式(1)计算 >偿- -是 d= 式中: 菌斑面积相对差值; -图像中单个液滴内细菌的面积; R 单个液滴的直径; 凝胶液滴的个数 8.2结果分析 根据幽斑面积相对差值评价待选撇株与参考菌株相似性度 d值绝对值越小代表与标准信号代表 的凝胶液滴浊度越接近 以值为负,表明生长速率低于参考菌株,值为正,表明生长迷率高于参考菌 株 在重复性条件下获得的三次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%

工业微生物菌株生长表型测定微液滴浊度法GB/T38568-2020

随着现代生物技术的快速发展，越来越多的研究者开始关注微生物菌株的生长表型特征及其对环境因素的响应。而微生物菌株生长表型测定是评价微生物生长表现的基础性实验之一。GB/T38568-2020作为新版的国家标准，详细介绍了一种新的工业微生物菌株生长表型测定方法——微液滴浊度法。

与传统的微生物菌株生长曲线绘制、生长速率计算等方法相比，微液滴浊度法具有更高的实验效率和更准确的结果。在该方法中，研究者只需将微生物菌株接种在含有不同营养成分的培养基上，并通过质量均匀、无气泡的微液滴进行测定。由于微液滴内部的环境与大型培养罐相似，因此可以更好地模拟生产过程中微生物的生长情况。

微液滴浊度法实验步骤简便，主要包括微液滴制备、培养及浊度测定三个步骤。其中最重要的是微液滴制备环节，应注意保证微液滴的质量均匀性和数量稳定性，避免因操作失误导致实验结果不准确。

总之，微液滴浊度法作为新型的微生物菌株生长表型测定方法，其优势越来越受到工业微生物学界的关注和认可。未来随着该技术的不断完善和推广，将有望成为工业微生物学领域中不可或缺的研究手段。

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